miRNAs在缺血性腦卒中中的相關(guān)研究進(jìn)展

羅雪顏，楊錫彤 綜述 王光明 審校

大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院基因檢測中心，云南 大理 671000

腦卒中(stroke)是一種嚴(yán)重威脅人類身體健康的腦血管疾病，是目前全球第二大死亡率和第三大高致殘率的疾病，在中國腦卒中比例呈現(xiàn)年輕化并逐年上升的趨勢，已成為我國首位致殘和致死原因[1]。腦卒中分為缺血性腦卒中(ischemic stroke，IS)和出血性腦卒中(hemorrhagic infarction，HI)，IS是由于大腦的血液供應(yīng)中斷導(dǎo)致腦組織缺氧和營養(yǎng)物質(zhì)短缺而引發(fā)的血管堵塞，最終導(dǎo)致腦組織缺血、缺氧及神經(jīng)功能障礙。目前的研究發(fā)現(xiàn)IS是腦卒中的主要類型，約占腦卒中85%以上[2]。目前，輔助監(jiān)測疾病進(jìn)展和預(yù)測未來事件的診斷工具和生物標(biāo)記物有限仍然是腦卒中醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的主要挑戰(zhàn)。因此，盡早地明確IS發(fā)病機(jī)制并及時(shí)進(jìn)行干預(yù)，減少IS患者人數(shù)是預(yù)防腦卒中的關(guān)鍵。

微小RNA(miRNAs)為一種單鏈非編碼RNA，目前有研究表明miRNA作為IS重要的調(diào)控因子，參與缺血性神經(jīng)組織炎癥反應(yīng)的發(fā)生和調(diào)控，對IS的神經(jīng)保護(hù)和新生血管生成具有潛在應(yīng)用價(jià)值。目前對腦缺血再灌注損傷的研究已經(jīng)提升到了基因分子水平，miRNAs是十分重要的基因水平調(diào)控因子，可以通過分子靶基因和目的基因相關(guān)聯(lián)來體現(xiàn)IS的表達(dá)變化。此外，miRNAs在血液樣本中便于檢測且趨于穩(wěn)定，可作為早期生物學(xué)標(biāo)志物，為IS的預(yù)防、診斷和預(yù)后提供參考。本文就miRNAs的分子生物學(xué)特征在IS中的作用機(jī)制以及生物學(xué)應(yīng)用研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 miRNAs的分子生物學(xué)特征

miRNAs是由20～25個(gè)核苷酸組成的小型非編碼RNA，通過完全或不完全堿基互補(bǔ)配對原則與特定靶基因的3'-非翻譯區(qū)或5'-UTR結(jié)合，抑制miRNAs的翻譯或直接降解特定的miRNAs，在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控和生物體正常發(fā)育過程中發(fā)揮重要的作用[3]。miRNAs可以調(diào)節(jié)信使RNA(mRNA)中的“堿基對互補(bǔ)序列”，特別是通過“翻譯抑制”導(dǎo)致基因活性受損。還參與調(diào)節(jié)IS危險(xiǎn)因素的分子，這些分子參與IS的基本病理生理過程，即細(xì)胞周期控制、細(xì)胞代謝、細(xì)胞凋亡和免疫反應(yīng)等。此外，miRNAs還參與神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病、造血障礙、炎癥反應(yīng)等多種疾病的發(fā)生和預(yù)后。尤其是miRNAs參與IS后新生血管生成和神經(jīng)元損傷后保護(hù)，能較早的反映IS患者的病理生理變化。

