一種人B淋巴細(xì)胞表面抗原的重組表達(dá)和純化

常 卿， 俞敏達(dá)， 李文奇

(1. 清華大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 蛋白質(zhì)研究技術(shù)中心， 北京 100084； 2. 清華大學(xué) 結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心， 北京 100084; 3. 北京市第四中學(xué)國際校區(qū)， 北京 100031)

CD20作為B淋巴細(xì)胞表面特異性分子，在1980年作為第一個B細(xì)胞表面特異標(biāo)記物被報道，最初被命名為B1[1]。它與B淋巴細(xì)胞Ca2+的跨膜傳導(dǎo)密切相關(guān)，對B淋巴細(xì)胞的增殖和分化具有調(diào)節(jié)作用[2]。研究證明，CD20分子在B細(xì)胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤等疾病中的表達(dá)量異常增高[3]。因此CD20可作為B淋巴細(xì)胞瘤治療的有效治療靶點，并已經(jīng)通過臨床驗證[4]。CD20分子是多次跨膜蛋白，屬于4次跨膜A家族(MS4A family)成員，分為胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)等3個部分[5-6]。目前已報道的抗CD20的單克隆抗體，包括利妥昔單抗(Rituximab)、奧法木單抗(Ofatumumab)和奧妥珠單抗(Obinutuzumab)等都識別CD20胞外區(qū)的抗原表位[7-11]。通過體外重組表達(dá)CD20分子的胞外區(qū)并進(jìn)行純化獲得大量純度較高的重組多肽，一方面可以利用其作為抗原篩選人源單鏈抗體可變區(qū)(scFv)的酵母表面展示庫，獲得的scFv可用于構(gòu)建嵌合抗原受體修飾的T細(xì)胞(chimeric antigen receptor t-cell immunotherapy，CAR-T)的關(guān)鍵CAR結(jié)構(gòu)；另一方面也可以作為抗原對小鼠進(jìn)行免疫用于進(jìn)一步制備檢測用的單克隆抗體和治療用的中和抗體。采用串聯(lián)的方法，將CD20胞外區(qū)片段以特定長度的連接區(qū)(linker)串聯(lián)連接并插入表達(dá)載體中，在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)和純化條件的優(yōu)化，通過對包涵體的變復(fù)性條件摸索，建立在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)規(guī)?；慨a(chǎn)CD20胞外區(qū)多肽的方法，并最終制備較高純度和產(chǎn)量的目的產(chǎn)物，可以用于后續(xù)的功能性實驗和抗體的篩選制備，為基于靶向CD20的B淋巴細(xì)胞瘤CAR-T細(xì)胞治療打下良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 模板、質(zhì)粒和菌株

人cDNA文庫、pET28a質(zhì)粒由清華大學(xué)林欣實驗室提供；大腸桿菌E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞、Transetta(DE3) 感受態(tài)細(xì)胞購自全式金公司。

1.1.2 主要試劑

PCR預(yù)混反應(yīng)體系(2×EasyPfu PCR SuperMix)，PCR產(chǎn)物回收試劑盒(EasyPure?PCR Purification Kit)、快速膠回收試劑盒(EasyPure?Quick Gel Extraction Kit)、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(100 bp DNA Ladder)和質(zhì)粒小提試劑盒(EasyPure?Plasmid MiniPrep Kit)購自全式金公司；預(yù)染蛋白Marker，ECL顯色試劑盒購自Thermo-Fisher公司；T4 DNA連接酶、NcoI、BamH I、Hind Ⅲ和XhoI限制性內(nèi)切酶購自NEB公司；引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成；胰蛋白胨、酵母提取物購自O(shè)xiod公司；咪唑、鹽酸胍、異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、Tris、L-精氨酸(Arginine)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)、還原型谷胱甘肽(GSH)、氯化鈉(NaCl)和TritonX-100購自美國Amresco公司；兔抗人CD20多克隆抗體由林欣實驗室制備；鼠抗兔IgG-HRP購自CST公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純級別。

1.2 方法

1.2.1 基因克隆和表達(dá)載體構(gòu)建

通過引物設(shè)計PCR引物序列見表1。以人cDNA文庫為模板，獲得帶有不同酶切位點的CD20胞外區(qū)PCR產(chǎn)物exCD20-NB、exCD20-BH。將PCR產(chǎn)物通過限制性內(nèi)切酶和連接轉(zhuǎn)化按順序插入pET28a表達(dá)載體的NcoI/BamH I、BamH I/Hind Ⅲ位點，獲得的表達(dá)載體命名為pET28a-Bi20，經(jīng)測序驗證表達(dá)載體構(gòu)建的正確性。

