D-阿洛酮糖的功能特性及其生物合成研究進(jìn)展

(廊坊梅花生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司,河北 廊坊 065001)

D-阿洛酮糖(D-psicose/D-allulose)是一種稀有糖,自Itoh等[1]首次報(bào)道以來(lái)已有近30年歷史。D-阿洛酮糖具有蔗糖70%的甜度,可與食物中的氨基酸或蛋白質(zhì)發(fā)生美拉德反應(yīng),改善食物色澤,且其提供熱量較少,僅相當(dāng)于同等質(zhì)量蔗糖的0.3%[2],不會(huì)給人體帶來(lái)額外的消化負(fù)擔(dān),對(duì)人體不構(gòu)成健康威脅。2011年8月,美國(guó)食品與藥物管理局(FDA)確定D-阿洛酮糖為普遍公認(rèn)安全食品(Generally regarded as safe,GRAS),可作為食品或食品添加劑的組成成分[3]。

D-阿洛酮糖已陸續(xù)在日本、韓國(guó)、美國(guó)和澳大利亞等國(guó)家批準(zhǔn)上市,其市場(chǎng)規(guī)模在不斷增加。目前,我國(guó)與歐盟正在受理D-阿洛酮糖作為新食品原料的申請(qǐng),預(yù)計(jì)可在2024年前獲批。隨著獲批國(guó)家的增多,D-阿洛酮糖的市場(chǎng)規(guī)模也將保持快速增長(zhǎng),在未來(lái)有望替代食品工業(yè)中常規(guī)糖分所占據(jù)的廣闊市場(chǎng),在提高人們營(yíng)養(yǎng)健康水平方面發(fā)揮積極作用。

1 D-阿洛酮糖特性

1.1 D-阿洛酮糖簡(jiǎn)介

D-阿洛酮糖是一種稀有糖,分子式為C6H12O6,分子量為180.16,它是D-果糖的C-3位差向異構(gòu)體,D-果糖的分子結(jié)構(gòu)式為

D-阿洛酮糖純品為白色粉末狀晶體,極易溶于水，可溶于甲醇和乙醇,不溶于丙酮,自然界中D-阿洛酮糖分布極少,可見(jiàn)于少部分植物和少數(shù)細(xì)菌中。此外,D-阿洛酮糖也出現(xiàn)在各種人工制作食品中,如水果干、果醬和糖制品等,這些食品一般都有高糖的特點(diǎn),D-阿洛酮糖在各類食品中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)與生產(chǎn)過(guò)程中的溫度和加熱時(shí)間密切相關(guān)[4]。D-阿洛酮糖的分子結(jié)構(gòu)式為

1.2 阿洛酮糖功能特性

1) 高甜度與低能量

雖然D-阿洛酮糖可同等程度地滿足消費(fèi)者對(duì)甜味的味覺(jué)需求,但是其僅提供相當(dāng)于同等質(zhì)量蔗糖0.3%的熱量,可作為食品中蔗糖最理想的替代品。對(duì)大鼠連續(xù)喂食D-果糖、蔗糖與D-阿洛酮糖20 d后,喂食阿洛酮糖的大鼠體重增加量最小,能量計(jì)算結(jié)果顯示D-阿洛酮糖提供的有效能量幾乎為0,意味著D-阿洛酮糖產(chǎn)生的能量最低[2]。

2) 抑制血糖升高

多項(xiàng)研究證明D-阿洛酮糖具有降血糖的功效。分別以蔗糖、麥芽糖和可溶性淀粉喂食大鼠,同時(shí)喂食少量D-阿洛酮糖或果糖,結(jié)果發(fā)現(xiàn)D-阿洛酮糖能夠顯著抑制由蔗糖和麥芽糖引起的血糖升高,對(duì)于可溶性淀粉引起的血糖升高作用并不明顯。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)D-阿洛酮糖能抑制腸道蔗糖酶和麥芽糖酶活性,降低腸道對(duì)這兩種糖類的吸收,達(dá)到抑制血糖升高的效果[5]。單獨(dú)服用D-阿洛酮糖(7.5 g)也不會(huì)引起血液中血糖與胰島素水平的變化[6]。D-阿洛酮糖還可抑制餐后血糖水平的升高,可作為臨界型糖尿病患者的輔助治療劑,在連續(xù)攝入D-阿洛酮糖12周后沒(méi)有觀察到任何副作用或不良反應(yīng)[7]。

3) 降低脂肪積累

肥胖與高熱量和高糖分食物的攝入息息相關(guān),D-阿洛酮糖甜味劑不僅幾乎不提供任何熱量,而且能降低小腸對(duì)蔗糖、麥芽糖等糖類的吸收速率以及生物體內(nèi)脂肪合成酶的活性,提高脂肪氧化酶表達(dá)水平,通過(guò)抑制脂肪合成速率和提高脂肪分解速率而有效控制體重,治療肥胖[7-8]。

4) 安 全 性

作為一種主要應(yīng)用于食品領(lǐng)域的甜味劑,D-阿洛酮糖的安全性至關(guān)重要。為了驗(yàn)證D-阿洛酮糖的安全性,有研究者對(duì)大鼠進(jìn)行了長(zhǎng)達(dá)18個(gè)月的D-阿洛酮糖口服毒性研究,長(zhǎng)期給予大鼠D-阿洛酮糖飲食后,除大鼠肝臟和腎臟的相對(duì)重量有所增加外,未觀察到其他異常情況,隨后肝臟和腎臟組織的病理學(xué)觀察結(jié)果顯示這兩種器官未出現(xiàn)因攝入D-阿洛酮糖而產(chǎn)生的異常[9]。