2 miRNAs與IS的相關(guān)性

研究表明IS很大程度是由動(dòng)脈粥樣硬化引起的，在IS發(fā)病后，由于腦組織缺乏葡萄糖和缺氧導(dǎo)致缺血性神經(jīng)功能缺損，IS中異常表達(dá)的miRNAs與神經(jīng)元損傷后保護(hù)、炎癥因子釋放減少以及調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞活化等密切相關(guān)[4]。大腦中的免疫細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞被激活后誘發(fā)初級炎癥反應(yīng)，之后它們通過受損的血腦屏障介導(dǎo)外周免疫細(xì)胞進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)，加劇炎癥反應(yīng)。機(jī)體會(huì)產(chǎn)生一些miRNAs通過減少神經(jīng)元凋亡、減少炎癥因子的釋放來減輕炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用。越來越多的研究表明，miRNAs是血管內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)和血管生成的重要決定因素，也是IS發(fā)病機(jī)制的重要因素[5]。此外，IS后細(xì)胞膜通透性改變出現(xiàn)腦水腫，miRNAs可通過不同通路保護(hù)神經(jīng)元，抑制腦組織水腫。IS患者容易患上認(rèn)知異常、癡呆、阿爾茨海默氏病、抑郁癥等疾病，極大地加重了患者的生活負(fù)擔(dān)。與其他缺血機(jī)制中討論的miRNAs相似，血管通暢有助于缺血區(qū)血供的恢復(fù)，減少腦梗死面積是治療缺血性腦損傷最有效的方法，因此增加保護(hù)性miRNAs并誘導(dǎo)抗炎性miRNAs可以有效減少缺血性腦損傷，有助于患者的臨床康復(fù)。

3 miRNAs在IS中的調(diào)控作用

miRNAs作為轉(zhuǎn)錄后基因沉默的重要媒介，在大腦發(fā)育的生理學(xué)和IS的病理學(xué)中均發(fā)揮顯著作用。在IS發(fā)生后，患者的腦組織會(huì)發(fā)生缺血缺氧的情況，導(dǎo)致炎癥介質(zhì)的分泌和炎癥級聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生，在病程發(fā)展過程中會(huì)出現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)、能量衰竭及興奮性毒性、血腦屏障紊亂和腦水腫等一系列的病理性改變，機(jī)體也會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧等氧化性高的物質(zhì)誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡，最終導(dǎo)致繼發(fā)性腦損傷[6]。miRNAs作為IS炎癥反應(yīng)中重要的調(diào)控因子，參與缺血神經(jīng)組織炎癥反應(yīng)的發(fā)生和調(diào)控以及IS的神經(jīng)元保護(hù)、新生血管生成。腦缺血/再灌注后小膠質(zhì)細(xì)胞被啟動(dòng)，在神經(jīng)炎癥中起雙重作用，M1型小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)促炎性細(xì)胞因子，引起繼發(fā)性神經(jīng)元損傷；在腦卒中發(fā)作的急性期M2型小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)抑炎性細(xì)胞因子，抑制神經(jīng)炎癥和修復(fù)組織，在髓鞘形成和再形成、神經(jīng)元再生和血管再形成過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[7]。ZHAO等[8]研究發(fā)現(xiàn)來自間充質(zhì)干細(xì)胞的外泌體過度表達(dá)miR-223-3P，減少了大腦中動(dòng)脈閉塞/再灌注模型引起的腦梗死體積，通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞M1極化介導(dǎo)的促炎反應(yīng)從而減輕腦缺血再灌注損傷，改善神經(jīng)功能損傷，促進(jìn)學(xué)習(xí)和記憶能力。研究表明，mi RNAs在腦缺血后調(diào)節(jié)氧化劑和抗氧化劑之間的平衡中起著至關(guān)重要的作用，mi R-424、mi R-23a-3p和mi R-99a的過表達(dá)可減輕氧化應(yīng)激，在缺血性損傷后保護(hù)大腦[9]。此外，IS的直接影響包括能量衰竭和興奮性毒性，在局部缺血期間，谷氨酸的過度釋放和谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)失敗導(dǎo)致谷氨酸受體過度活化和興奮性毒性神經(jīng)元死亡。還有研究表明腦缺血后miR-107表達(dá)水平升高和星形細(xì)胞谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(GLT1)表達(dá)水平降低對IS影響顯著，miR-107表達(dá)上調(diào)通過誘導(dǎo)IS后GLT-1表達(dá)下調(diào)而促進(jìn)興奮性神經(jīng)毒性[10]。