表1 PCR引物序列

1.2.2 小試表達(dá)條件優(yōu)化

將測序正確的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株Transetta(DE3)，涂布含有卡那霉素和氯霉素雙抗性的固體LB平板。從平板上挑取單個菌落接種于3 mL含有卡那霉素和氯霉素雙抗性的LB培養(yǎng)基，37 ℃恒溫?fù)u床220 r/min搖菌過夜。將過夜菌按1∶100的比例接種于5 mL含有卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)基，37 ℃ 220 r/min搖菌2～3 h，至OD600=0.4～0.6，在加入IPTG誘導(dǎo)劑之前取1 mL菌液離心制備誘導(dǎo)前電泳樣。誘導(dǎo)時間優(yōu)化：向菌液中加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，37 ℃、220 r/min搖菌，在3、5、9和12 h分別取樣并制備電泳樣。IPTG濃度優(yōu)化方法：同時接種過夜菌到5個3 mL含有卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)基，在OD600=0.6時，加入IPTG至終濃度分別為0、0.1、0.3、0.5 和1 mmol/L，37 ℃、220 r/min轉(zhuǎn)速搖菌，在5 h時收菌并制備電泳樣。誘導(dǎo)溫度優(yōu)化方法：接種過夜菌到2個3 mL菌液，在OD600=0.6時，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，分別放置于37 ℃、220 r/min搖菌5 h，20 ℃、220 r/min搖菌16 h，收菌并制備電泳樣。檢測手段為SDS-PAGE。

1.2.3 Bi20的表達(dá)

取過夜菌接種于100 mL含有卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)基，37 ℃恒溫?fù)u床 220 r/min振蕩培養(yǎng)3 h，按1∶100比例接種到6 L 含有卡那霉素抗性的2×YT培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)至OD600=0.6～0.8時，加入終濃度1 mmol/L IPTG，37 ℃誘導(dǎo)5 h。培養(yǎng)物于16 ℃、4 000 r/min離心30 min，棄上清液，收集菌體-80 ℃保存。

1.2.4 Bi20包涵體的洗滌、純化及變復(fù)性

取凍存菌體，按25 mL每1 L培養(yǎng)物的比例在菌塊中加入裂解緩沖液A(50 mmol/L Tris，pH 7.0，0.5 mol/L NaCl)，混勻后在冰水浴中進(jìn)行超聲破碎，條件是6 s間隔，4 s超聲(功率40%)，總時長為10 min。4 000 r/min低速離心30 min，收集沉淀。以洗滌緩沖液B(50 mmol/L Tris，pH 7.0，0.5 mol/L NaCl，0.5% TritonX-100，2 mol/L 尿素)超聲洗滌沉淀2次，再以不含TritonX-100的洗滌緩沖液C超聲洗滌沉淀2次。將沉淀置于變性緩沖液D(8 mol/L尿素，100 mmol/L Tris，pH 7.0)中充分溶解，4 ℃過夜攪拌，14 000 r/min高速離心60 min，取上清液。

將上清液上樣到已用緩沖液D平衡過的Ni-NTA層析柱，降低流速，使其充分掛柱，緩沖液D添加不同濃度咪唑(20、50、100和300 mmol/L)進(jìn)行梯度洗脫，當(dāng)核酸蛋白檢測儀示數(shù)升高時收集流穿液，每步取樣進(jìn)行SDS-PAGE檢測。

收集含有目的蛋白的洗脫液加入透析袋(截留分子質(zhì)量7 ku)中，同時加入終濃度1 mmol/L GSH和0.1 mmol/L GSSG，4 ℃攪拌透析過夜。依次用含有8 mol/L、4 mol/L、2 mol/L尿素，0.1 mol/L Tris，pH 7.0，0.4 mol/L L-精氨酸的復(fù)性緩沖液進(jìn)行透析。將透析后的蛋白溶液放入10 ku截流分子質(zhì)量的濃縮管中進(jìn)行濃縮，測定濃度，分裝凍于-80 ℃冰箱。純度通過SDS-PAGE進(jìn)行估算。

1.2.5 濃度測定

采用Bradford法測定。用BSA標(biāo)準(zhǔn)品分別配置濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的蛋白樣品，與蛋白染液進(jìn)行混合，5 min后用比色皿測定OD595，制作蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)曲線的測定范圍，取復(fù)性后濃縮的樣品稀釋10倍，與蛋白染液混合，5 min后測定OD595，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對應(yīng)，從而測出相應(yīng)的蛋白濃度。