2 D-阿洛酮糖的制備

自然界中天然存在的D-阿洛酮糖極少,部分植物與細(xì)菌中含有少量的D-阿洛酮糖。目前,D-阿洛酮糖的大規(guī)模獲取主要來(lái)自于人工合成,主要有化學(xué)合成與生物合成兩種方式,化學(xué)合成法存在產(chǎn)量低、副產(chǎn)物多和產(chǎn)物分離困難等問(wèn)題,生物合成法則更為環(huán)保,副產(chǎn)物少,更利于后續(xù)產(chǎn)物的分離純化。根據(jù)生物合成D-阿洛酮糖所需要原材料的不同,其生物合成途徑有:1)D-果糖通過(guò)異構(gòu)化反應(yīng)生成D-阿洛酮糖;2) 以葡萄糖為原料,先由葡萄糖異構(gòu)酶或木糖異構(gòu)酶獲得D-果糖,再由DTE或DPE催化D-果糖獲得D-阿洛酮糖;3) 由阿洛醇通過(guò)氧化還原反應(yīng)得到D-阿洛酮糖。

2.1 D-果糖異構(gòu)化生產(chǎn)D-阿洛酮糖

2.1.1 異構(gòu)化酶的篩選及來(lái)源

通過(guò)生物酶催化將D-果糖異構(gòu)化為D-阿洛酮糖是目前大部分生物法生產(chǎn)D-阿洛酮糖的基礎(chǔ),D-果糖異構(gòu)化生產(chǎn)D-阿洛酮糖的途徑如圖1所示。這些生物酶主要有D-塔格糖3-差向異構(gòu)酶(D-tagatose 3-epimerase,DTE)和D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶(D-psicose 3-epimerase,DPE)。D-塔格糖3-差向異構(gòu)酶由Izumori等[10]首次發(fā)現(xiàn),因其最適底物為塔格糖,故命名為D-塔格糖3-差向異構(gòu)酶。2006年韓國(guó)Kim等[11]成功克隆表達(dá)了根瘤農(nóng)桿菌的DTE,該DTE可催化所有己酮糖在C-3位置的差向異構(gòu)反應(yīng),且對(duì)D-阿洛酮糖的底物特異性最高,其次是D-果糖和D-塔格糖。因此,該酶是一種新的差向異構(gòu)酶,被更名為D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶。

圖1 果糖異構(gòu)化生產(chǎn)D-阿洛酮糖

雖然DTE與DPE可催化相似的反應(yīng),即單糖C-3位置的差向異構(gòu)反應(yīng),但是由于它們的來(lái)源不同,因此彼此之間的氨基酸序列同源性差異很大,氨基酸相似度一般在23.9%～94.2%[12]。目前已有3種DTE酶家族成員的晶體結(jié)構(gòu)被成功解析,分別是AgrobacteriumtumefaciensDPE[13],PseudomonascichoriiDTE[14]和ClostridiumcellulolyticumDPE[15],這3種DTE酶家族成員的晶體結(jié)構(gòu)表明DTE具有同源二聚體的酶分子結(jié)構(gòu),而其他兩種DPE是同源四聚體的酶分子結(jié)構(gòu)。天然狀態(tài)下，DTE與DPE更適宜中性或弱堿性環(huán)境,它們的最適催化溫度分布范圍廣泛,一般為40～75 ℃;此外,與DTE相比,DPE多具有金屬離子依賴性,最適金屬離子為Mn2+和Co2+,這些金屬離子在提高酶的活性與熱穩(wěn)定性方面具有重要作用[16]。隨著已發(fā)現(xiàn)的DTE與DPE越來(lái)越多,它們組成了一個(gè)新家族—DTE酶家族[17]。迄今為止，研究者們已先后在瘤胃球菌(Ruminococcussp.)[18]、梭狀芽孢桿菌(Clostridiumcellulolyticum)[19]和類球紅細(xì)菌(RhodobactersphaeroidesSK011)[20]等菌株中發(fā)現(xiàn)新的DTE酶家族成員。國(guó)內(nèi)關(guān)于D-阿洛酮糖的研究起步較晚,江南大學(xué)率先發(fā)現(xiàn)一種可產(chǎn)DTE的類球紅細(xì)菌,轉(zhuǎn)化率最高達(dá)6.54%[21],這也是國(guó)內(nèi)首次報(bào)道發(fā)現(xiàn)具有生物轉(zhuǎn)化D-果糖生成D-阿洛酮糖功能的菌株。隨后,天津工業(yè)生物技術(shù)研究所Zhu等[18]在瘤胃球菌中也發(fā)現(xiàn)了D-塔格糖3-差向異構(gòu)酶,目前已發(fā)現(xiàn)的DTE酶家族成員如表1所示,表1中轉(zhuǎn)化率均為最適條件下數(shù)據(jù)。

表1 不同微生物來(lái)源的DTE和DPE及其性質(zhì)