一些miRNAs與IS誘發(fā)的腦水腫有關(guān)，腦水腫是腦缺血死亡的獨(dú)立預(yù)測因子之一，而BBB功能和結(jié)構(gòu)的損害是血管性腦水腫的病理基礎(chǔ)，IS后腦水腫通過增加顱內(nèi)壓和減少大腦組織內(nèi)的血液供應(yīng)而導(dǎo)致生理惡化。IS誘發(fā)的腦水腫也可能是血管性的，在生理水平上，腦水腫由內(nèi)皮功能障礙、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)和水通道蛋白(AQP)介導(dǎo)，有研究發(fā)現(xiàn)AQP4是miR-29b的靶標(biāo)，在局部缺血小鼠模型BBB破壞時(shí)，miR-29b的過表達(dá)顯著減輕了AQP4的表達(dá)及腦水腫和梗死體積的減少[11]，這表明與IS后腦水腫相關(guān)的miRNAs與AQP表達(dá)相關(guān)。

IS發(fā)生后，神經(jīng)元發(fā)生壞死和凋亡導(dǎo)致細(xì)胞死亡,miRNAs通過負(fù)向調(diào)控促凋亡或抗凋亡基因，在IS后的凋亡中發(fā)揮效應(yīng)。到目前為止，許多miRNAs包括miR-21、miR-25、miR-181c和miR-210作為凋亡的分子，而miR-124、miR-181和miR-29b促進(jìn)細(xì)胞凋亡[12]。miR-339通過靶向FGF9/CACNG2并介導(dǎo)IS的MAPK途徑來促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡并損害細(xì)胞活力[13]。利用缺血再灌注腦損傷和興奮性毒性神經(jīng)元死亡的體內(nèi)外模型，CHEN等[14]發(fā)現(xiàn)miR-223是一種神經(jīng)元保護(hù)microRNAs，以保護(hù)卒中和其他興奮性毒性神經(jīng)元疾病中的神經(jīng)元細(xì)胞死亡，與急性IS的發(fā)生、腦卒中的嚴(yán)重性和短期預(yù)后相關(guān)。包括miR-181a、miR-497、miR-9、miR-200和miR-124a在內(nèi)的多種miRNAs通過Bcl-2家族蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞存活，特別是IS后神經(jīng)元祖細(xì)胞中過表達(dá)的miR-124a顯著降低并促進(jìn)了神經(jīng)元分化[15]。LI等[16]的研究表明，miRNA-451保護(hù)神經(jīng)元免受缺血性損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。在小鼠研究中，miR-137通過抑制Src依賴性MAPK信號傳導(dǎo)途徑來減弱氧化、凋亡和炎性途徑，從而對IS的神經(jīng)元起保護(hù)作用[17]。

最近的研究表明，增強(qiáng)新生血管的形成是治療IS的一種有效策略。IS后血管新生促進(jìn)側(cè)支循環(huán)，恢復(fù)缺血區(qū)血供，減少缺血損傷引起的缺血壞死，可有效逆轉(zhuǎn)神經(jīng)損傷。GAN等[18]發(fā)現(xiàn)miRNAs借助IncRNA作為ceRNA從而調(diào)節(jié)靶mRNA的表達(dá)，進(jìn)一步影響新生血管生成過程，例如沉默的MEG8通過靶向miR-130a-5p抑制BMEC活力，遷移血管生成。此外，MEG8可以通過miR-130a-5p/VEGFA軸促進(jìn)IS后的血管生成，從而保護(hù)BMEC免受OGD誘導(dǎo)的損傷[19]。另一項(xiàng)研究顯示，在OGD/R誘導(dǎo)的HBMEC中，MALAT1表達(dá)增加，上調(diào)的MALAT1通過靶向OGD/R條件下的HBMEC中的miR-205-5p/VEGFA信號傳導(dǎo)，促進(jìn)細(xì)胞增殖并在血管生成中起保護(hù)作用[20]。這些研究表明miRNAs轉(zhuǎn)錄后表達(dá)的復(fù)雜性和多樣性，使其在細(xì)胞的生物學(xué)過程、神經(jīng)元的分化發(fā)育和保護(hù)性血管生成方面具有一定的作用，因此，增加保護(hù)性miRNAs并誘導(dǎo)抗炎性miRNAs可以有效減少缺血性腦損傷并有助于臨床康復(fù)。