1.2.6 Western Blot檢測

先將純化后樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，半干法電轉(zhuǎn)至PVDF膜；用封閉液(5%脫脂奶粉)室溫下封閉1 h，TBST洗3次每次10 min，使用一抗兔抗人CD20多克隆抗體(1∶1 000)4 ℃孵育過夜；TBST洗3次，每次10 min。室溫孵育二抗鼠抗兔IgG-HRP(1∶5 000)1 h，TBST洗3次，每次10 min。配置顯影液均勻滴加在PVDF膜上，1 min后使用成像儀曝光成像。

1.2.7 ELISA檢測

用純化好的目的蛋白Bi20和陰性對照蛋白包被96孔酶標(biāo)板，100 ng/100 μL，3個復(fù)孔，4 ℃過夜；30 g/L BSA封閉，300 μL/孔，37 ℃，孵育2 h；PBST洗3次，加入稀釋(1∶100)的雜交瘤細(xì)胞上清液，100 μL/孔，37 ℃，孵育1 h；PBST洗3次，加入Anti-mouse IgG-HRP二抗(1∶5 000稀釋)，100 μL/孔，37 ℃，孵育1 h，PBST洗5次，加入TMB顯色(100 μL/孔)20 min，加1 mol/L硫酸終止顯色。檢測OD450。

2 結(jié)果與分析

2.1 分子克隆和載體構(gòu)建

選取的CD20胞外區(qū)(K142-L189)只有48個氨基酸殘基，分子質(zhì)量約5.5 ku，在大腸桿菌中表達(dá)這種小分子質(zhì)量的蛋白容易發(fā)生降解并且不易于檢測和后續(xù)純化，因此采用串聯(lián)CD20胞外區(qū)的策略，將兩個CD20胞外區(qū)作為一個整體表達(dá)，中間通過8個氨基酸長度的-GSSGGSSG-作為Linker連接，保證兩者間有一定的柔性空間。CD20胞外區(qū)的PCR結(jié)果見圖1。

M：DNA Ladder；1：exCD20-NB；2：exCD20-BH。圖1 CD20胞外區(qū)的PCR結(jié)果Figure 1 PCR result of the CD20 extracellular domain

將exCD20-NB片段插入到pET28a載體的NcoI和BamH I酶切位點后，通過測序驗證后在BamH I和Hind III酶切位點插入exCD20-BH片段，最終測序驗證表達(dá)載體pET28a-Bi20構(gòu)建的正確性。

2.2 小試表達(dá)

表達(dá)產(chǎn)物由兩個CD20胞外區(qū)組成，分子質(zhì)量約13.7 ku。由于采用原核表達(dá)系統(tǒng)且重組序列來自人源，因此采用Transetta(DE3)菌株，補(bǔ)充大腸桿菌缺乏的6 種稀有密碼子 (AUA、AGG、AGA、CUA、CCC、GGA)對應(yīng)的tRNA，提高外源基因的表達(dá)水平。表達(dá)條件優(yōu)化從誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)溫度和時間等方面入手，通過降低起始誘導(dǎo)的OD600，降低誘導(dǎo)溫度等嘗試獲得可溶上清液表達(dá)，但目的蛋白始終是以包涵體的形式表達(dá)。最終確定在OD600為0.6～0.8時，以IPTG終濃度1 mmol/L，37 ℃誘導(dǎo)5 h作為最終大量表達(dá)的條件。不同優(yōu)化條件的誘導(dǎo)前后的全菌總蛋白和上清液以及沉淀的表達(dá)結(jié)果對比圖(圖2)。目的蛋白在上清液中沒有可溶形式的表達(dá)，主要以包涵體形式分布在沉淀中。CD20的胞外區(qū)序列含有2個半胱氨酸，在正確的折疊形式下會形成一對二硫鍵。大腸桿菌本身不能提供氧化還原的折疊環(huán)境，所以很可能形成一些分子間或分子內(nèi)等錯誤配對的二硫鍵，導(dǎo)致蛋白以包涵體的沉淀形式表達(dá)。

M：蛋白質(zhì)分子量Marker；1：37 ℃誘導(dǎo)前全菌；2：37 ℃誘導(dǎo)5 h后全菌；3：37 ℃誘導(dǎo)5 h后裂解上清液；4：37 ℃誘導(dǎo)5 h后裂解沉淀；5：37 ℃過夜誘導(dǎo)全菌液；6：37 ℃過夜誘導(dǎo)裂解上清液；7：37 ℃過夜誘導(dǎo)裂解沉淀；8：誘導(dǎo)前全菌；9：20 ℃過夜誘導(dǎo)全菌；10：20 ℃過夜誘導(dǎo)裂解上清液；11：20 ℃過夜誘導(dǎo)裂解沉淀。圖2 重組表達(dá)產(chǎn)物的小試表達(dá)(SDS-PAGE)Figure 2 SDS-PAGE analysis of small-scale expression ofrecombinant product