雖然天然菌種產(chǎn)生的DTE可用于D-阿洛酮糖的生產(chǎn),但是已報(bào)道的天然DTE多為胞內(nèi)酶,不僅需要分離純化后才能使用,而且產(chǎn)量較低,催化效率以及酶穩(wěn)定性都有待提高。相較于化學(xué)法,該方法產(chǎn)生的DTE用于D-阿洛酮糖的生產(chǎn)雖然可以提高D-阿洛酮糖的生產(chǎn)效率,但是也會(huì)帶來(lái)非常高的生產(chǎn)成本,并且在D-阿洛酮糖生產(chǎn)初期添加的是游離酶,這使得DTE難以重復(fù)利用且在與產(chǎn)物的分離過(guò)程中增加額外的成本。

2.1.2 固定化酶催化技術(shù)生產(chǎn)D-阿洛酮糖

隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展,研究者對(duì)天然DTE進(jìn)行了分子改造,如將DTE改為胞外分泌、更換DTE的生產(chǎn)宿主等[34-36]。對(duì)根瘤農(nóng)桿菌的DPE基因進(jìn)行隨機(jī)和定點(diǎn)突變,獲得高熱穩(wěn)定性的DPE,延長(zhǎng)DPE在高溫下(≥50 ℃)的半衰期,有利于果糖異構(gòu)化反應(yīng)正向進(jìn)行,提高D-阿洛酮糖轉(zhuǎn)化率[35]。與游離酶相比,固定化酶可重復(fù)使用并利于產(chǎn)品分離,可以有效降低生產(chǎn)成本,延長(zhǎng)酶的使用周期。Itoh等[1]首次對(duì)DTE進(jìn)行固定化操作,以殼聚糖為固定化載體,在pH 7.5,45 ℃條件下反應(yīng)10 d后阿洛酮糖轉(zhuǎn)化率為18%。Lim等[37]以離子交換樹(shù)脂為載體固定DPE,在pH 8.5,50 ℃條件下,最終D-阿洛酮糖轉(zhuǎn)化率為29%。此外,為提高酶分子固定化的牢固程度,在酶分子多肽鏈的一端引入帶電荷的氨基酸側(cè)鏈,增加電荷數(shù)量并用離子交換樹(shù)脂進(jìn)行吸附固定,該方法對(duì)酶進(jìn)行固定化且不涉及酶的分離純化,直接使用粗酶液即可,降低了生產(chǎn)成本[38]。

2.1.3 全細(xì)胞催化生產(chǎn)D-阿洛酮糖

全細(xì)胞催化技術(shù)的興起再一次改變D-阿洛酮糖的生產(chǎn)方式,利用工程菌表達(dá)DTE并分泌到胞外,可以將D-果糖原料與菌液混合以進(jìn)行D-阿洛酮糖的生產(chǎn)。相比酶催化方法,利用全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化方法生產(chǎn)稀有糖頗受歡迎,因?yàn)樗梢员苊饷傅奶崛∨c分離純化,既可以省去繁瑣的操作步驟,又可以降低生產(chǎn)成本。Park等[39]將根癌農(nóng)桿菌(A.tumefaciens)的DPE基因異源表達(dá)于大腸桿菌中,重組大腸桿菌細(xì)胞24 h的DPE表達(dá)量為8.6%,表明該酶具有較高表達(dá)量,在pH 8.5,60 ℃條件下重組細(xì)胞可在40 min內(nèi)轉(zhuǎn)化700 g/L的D-果糖產(chǎn)生230 g/L的D-阿洛酮糖,轉(zhuǎn)化率為33%(以質(zhì)量計(jì),下同)。此外,來(lái)源于F.plautii的DAEase基因在大腸桿菌中異源表達(dá),以果糖為底物在pH 7.5,65 ℃反應(yīng)條件下,添加2.4 g的重組大腸桿菌,60 min后轉(zhuǎn)化率也可達(dá)到33%,即使延長(zhǎng)催化時(shí)間或增加底物質(zhì)量濃度反應(yīng)率也沒(méi)有明顯提高,意味全細(xì)胞催化可以在較高的果糖質(zhì)量濃度下進(jìn)行,提高菌體的利用效率[40]。

在以果糖為底物轉(zhuǎn)化D-阿洛酮糖的過(guò)程中,果糖的質(zhì)量濃度不能無(wú)限制地提高,過(guò)高的果糖質(zhì)量濃度(<800 g/L)會(huì)導(dǎo)致菌體細(xì)胞裂解,從而降低轉(zhuǎn)化率[41]。隨著反應(yīng)的不斷進(jìn)行,果糖質(zhì)量濃度也會(huì)隨之降低,D-阿洛酮糖質(zhì)量濃度的增加會(huì)抑制反應(yīng)的正向進(jìn)行,此時(shí)若能對(duì)底物果糖進(jìn)行補(bǔ)充,則能提高果糖質(zhì)量濃度,此舉不僅能促進(jìn)反應(yīng)正向進(jìn)行,也能起到提高菌體利用率的作用。王洋[41]采用大腸桿菌工程菌進(jìn)行全細(xì)胞催化,以質(zhì)量濃度為300 g/L的果糖為初始底物,每隔6 h添加一定量的果糖以及終質(zhì)量濃度為20 g/L的新鮮全細(xì)胞,經(jīng)6次補(bǔ)料后D-阿洛酮糖產(chǎn)量和產(chǎn)率分別達(dá)到110 g/L和36%,而不進(jìn)行補(bǔ)料的實(shí)驗(yàn)組D-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化率僅為18.45%,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明全細(xì)胞補(bǔ)料轉(zhuǎn)化可進(jìn)一步提升D-阿洛酮糖轉(zhuǎn)化率。

