油橄欖果渣酚類(lèi)物質(zhì)提取測(cè)定及其富集方法

邢 巧，皮汶靈，冉志文，王 鍇,，王怡涵，虞歡歡，劉青林，熊政委,,3,*

1.重慶第二師范學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院 (重慶 400067)2. 重慶第二師范學(xué)院 脂質(zhì)資源利用及兒童日化品研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 (重慶 400067)3. 廣西農(nóng)產(chǎn)資源化學(xué)與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 (玉林 537000)

油橄欖是一種常綠矮小喬木油料作物，常被地中海沿岸國(guó)家作為油料作物種植，我國(guó)近年來(lái)在四川、云南、甘肅等地也有種植。油橄欖有巨大的自然社會(huì)和經(jīng)濟(jì)利用價(jià)值以及豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，果肉中含有大量人體所需的營(yíng)養(yǎng)元素，其油脂中脂肪酸比例在各種天然油脂中較為合理。現(xiàn)在市售的橄欖油絕大部分使用新鮮果實(shí)進(jìn)行物理壓榨，即冷榨。通過(guò)此方法，盡可能保留較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，其果渣中也含有大量活性物質(zhì)。但是目前對(duì)此的研究不夠深入，一直未被廣泛的利用。

近年來(lái)，消費(fèi)者越來(lái)越注重食品的健康，橄欖油也進(jìn)入國(guó)人的視野。雖然我國(guó)橄欖油主要依靠國(guó)外進(jìn)口，但國(guó)內(nèi)也開(kāi)始種植和發(fā)展自己的橄欖油品牌，例如渝江源、祥宇、劍門(mén)等品牌。隨著橄欖油種植范圍擴(kuò)大，資源是否合理利用和環(huán)境污染問(wèn)題也隨之而來(lái)[1]，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)橄欖果渣中含有豐富的酚類(lèi)物質(zhì)以及對(duì)人體有益的多種礦物質(zhì)，其中酚類(lèi)物質(zhì)有一定的保健功效。目前需要將橄欖果渣中的活性物質(zhì)利用起來(lái)，因此如何提高萃取和提純的能力成為如今的研究目的?，F(xiàn)在可以使用有機(jī)溶劑、半透膜以及大孔樹(shù)脂等富集純化方法，收集油橄欖果渣中的酚類(lèi)化合物，同時(shí)獲得食品加工過(guò)程所需的抗氧化劑等。通過(guò)對(duì)提取和富集橄欖果渣中酚類(lèi)物質(zhì)的相關(guān)研究進(jìn)行總結(jié)，旨在為橄欖果渣中酚類(lèi)物質(zhì)的提取加工及在食品業(yè)或者護(hù)膚品中的應(yīng)用提供思路，有利于推動(dòng)食品工業(yè)進(jìn)步和環(huán)境保護(hù)[2-3]。

1 橄欖果渣

1.1 橄欖果渣現(xiàn)狀及其主要成分

油橄欖果渣中含有大量的多酚、萜類(lèi)化合物、酯類(lèi)化合物等多種活性成分。我國(guó)對(duì)油橄欖果渣的再利用率不高，只有一些用來(lái)增強(qiáng)農(nóng)田肥力或飼養(yǎng)動(dòng)物，因而對(duì)各類(lèi)資源產(chǎn)生一定浪費(fèi)。油橄欖加工廢棄物中有未完全榨取的橄欖果渣油和油橄欖果渣，果渣中含有橄欖苦苷、羥基酪醇等多酚物質(zhì)，難溶于水，易溶于有機(jī)溶劑[4]。

1.2 橄欖果渣多酚物質(zhì)作用及其應(yīng)用

多酚物質(zhì)對(duì)人體作用以及機(jī)理，如表1所示。

表1 多酚對(duì)人體的作用以及對(duì)應(yīng)作用機(jī)理

在日常飲食結(jié)構(gòu)中經(jīng)常食用含有油橄欖的食品或者橄欖飲料，會(huì)使X綜合征患者飯后的相關(guān)反應(yīng)明顯減少。其中減少相關(guān)反應(yīng)的主要成分為酚類(lèi)物質(zhì)，酚類(lèi)對(duì)甲狀腺、腫瘤及血糖等有一定調(diào)節(jié)功效[5-6]。橄欖果渣中的多酚物質(zhì)是食品藥品行業(yè)中功能性天然藥物的寶貴來(lái)源，不僅可以用來(lái)制成食品加工所需的抗氧化劑以及清除自由基，滿(mǎn)足各種保健功效的食品，還可以制成肥料改善土壤[7-8]。