2.3 大量表達(dá)及包涵體純化和變復(fù)性

重組表達(dá)產(chǎn)物是以包涵體形式表達(dá)且表達(dá)量較高，目的蛋白約占菌體總蛋白量的40%。經(jīng)過超聲破碎處理菌體后，離心收集包涵體沉淀。包涵體洗滌條件摸索了1、2 和4 mol/L尿素和0.5% TritonX-100的洗滌步驟后，Bi20在經(jīng)4 mol/L尿素洗滌過程中除了雜蛋白以外還會有部分目的蛋白溶解，因此最終選擇2 mol/L尿素作為包涵體洗滌的最終條件(圖3)。洗滌后的包涵體經(jīng)8 mol/L尿素的充分變性溶解，進(jìn)一步采用Ni親和層析的方法對樣品進(jìn)行純化。利用本實驗室搭建的純化平臺(包括自裝Ni-NTA層析柱、蠕動泵、核酸蛋白檢測儀和信號記錄儀)來實現(xiàn)親和層析純化。通過50、100 和300 mmol/L不同濃度的咪唑梯度洗脫，進(jìn)一步去除雜蛋白。經(jīng)SDS-PAGE鑒定(圖3)，在變性條件下的親和層析經(jīng)不同濃度咪唑洗脫，每步都有目的蛋白被洗脫，其中100 mmol/L咪唑洗脫峰的雜帶較少，純度較高。50和300 mmol/L洗脫峰分別在高分子質(zhì)量和低分子質(zhì)量區(qū)有不同程度的雜蛋白被共同洗脫下來。

M：蛋白質(zhì)分子量Marker；1：裂解后上清液；2：包涵體經(jīng)1 mol/L尿素洗滌后上清液；3：包涵體經(jīng)2 mol/L尿素洗滌后上清液；4：包涵體經(jīng)4 mol/L尿素洗滌后上清液；5：親和層析穿透峰；6：50 mmol/L咪唑洗脫峰；7：100 mmol/L咪唑洗脫峰；8：300 mmol/L咪唑洗脫峰。圖3 包涵體洗滌結(jié)果和在變性條件下Ni親和層析純化結(jié)果(SDS-PAGE)Figure 3 SDS-PAGE analysis of the inclusion-body purification and Ni-NTA column purification under denatured condition

包涵體的復(fù)性采用透析逐步稀釋變性劑的方法。經(jīng)序列分析CD20胞外區(qū)含有2個半胱氨酸，理論上應(yīng)形成1對二硫鍵。對含有二硫鍵的蛋白質(zhì)，在復(fù)性過程中應(yīng)盡可能促進(jìn)正確二硫鍵的形成。復(fù)性緩沖液中的氧化還原環(huán)境對二硫鍵有較大影響[12-13]，其中氧化劑能夠促進(jìn)二硫鍵的形成，而還原劑能夠促使錯誤配對的二硫鍵進(jìn)行重排。二者濃度及比例需要通過實驗摸索確定合適的范圍。當(dāng)復(fù)性緩沖液還原性太強(qiáng)時，二硫鍵將難以形成；而氧化性太強(qiáng)時，則不利于二硫鍵的正確配對。通常采用的氧化還原對為氧化型谷胱甘肽(GSSG)和還原型谷胱甘肽(GSH)，采用的比例有1∶10、4∶6和5∶5。經(jīng)過實驗摸索最終確定氧化還原對以1∶10的比例，終濃度(0.1 mmol/L GSSG + 1 mmol/L GSH)來進(jìn)行Bi20的復(fù)性。

除了氧化還原環(huán)境以外，還有一些因素會影響蛋白質(zhì)的溶解性，包括環(huán)境pH值，離子強(qiáng)度，還有一些抑制蛋白聚集體產(chǎn)生的添加劑，如L-精氨酸，是通過改變蛋白之間的疏水相互作用來改善聚集狀態(tài)增加溶解性[14]。經(jīng)過實驗摸索最終確定復(fù)性液中添加終濃度0.4 mol/L L-精氨酸可以提高包涵體的復(fù)性率，增加溶解度。

2.4 產(chǎn)物濃度和純度

復(fù)性后目的產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳圖分析純度可達(dá)95%以上(圖4)，經(jīng)Bradford法測定濃度約為2.5 mg/mL。