全細(xì)胞催化生產(chǎn)D-阿洛酮糖常用大腸桿菌作為DTE表達(dá)宿主,目前大部分相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道也都是以大腸桿菌為主,雖然其操作系統(tǒng)成熟,培養(yǎng)簡(jiǎn)單且細(xì)胞生長(zhǎng)迅速,并且以大腸桿菌作為DTE酶家族成員的異源表達(dá)系統(tǒng)往往都可以取得比較高的轉(zhuǎn)化效率,但是大腸桿菌會(huì)產(chǎn)生內(nèi)毒素,使其在食品工業(yè)中的應(yīng)用受到限制。枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)和各類酵母菌也是常用表達(dá)系統(tǒng),這些菌株均不含內(nèi)毒素,操作系統(tǒng)較為成熟,菌體生長(zhǎng)迅速,常被作為食品級(jí)酶表達(dá)的優(yōu)良宿主[42]。

Wang等[43]構(gòu)建了枯草芽孢桿菌WB600中異源表達(dá)A.tumefaciensDPE的工程菌株,優(yōu)化發(fā)酵條件后,重組枯草芽孢桿菌細(xì)胞以果糖為底物生產(chǎn)D-阿洛酮糖,轉(zhuǎn)化率為29.01%。大多數(shù)DPE的最佳反應(yīng)溫度>50 ℃(表1),對(duì)細(xì)胞造成了嚴(yán)重的損傷,導(dǎo)致細(xì)胞裂解。因此,Wang等[43]又以海藻酸鈣固定化重組枯草芽孢桿菌細(xì)胞,在pH 8,50 ℃條件下,將固定化細(xì)胞轉(zhuǎn)化率降至20.74%,并且此時(shí)固定化細(xì)胞的pH和溫度穩(wěn)定性相較于游離細(xì)胞都有所提升,有利于提高重組菌重復(fù)利用性,節(jié)省生產(chǎn)成本。

李燦[38]構(gòu)建了來(lái)自于菌Ruminococcussp.的DTE,以短芽孢桿菌作為表達(dá)宿主,該工程菌株具有較高的DTE表達(dá)量,所產(chǎn)的胞外DTE經(jīng)固定化后,以100 g/L的果糖為底物,反應(yīng)6 h,可得到30%的D-阿洛酮糖。同樣條件下，利用該菌株的固定化細(xì)胞反應(yīng)6 h后可得到29.3%的D-阿洛酮糖。各類酵母菌也是常用的食品級(jí)酶表達(dá)宿主,Yang等[44]報(bào)道了一株馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)工程菌株,該菌株能夠異源表達(dá)Agrobacteriumtumefaciens的DTE,利用該工程菌株作為生物催化劑,以750 g/L的D-果糖為底物,55 ℃反應(yīng)12 h得到190 g/L的D-阿洛酮糖,轉(zhuǎn)化率達(dá)25.3%。雖然由枯草芽孢桿菌或酵母菌作為表達(dá)宿主產(chǎn)生D-阿洛酮糖,其生產(chǎn)轉(zhuǎn)化率一般低于大腸桿菌(大腸桿菌轉(zhuǎn)化效率可達(dá)33%),但是枯草芽孢桿菌和酵母菌不產(chǎn)生內(nèi)毒素,這對(duì)可作為食品原料的D-阿洛酮糖來(lái)說(shuō)尤為重要,因此未來(lái)以全細(xì)胞催化方式生產(chǎn)D-阿洛酮糖枯草芽孢桿菌和各類酵母菌將是宿主菌的最佳選擇,關(guān)于這兩大類菌的研究也將會(huì)成為熱點(diǎn)。

2.1.4 提高異構(gòu)化反應(yīng)效率

DTE催化D-果糖到D-阿洛酮糖的反應(yīng)為可逆反應(yīng),在反應(yīng)達(dá)到平衡以后,不會(huì)有額外的D-阿洛酮糖生成,因此D-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化率普遍較低,約30%,這也是D-阿洛酮糖產(chǎn)量低的主要原因之一。針對(duì)該問(wèn)題,目前有兩種解決方案:1) 提高異構(gòu)化反應(yīng)溫度,對(duì)于吸熱反應(yīng),升高溫度可使反應(yīng)物活化分子數(shù)增多,增強(qiáng)分子間有效碰撞,提高反應(yīng)速率，加快產(chǎn)物生成,以促進(jìn)反應(yīng)的正向進(jìn)行;2) 反應(yīng)過(guò)程中及時(shí)移走生成物,這也是最有效的提高轉(zhuǎn)化效率的方法。2008年Kim等[45]發(fā)現(xiàn):D-阿洛酮糖與硼酸在堿性條件下形成復(fù)合物的能力高于D-果糖,且該復(fù)合物不參與D-果糖與D-阿洛酮糖之間的異構(gòu)化反應(yīng),可在反應(yīng)混合物中加入部分硼酸，打破反應(yīng)平衡,使得異構(gòu)化反應(yīng)逐漸向D-阿洛酮糖方向進(jìn)行,進(jìn)而提高D-阿洛酮糖的產(chǎn)量;在D-果糖與D-阿洛酮糖的反應(yīng)體系中加入摩爾比例為60%的硼酸可使D-阿洛酮糖的產(chǎn)量達(dá)到最高,約為未加硼酸體系的2倍。