4 miRNAs在IS中的應(yīng)用

目前，IS的診斷和預(yù)后主要依靠放射成像檢測手段，影像學(xué)檢測有一定的局限性，并且有較高的費(fèi)用。因此，需要一種更快速、簡便的急性IS檢測方法。miRNAs是一種小型非編碼RNA分子，在血液樣本中具有易于檢測、趨于穩(wěn)定、組織特異性較強(qiáng)、平均半衰期較長等優(yōu)點(diǎn)，在IS發(fā)生后短時(shí)間內(nèi)可在血液中檢測到miRNAs表達(dá)水平上調(diào)或者下調(diào)，可依據(jù)IS患者miRNAs表達(dá)的高低作為IS患者早期的生物學(xué)標(biāo)志物之一。評估IS的早期征兆可判定危險(xiǎn)因素以便進(jìn)一步管理與IS風(fēng)險(xiǎn)直接相關(guān)的疾病。

多種miRNAs與IS的發(fā)病機(jī)制有相關(guān)性，包括miR-155、miR-33、miR-144、miR-223和miR-21，其中miR-126、miR-320b已被提出作為IS的潛在預(yù)測標(biāo)志物[21]。利用人源化小鼠大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)模型，ZHAO等[22]研究發(fā)現(xiàn)，circ_0072309-miR-100-mTOR調(diào)節(jié)軸可以減輕IS的癥狀，可能是IS治療潛在的靶標(biāo)。近年來，血液檢查中生物學(xué)標(biāo)志物miRNAs的發(fā)現(xiàn)和使用在急性腦卒中患者中成為一個(gè)有吸引力的研究方向。通過采用逐步發(fā)現(xiàn)、驗(yàn)證和復(fù)制的方法對miRNAs進(jìn)行評估，發(fā)現(xiàn)miR-125a-5p、miR-125b-5p和miR-143-3p的組合具有顯著的敏感性(85.6%)和特異性(76.3%)，可作為IS生物學(xué)標(biāo)志物之一[23]。miR-223是谷氨酸受體表達(dá)和功能的主要調(diào)節(jié)因子，在神經(jīng)元存活中起著重要作用，但仍需要大量的研究確定miR-223作為IS診斷的新型生物標(biāo)志物的臨床應(yīng)用[24]。據(jù)報(bào)道，在大鼠模型的缺血/再灌注期間，有部分miRNAs如miR-206、miR-214、miR-223、miR-298、miR-327和miR-494出現(xiàn)過表達(dá)[24]，檢測miRNAs過表達(dá)可作為預(yù)測IS發(fā)生的重要手段之一。此外，miRNAs通過與其他基因組，例如蛋白質(zhì)組和代謝組數(shù)據(jù)結(jié)合起來生成轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，獲取可用的miRNAs譜。miRNAs與患者的其他臨床信息(例如年齡、治療發(fā)作、NIHSS評分、既往高血壓、心臟病和糖尿病等)也可以結(jié)合起來用作預(yù)后因素，對腦卒中患者的可用電子健康記錄(EHR)進(jìn)行解釋。