M：蛋白質(zhì)分子量Marker；1：純化后目的條帶(黑色箭頭所指)。圖4 重組多肽最終純化結(jié)果(SDS-PAGE)Figure 4 SDS-PAGE result of purified recombinant product

2.5 Western Blot和ELISA檢測

目的產(chǎn)物經(jīng)特異性的抗人CD20多克隆抗體可以檢測到分子質(zhì)量與預(yù)期大小一致的特異性條帶，見圖5(a)，說明純化復(fù)性后的目的蛋白具有與特異性抗體結(jié)合的能力。

以復(fù)性后的目的蛋白作為抗原免疫小鼠，制備單克隆雜交瘤細(xì)胞株，其培養(yǎng)上清液經(jīng)ELISA方法檢測具有和CD20的識別和結(jié)合能力，見圖5(b)，純化復(fù)性后的產(chǎn)物具有很好的特異性和抗原活性?？梢詾楹罄m(xù)的人源scFv篩選及構(gòu)建CAR-T細(xì)胞的功能性驗證提供良好的前提和基礎(chǔ)。

(a) Western Blot結(jié)果；(b) ELISA結(jié)果(NC：陰性對照；1：純化后目的條帶Bi20)。圖5 Bi20純化產(chǎn)物的Western Blot和ELISA檢測結(jié)果Figure 5 Western Blot and ELISA assay of the recombinant Bi20 protein

3 討論與結(jié)論

本研究通過將4次跨膜蛋白CD20位于第三和第四跨膜區(qū)之間的胞外部分以串聯(lián)的方式在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)和包涵體變復(fù)性純化，獲得具有生物學(xué)活性的CD20胞外區(qū)二體多肽Bi20，建立了經(jīng)濟(jì)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)規(guī)模化量產(chǎn)CD20胞外區(qū)多肽的方法。

目前細(xì)胞免疫治療領(lǐng)域以嵌合抗原受體修飾的 T 細(xì)胞免疫療法(CAR-T)療效最為顯著，而針對適應(yīng)癥集中在血液腫瘤，可以利用非限制性的形式特異識別和殺傷表達(dá)特定抗原的癌細(xì)胞。CAR主要由3部分構(gòu)成：抗原結(jié)合域、跨膜區(qū)及胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)[15-16]。其中單鏈抗體可變區(qū)scFv作為抗原識別區(qū)段起到識別腫瘤細(xì)胞的關(guān)鍵定位導(dǎo)航作用。因此對scFv的篩選需要有效的腫瘤細(xì)胞表面抗原作為靶標(biāo)。CD20是除CD19之外的B細(xì)胞惡性腫瘤的熱門靶點，但是CD20是4次跨膜蛋白，其暴露于細(xì)胞表面的胞外區(qū)較短，前人多采用較大的融合標(biāo)簽進(jìn)行融合表達(dá)[17]，會影響其作為抗原的特異性和免疫原性。Rougé等[11]解析出CD20與利妥昔單抗(RTX)的復(fù)合物結(jié)構(gòu)，揭示CD20是以緊密的雙桶二聚體形式發(fā)揮作用，并且每個CD20單體的胞外段結(jié)合1個RTX抗原結(jié)合片段(Fab)。

針對CD20的胞外區(qū)，采取串聯(lián)組合的方式，只在C端引入較小的6個組氨酸的親和標(biāo)簽，成功在大腸桿菌中表達(dá)了由CD20胞外區(qū)片段串聯(lián)組成的重組蛋白，通過一定長度的Linker連接區(qū)，人為構(gòu)建CD20胞外區(qū)的同源二體，并通過摸索包涵體的洗滌條件，在變性條件下進(jìn)行親和純化，摸索包涵體的復(fù)性條件等，成功對該重組蛋白進(jìn)行純化。在復(fù)性過程中考慮到二硫鍵的形成對多肽結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的重要性，我們對復(fù)性緩沖液中氧化還原對提供的折疊環(huán)境進(jìn)行不同比例條件的摸索。除了氧化還原環(huán)境外，通過添加一些增溶劑改變蛋白之間疏水的相互作用來改善聚集狀態(tài)，抑制蛋白聚集體產(chǎn)生。最終獲得較高純度較高產(chǎn)量的重組蛋白，經(jīng)過后期的功能性試驗證明其具有良好的特異性和抗原活性，并以此為基礎(chǔ)進(jìn)行人源scFv的酵母表面展示庫篩選，取得了階段性的成果，可以用于后續(xù)CAR結(jié)構(gòu)的構(gòu)建。為基于靶向CD20的B淋巴細(xì)胞瘤CAR-T細(xì)胞治療打下良好的基礎(chǔ)。