向反應(yīng)混合物中加入硼酸,在一定程度上可以促進(jìn)反應(yīng)向阿洛酮糖生成的方向進(jìn)行,由于硼酸具有毒性,故通過(guò)該方法獲得的阿洛酮糖在食品中的應(yīng)用可能會(huì)受到一定的阻力。近些年來(lái)有研究者發(fā)現(xiàn)L-鼠李樹(shù)膠糖激酶(L-rhamnulose kinase,RhaB)可催化D-阿洛酮糖轉(zhuǎn)化為D-阿洛酮糖-1-磷酸[46],且該反應(yīng)為不可逆反應(yīng),因此將RhaB與DTE一起使用,可以打破異構(gòu)化反應(yīng)的平衡點(diǎn),進(jìn)而提高D-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化率。溫俊婷等[47]將DPE與RhaB偶聯(lián),利用RhaB消耗一分子ATP將DPE反應(yīng)產(chǎn)生的D-阿洛酮糖磷酸化,后者再通過(guò)酸性磷酸酶(Acid phosphatase,AP)將D-阿洛酮糖-1-磷酸脫磷酸為D-阿洛酮糖,以5 g/L果糖為底物,pH 8.5,35 ℃條件下偶聯(lián)體系反應(yīng)轉(zhuǎn)化率可達(dá)70%。

D-阿洛酮糖磷酸化過(guò)程需要消耗一分子ATP,如沒(méi)有額外的ATP補(bǔ)充,則反應(yīng)難以進(jìn)行。多聚磷酸鹽激酶(Polyphosphate kinase,PPK)可用于ATP的重生,該酶可分為PPK1和PPK2。PPK1能以ATP為底物合成多聚磷酸鹽(PolyPn),也可以在ATP/ADP值偏低時(shí),催化ADP轉(zhuǎn)化為ATP,PPK2更傾向于PolyPn的分解生成ATP。溫俊婷等[47]嘗試將DTE,RhaB和PPK1組成偶聯(lián)體系,相同條件下該偶聯(lián)體系反應(yīng)轉(zhuǎn)化率降至50%,但ATP消耗降低至原來(lái)的1/5。馮林雪[48]則在大腸桿菌中異源表達(dá)DPE,RhaB和PPK2,此偶聯(lián)體系需要在D-阿洛酮糖生產(chǎn)過(guò)程中補(bǔ)加PolyPn保證ATP的充足供應(yīng),全細(xì)胞催化條件下以40 g/L的D-果糖為底物,反應(yīng)8 h后阿洛酮糖轉(zhuǎn)化率可達(dá)65%。相較于添加硼酸,使用生物酶手段提高異構(gòu)化效率的方法不僅更為安全可靠,而且有利于D-阿洛酮糖在食品領(lǐng)域的應(yīng)用。

2.2 氧化阿洛醇產(chǎn)D-阿洛酮糖

除了通過(guò)異構(gòu)化反應(yīng)生產(chǎn)阿洛酮糖外,氧化還原也可用于阿洛酮糖的生產(chǎn),且氧化還原方法生產(chǎn)阿洛酮糖具有較高的轉(zhuǎn)化率。Wen等[49]在大腸桿菌中異源表達(dá)來(lái)GluconobacterfrateuriiNBRC 3264的NAD(P)-依賴型醇脫氫酶[NAD(P)-dependent alcohol dehydrogenase,ADH],該酶在濃度為0.05 mol/L的阿洛醇底物下,pH 7,50 ℃條件下反應(yīng)4 h,最終所得D-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化率為97%,利用ADH氧化阿洛醇產(chǎn)D-阿洛酮糖的途徑如圖2所示。另外,Wen等[49]以該工程菌為生物催化劑,分別以10 g/L和100 g/L的阿洛醇為底物,在pH 10,50 ℃條件下以全細(xì)胞催化的方式進(jìn)行D-阿洛酮糖的生產(chǎn),D-阿洛酮糖的最終轉(zhuǎn)化率分別為80.9%，48%。由此可以看出:通過(guò)ADH催化阿洛醇生產(chǎn)D-阿洛酮糖不僅可以獲得較高的轉(zhuǎn)化率,而且也有利于D-阿洛酮糖后續(xù)的分離純化[49]。該方法中的底物阿洛醇也是一種稀有糖醇,目前尚未見(jiàn)其大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的相關(guān)報(bào)道,由于阿洛醇價(jià)格高昂,目前來(lái)看以其為原料生產(chǎn)D-阿洛酮糖得不償失。