針對IS的治療，到目前為止，重組組織纖溶酶原啟動(dòng)劑(tPA)是FDA批準(zhǔn)的唯一治療IS的藥物，但是，tPA的使用主要受到治療時(shí)間窗較短的影響，只能在腦卒中發(fā)作后4.5 h內(nèi)給予。大腦中動(dòng)脈近端閉塞的患者可以接受血管內(nèi)干預(yù)，但至今，尚無有效的治療方法針對早期不能修復(fù)血管的患者[18]。有研究表明miRNAs作為腦血管疾病的靶點(diǎn)成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)，目前的治療策略主要有以下兩種方向，第一：通過抗miRNAs技術(shù)下調(diào)高表達(dá)的miRNAs，一些miRNAs在IS后表達(dá)異常升高，加重缺血后神經(jīng)損傷、腦梗死面積、炎癥等反應(yīng)，例如miR-200c、miR-181a等。通過利用抗miRNAs技術(shù)(包括miRNAs拮抗劑和miRNAs誘餌打靶法)抑制此類miRNAs減少來減輕IS損傷。第二：通過miRNAs模擬技術(shù)上調(diào)miRNAs的表達(dá)，一些miRNAs對神經(jīng)元系統(tǒng)表現(xiàn)出明顯的保護(hù)作用，提高這些miRNAs的表達(dá)可以達(dá)到相關(guān)的治療作用，例如miR-124a、miR-451a等[2/5]。李文彥等[16]研究發(fā)現(xiàn)miRNA-451在小鼠腦缺血再灌注模型中表達(dá)下調(diào)，通過TLR4/MyD88/NF-κB信號通路降低體外腦缺血再灌注模型的炎癥反應(yīng)提示miRNA-451可能開發(fā)用于腦缺血再灌注治療藥物的靶點(diǎn)。數(shù)據(jù)表明，鋰通過BDNF-AS/miR-9-5p軸減少IS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和炎癥，抑制miR-9-5p或miR-128-3p可以顯著降低MCAO誘導(dǎo)的侵襲體積并抑制凋亡反應(yīng)[26]。通過縫合法建立大腦中動(dòng)脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型和MEG8過表達(dá)MCAO模型研究發(fā)現(xiàn)：miR-130a-5p下調(diào)，而MEG8上調(diào)后通過miR-130a-5p/VEGFA信號傳導(dǎo)調(diào)節(jié)IS后血管生成，減輕腦出血[19]。MiR-29b可以損害Bcl-2基因的表達(dá)并增加神經(jīng)元細(xì)胞的死亡，通過下調(diào)MiR-29b的高表達(dá)提示一種針對IS損傷的新治療靶點(diǎn)[24]。然而一些miRNAs的作用機(jī)制與之相反，miR-221通過抑制促炎反應(yīng)來減輕急性IS的腦損傷，上調(diào)miR-221的表達(dá)可為IS的治療提供了新的靶點(diǎn)[27]。miR-190通過調(diào)節(jié)Rho/Rho激酶信號傳導(dǎo)而賦予針對小鼠心肌缺血/再灌注模型(ischemia reperfusion，I/R)損傷的保護(hù)，上調(diào)其表達(dá)顯著降低了患有I/R的大鼠的神經(jīng)學(xué)評分、腦含水量、梗塞體積和神經(jīng)元凋亡，因此，miR-3552有望成為IS大鼠的潛在生物學(xué)治療靶點(diǎn)[28]。通過實(shí)驗(yàn)評估，JIN等[29]發(fā)現(xiàn)上調(diào)的miR-126和miR-130a水平與IS患者的疾病風(fēng)險(xiǎn)、嚴(yán)重程度和炎癥性細(xì)胞因子水平降低有關(guān)，這將有益于開發(fā)新的IS治療方向。這些發(fā)現(xiàn)證明了miRNAs轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的復(fù)雜性，可以通過改變其表達(dá)對細(xì)胞生存或者死亡產(chǎn)生影響。因此，miRNAs作為新的生物標(biāo)志物和卒中治療干預(yù)的潛在靶點(diǎn)具有良好的應(yīng)用前景。

5 結(jié)語

綜上所述，miRNAs因其序列結(jié)構(gòu)和表達(dá)方式的多樣性而成為miRNAs的重要調(diào)節(jié)因子，本文通過闡述miRNAs與IS作用機(jī)制的緊密聯(lián)系，以便更好地了解IS機(jī)制中miRNAs及其靶基因的發(fā)現(xiàn)對IS患者預(yù)測、診療、預(yù)后存在更大的潛在作用。miRNAs及其靶基因參與了IS的新生血管生成、神經(jīng)元再生和神經(jīng)保護(hù)等，可能作為IS的新型療法而推廣用于臨床試驗(yàn)，同時(shí)，miRNAs作為治療方案的作用被預(yù)測為雙刃劍法，miRNAs也有望成為IS的重要預(yù)測、診斷和治療靶標(biāo)。