圖2 氧化阿洛醇產(chǎn)D-阿洛酮糖

2.3 葡萄糖直接轉(zhuǎn)化生產(chǎn)D-阿洛酮糖

D-果糖作為D-阿洛酮糖的主要生產(chǎn)原料,可由葡萄糖經(jīng)葡萄糖異構(gòu)酶(Glucose isomerase,GI)或木糖異構(gòu)酶(Xylose isomerase,XI)催化得到。與葡萄糖相比,D-果糖的市場(chǎng)價(jià)格遠(yuǎn)高于葡萄糖,若以葡萄糖為原料進(jìn)行D-阿洛酮糖的生產(chǎn)可極大程度地降低D-阿洛酮糖的生產(chǎn)成本。日本香川大學(xué)的研究人員率先以固定化DTE與XI偶聯(lián)的方式進(jìn)行D-葡萄糖為底物轉(zhuǎn)化D-阿洛酮糖的實(shí)驗(yàn),僅有10%的葡萄糖轉(zhuǎn)化為D-阿洛酮糖[1]。隨后Zhang等[50]在E.coliBL21(DE3)菌株中同時(shí)表達(dá)了Acidothermuscellulolyticus11B的GI酶和Doreasp. CAG317的DPE,該工程菌以葡萄糖為原料,先催化葡萄糖轉(zhuǎn)化為D-果糖,隨后在其分泌的DPE作用下,將D-果糖轉(zhuǎn)化為D-阿洛酮糖,葡萄糖直接轉(zhuǎn)化獲得D-阿洛酮糖的途徑如圖3所示。該共表達(dá)體系在pH 6.5,75 ℃時(shí)表現(xiàn)出最大的催化活性,當(dāng)添加500 g/L的D-葡萄糖為底物時(shí),可產(chǎn)生204.3 g/L的D-果糖和89.1 g/L的D-阿洛酮糖,約有17.8%的葡萄糖轉(zhuǎn)化為D-阿洛酮糖。Li等[51]通過(guò)兩步法由葡萄糖生產(chǎn)D-阿洛酮糖,首先在大腸桿菌中表達(dá)XI,以此工程菌株催化葡萄糖轉(zhuǎn)化為果糖,然后將反應(yīng)混合物的上清液倒入含DPE的酵母孢子中,60 ℃反應(yīng),實(shí)現(xiàn)將D-果糖轉(zhuǎn)化為D-阿洛酮糖,該方法的D-阿洛酮糖最高轉(zhuǎn)化率可達(dá)12%。

圖3 葡萄糖直接生產(chǎn)D-阿洛酮糖

雖然以上方法均達(dá)到了由葡萄糖直接生產(chǎn)D-阿洛酮糖的目的,并在一定程度上降低了D-阿洛酮糖的生產(chǎn)成本,但是當(dāng)以D-葡萄糖為基礎(chǔ)原料時(shí),無(wú)論是一步法還是兩步法生產(chǎn)阿洛酮糖,D-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化率均低于20%,產(chǎn)量偏低。造成D-阿洛酮糖低轉(zhuǎn)化率的原因:1) 反應(yīng)受熱力平衡的限制;2) 胞外多酶催化反應(yīng)中所有酶均處于同一環(huán)境中,而不同酶的最適反應(yīng)條件難以統(tǒng)一,很難充分發(fā)揮每一種酶的最高催化活性。此外,在由葡萄糖生產(chǎn)D-阿洛酮糖的過(guò)程中,GI(XI)催化葡萄糖異構(gòu)化為D-果糖的效率一般≥50%,而由DTE催化的D-果糖異構(gòu)化為D-阿洛酮糖效率一般約為30%,由此可見(jiàn)由葡萄糖直接轉(zhuǎn)化獲得D-阿洛酮糖這一過(guò)程的限速酶為DTE,因此若要提升以葡萄糖為原料生產(chǎn)D-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化效率,仍然需要在提升DTE性能方面進(jìn)一步研究。

3 阿洛酮糖的分離純化

D-果糖到D-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化是可逆反應(yīng),在最終達(dá)到反應(yīng)平衡后,D-果糖依舊大量存在。由于生產(chǎn)D-阿洛酮糖的底物D-果糖與D-阿洛酮糖的性質(zhì)極為接近,使得D-阿洛酮糖的分離純化極為困難,從而制約D-阿洛酮糖的規(guī)?；a(chǎn)。因此,開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)單有效的分離方法在D-阿洛酮糖的實(shí)現(xiàn)工業(yè)化方面變得極為重要。目前分離阿洛酮糖的方法主要有:1) 利用模擬移動(dòng)床技術(shù)分離;2) 利用生物轉(zhuǎn)化法分離。

3.1 模擬移動(dòng)床色譜技術(shù)(SMB)純化分離D-阿洛酮糖

模擬移動(dòng)床色譜技術(shù)(Simulated chromatographic moving bed technology,SMB)是利用各組分在固定相和流動(dòng)相中吸附和分配系數(shù)的微小差異,實(shí)現(xiàn)各組分彼此分離的連續(xù)色譜技術(shù)。模擬移動(dòng)床來(lái)源于移動(dòng)床色譜分離技術(shù),在移動(dòng)床色譜分離中,固定相在重力作用下自上而下運(yùn)動(dòng),流動(dòng)相在泵機(jī)的作用下由下向上運(yùn)動(dòng),兩者形成逆流并進(jìn)行各自的循環(huán),將固定相的移動(dòng)速率設(shè)置在兩種目的樣品遷移速率之間,可以在不同出口連續(xù)得到兩種目的樣品[52-53]。固定相和流動(dòng)相的連續(xù)流動(dòng)會(huì)導(dǎo)致固定相材料的磨損,磨損的殘?jiān)鼤?huì)造成管道和閥門(mén)的堵塞,影響系統(tǒng)的穩(wěn)定性,這些問(wèn)題使得移動(dòng)床色譜技術(shù)在實(shí)際運(yùn)行中難以達(dá)到理想狀態(tài)。

SMB技術(shù)使用裝填于色譜柱中的靜止分離介質(zhì),其色譜柱首尾連接成環(huán),不斷改變洗脫液入口和出口位置,使色譜柱發(fā)生相對(duì)運(yùn)動(dòng)[53]。周錦怡等[54]通過(guò)單柱實(shí)驗(yàn)篩選用于SMB分離D-果糖與D-阿洛酮糖的固定相,經(jīng)過(guò)考察D-阿洛酮糖在不同類型樹(shù)脂上的保留行為及分離效果,確定了Ca2+型樹(shù)脂為適宜的固定相。Nguyen等[55]以Dowex50WX4-Ca2+離子交換樹(shù)脂為固定相以模擬SMB過(guò)程,結(jié)果顯示D-阿洛酮糖的純度和收率分別為99.04%和97.46%,殘液(D-果糖)的純度和收率分別為99.06%和99.53%,D-阿洛酮糖和D-果糖都取得了較好的分離效果。Li等[31]使用Ca2+型固定相,以去離子水為洗脫劑,分離果糖與D-阿洛酮糖,經(jīng)SMB分離后D-阿洛酮糖純度可達(dá)98.5%。使用SMB進(jìn)行D-阿洛酮糖產(chǎn)物的分離是一種高效的分離方法,不僅可以獲得高純度的D-阿洛酮糖,而且還可以分離出未反應(yīng)的果糖或其他糖類,這些糖類還可繼續(xù)用于D-阿洛酮糖的生產(chǎn),殘余糖利用率高,節(jié)省了大量生產(chǎn)成本,隨著產(chǎn)量的增加,這種成本優(yōu)勢(shì)會(huì)愈發(fā)明顯,非常適宜大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。

3.2 生物法分離純化阿洛酮糖

雖然使用SMB分離方法可以將D-果糖與D-阿洛酮糖從反應(yīng)液中分離出來(lái),但是其設(shè)備投資較高、技術(shù)復(fù)雜,更適合大規(guī)模生產(chǎn)企業(yè)的應(yīng)用。由于異構(gòu)化反應(yīng)中主要目的產(chǎn)物是D-阿洛酮糖,故可以考慮先將殘余果糖轉(zhuǎn)化為其他易于與D-阿洛酮糖分離的物質(zhì),再進(jìn)行D-阿洛酮糖的分離純化,目前常使用生物催化劑將剩余果糖進(jìn)行轉(zhuǎn)化。姜彥君等[56]在果糖轉(zhuǎn)化為D-阿洛酮糖后,將混合糖液中的D-果糖作為底物進(jìn)行釀酒酵母的好氧發(fā)酵,24 h后D-果糖被大量消耗,果糖去除率達(dá)94.22%,該過(guò)程雖然去除了大量果糖,但是未能產(chǎn)生其他有價(jià)值的產(chǎn)品,經(jīng)濟(jì)損失較大。袁堂國(guó)等[40]利用馬克斯克魯維酵母將未轉(zhuǎn)化的果糖經(jīng)無(wú)氧發(fā)酵后生成乙醇,將乙醇回收用作燃料,既減少了混合糖液中果糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù),降低了D-阿洛酮糖的分離難度,又能盡可能利用殘余果糖。李燦[38]使用固定化GI先將反應(yīng)殘液中的D-果糖轉(zhuǎn)化成葡萄糖,然后利用固定化葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase,GOD)將生成的葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖醛酸,最后利用陰離子交換樹(shù)脂吸附葡萄醛酸,并將葡萄醛酸回收利用,得到高質(zhì)量濃度的D-阿洛酮糖溶液,最終D-阿洛酮糖的純度達(dá)到91.2%,該方法不僅得到較高質(zhì)量濃度的D-阿洛酮糖溶液,還能盡可能地對(duì)殘余果糖進(jìn)行回收,具有一定的工業(yè)化生產(chǎn)意義。

雖然以上方法降低了D-阿洛酮糖的分離難度,操作方法也較為簡(jiǎn)單,但是也降低了底物(如D-果糖)的利用率。生物法分離純化D-阿洛酮糖存在以下劣勢(shì):1) 由于將其他菌株引入了發(fā)酵反應(yīng)液,故難免會(huì)產(chǎn)生其他代謝廢物,對(duì)以全細(xì)胞催化生產(chǎn)D-阿洛酮糖的工藝來(lái)說(shuō)存在雜菌污染的風(fēng)險(xiǎn);2) 反應(yīng)液發(fā)酵產(chǎn)生的乙醇質(zhì)量濃度低,將乙醇進(jìn)行濃縮精餾也會(huì)帶來(lái)額外的成本投入。因此,生物法分離純化D-阿洛酮糖能否應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)還有待商榷。生物法分離純化D-阿洛酮糖的優(yōu)勢(shì)在于不僅不需要額外的設(shè)備投入,成本較低,而且操作方法簡(jiǎn)單有效,非常適合實(shí)驗(yàn)室研究?？傊?兩種D-阿洛酮糖分離純化方法都可以取得良好的分離效果,有各自的適用環(huán)境,具體采用哪一種,可根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行選擇。

3.3 D-阿洛酮糖結(jié)晶

結(jié)晶是D-阿洛酮糖生產(chǎn)的最后一步,關(guān)系著最終產(chǎn)品的質(zhì)量?jī)?yōu)劣和經(jīng)濟(jì)效益。在工業(yè)生產(chǎn)中最常用的結(jié)晶方法有蒸發(fā)法、降溫法、真空冷卻法和有機(jī)溶劑析出法等。由于D-阿洛酮糖在高溫下會(huì)變色,并且其溶解度會(huì)隨著溫度變化而發(fā)生較大變化,因此D-阿洛酮糖常采用降溫法進(jìn)行結(jié)晶。此外,D-阿洛酮糖在有機(jī)溶劑中溶解度較低,也可采用有機(jī)溶劑析出法進(jìn)行阿洛酮糖的結(jié)晶。

李燦[38]將模擬移動(dòng)床分離得到的D-阿洛酮糖溶液濃縮,得到糖度為60,70,75,80的糖溶液,分別加入0.1%的400目的D-阿洛酮糖晶種,由65 ℃降溫至4 ℃結(jié)晶,發(fā)現(xiàn)當(dāng)糖度>75后加入晶種才能結(jié)晶,此方法的結(jié)晶率可達(dá)80%。趙哲衛(wèi)等[57]先在D-阿洛酮糖濃縮液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥85%)中加入晶種,在50～30 ℃溫度區(qū)間內(nèi)交替進(jìn)行梯度降溫和恒溫結(jié)晶,當(dāng)糖液溫度為30 ℃停止結(jié)晶,結(jié)晶收率≥70%。采用降溫結(jié)晶法對(duì)D-阿洛酮糖進(jìn)行結(jié)晶,對(duì)設(shè)備要求低、工藝簡(jiǎn)單,便于實(shí)際生產(chǎn),尤其適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)加工。

有機(jī)溶劑析出法常用的析出劑是乙醇,乙醇與水分子的親和力大于D-阿洛酮糖和水分子的親和力,乙醇的加入可以將D-阿洛酮糖和水分子有效分離,從而促進(jìn)D-阿洛酮糖析出晶體。佟毅等[58]開(kāi)發(fā)了一種利用乙醇析出D-阿洛酮糖結(jié)晶的方法,在濃縮后的D-阿洛酮糖溶液中加入少量乙醇,再次濃縮,乙醇帶走D-阿洛酮糖溶液中的水分,得到D-阿洛酮糖乙醇濃縮液,重復(fù)此步驟2～3次即可得到D-阿洛酮糖晶體。該方法一次結(jié)晶率高于50%,易于固液分離。郭元亨等[59]通過(guò)調(diào)節(jié)結(jié)晶過(guò)程中糖溶液密度、乙醇與糖液質(zhì)量比、結(jié)晶時(shí)間和結(jié)晶溫度來(lái)改進(jìn)結(jié)晶工藝,認(rèn)為:1) 糖液質(zhì)量濃度應(yīng)控制在1.35 g/L以下,過(guò)高的糖液密度會(huì)降低液體傳熱性能,易發(fā)生美拉德反應(yīng),影響產(chǎn)品品質(zhì);2) 乙醇與糖液質(zhì)量比為3.8∶1,當(dāng)乙醇加入量過(guò)高時(shí)部分D-阿洛酮糖會(huì)溶于乙醇,降低結(jié)晶率;3) 結(jié)晶時(shí)間宜低于5 h,結(jié)晶溫度宜控制在25 ℃以下,此方法可盡量降低生產(chǎn)成本,結(jié)晶率可達(dá)71.58%。由于乙醇是易燃品,因此對(duì)結(jié)晶過(guò)程提出了更高的要求,在使用過(guò)程中乙醇需要回收,增加了成本。相較于降溫結(jié)晶法,有機(jī)溶劑析出法中需要的D-阿洛酮糖濃縮液質(zhì)量濃度低,不需要額外的濃縮步驟,因此在實(shí)際應(yīng)用也具有一定的優(yōu)勢(shì),生產(chǎn)者可根據(jù)濃縮液濃度或自身實(shí)際情況選擇結(jié)晶方式。

4 結(jié) 論

作為一種高甜度、低熱量的新型甜味劑,D-阿洛酮糖在食品領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。雖然在生物合成和分離純化領(lǐng)域都已建立了比較系統(tǒng)的D-阿洛酮糖生產(chǎn)工藝,但是其在生物合成法方面還有較大的改進(jìn)空間。筆者認(rèn)為當(dāng)前對(duì)D-阿洛酮糖的生物合成研究需要聚焦于2個(gè)方面:1) 繼續(xù)提升DTE家族催化能力,提高D-阿洛酮糖轉(zhuǎn)化率，增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性,提高酶的重復(fù)利用率，改善各種酶的催化環(huán)境,如降低DTE最適pH,減少褐變反應(yīng)的發(fā)生等;2) 以全細(xì)胞催化的方式生產(chǎn)D-阿洛酮糖或?qū)⒊蔀橹髁?構(gòu)建重組食品安全菌株成為必需。隨著越來(lái)越多國(guó)家通過(guò)對(duì)D-阿洛酮糖食品級(jí)應(yīng)用的批準(zhǔn),D-阿洛酮糖的市場(chǎng)將保持快速增長(zhǎng),其在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用也將得到不斷拓展。