2 橄欖果渣酚類(lèi)物質(zhì)的提取

2.1 橄欖果渣樣品的制備

從工廠(chǎng)中得到榨油后的橄欖果渣，試樣可放置于-20 ℃的環(huán)境中長(zhǎng)期進(jìn)行貯藏存放，并取出樣品置于冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行烘干。首先利用有機(jī)溶劑正己烷預(yù)處理，清除果渣中未充分提煉油脂，然后利用減壓回收有機(jī)溶劑，得到預(yù)處理橄欖果渣。預(yù)處理后的橄欖殘?jiān)糜谕L(fēng)櫥中干燥、搗碎、篩分后，作為橄欖多酚提取物的主要原料。

2.2 固液萃取

固液萃取利用溶劑使被萃取物質(zhì)中的可溶性成分溶解達(dá)到分離的目的，可溶性成分依據(jù)其極性分子大小的差異分散在不同極性的液相中，利用相似相溶原理分離后再進(jìn)行物理分離。由于醇水體系對(duì)目標(biāo)化合物的選擇性較高，因此醇水體系是提取多酚化合物常用的溶劑[9]。固液萃取流程示意見(jiàn)圖1。

醇水體系中目前有乙醇提取法、甲醇提取法等。新鮮果渣前處理后，用乙醇溶液在0 ℃～4 ℃下低溫萃取，其中乙醇濃度為80%[10]。在一定溫度內(nèi)，固液萃取的效率會(huì)隨著溫度的升高而提高，由于多酚化合物不耐熱、易氧化的特性，隨著溫度的上升氧化反應(yīng)會(huì)更加的劇烈使其含量不斷下降，因此在提高得率的前提下相對(duì)低溫萃取保證了多酚的生物活性[11]。在提取多酚化合物的同時(shí)也要注意浸提的時(shí)間，使用的高濃度乙醇會(huì)破壞目標(biāo)物質(zhì)中的化學(xué)鍵，恰當(dāng)?shù)臅r(shí)間會(huì)減少多酚物質(zhì)被溶劑的破壞因而可以得到更多的目標(biāo)產(chǎn)物。正己烷、丙酮都有一定毒性會(huì)對(duì)人體造成一定危害通過(guò)對(duì)比得出結(jié)論乙醇溶液能更好的提取目標(biāo)產(chǎn)物，但是在實(shí)際運(yùn)用過(guò)程中不僅采用了簡(jiǎn)單的固液萃取，而且在一定溫度范圍內(nèi)利用高溫高壓的方法輔助提取，達(dá)到提高浸提率的目的[12-13]。

圖1 固液萃取流程圖

2.3 水解作用

在王志宏[14]的研究中，在醇水體系的固液萃取不能完全對(duì)酚類(lèi)化合物進(jìn)行提取，是由于酚類(lèi)化合物中存在大量的酯鍵和糖苷鍵。為獲得更多目標(biāo)產(chǎn)物，目前通常使用非物理方式破壞這系列化學(xué)鍵在溫度一定下有酸解、堿解以及酶解等方法以達(dá)到提高產(chǎn)率的目的。水解后與未被水解的樣品中的酚類(lèi)物質(zhì)相比會(huì)破壞一部分生物活性成分，未水解的酚類(lèi)提取物中羥基酪醇、酪醇等一系列化合物的含量較高，因此經(jīng)過(guò)化學(xué)處理會(huì)減弱生物活性。

通過(guò)鹽酸水解提取橄欖果渣中的羥基酪醇，王強(qiáng)等人在88 ℃下水解86 min、其中為料液比(g/mL)1∶36，鹽酸濃度1.2 mol/L，利用響應(yīng)面優(yōu)化工藝后橄欖果渣中羥基酪醇的提取量為(3.38±0.12) mg/g[15]。酶解法中水解酶有β-葡萄糖苷酶、纖維素酶、半纖維素酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶等，其水解能力最強(qiáng)的為β-葡萄糖苷酶，其中酶解效果最差的為堿性蛋白酶[16]。原姣姣對(duì)橄欖苦苷提取物使用專(zhuān)一性好的半纖維素酶進(jìn)行酶解，并且采用高速逆流色譜聯(lián)用技術(shù)與大孔吸附樹(shù)脂分離得到85.7%高純度羥基酪醇[17]。水解法中鹽酸水解優(yōu)于酶水解，其中使用酸解方法具有操作簡(jiǎn)便、高效、低耗能、低成本等優(yōu)點(diǎn)，適于大規(guī)模投入使用；酶解法具有反應(yīng)過(guò)程相對(duì)溫和的優(yōu)點(diǎn)，但其污染物的排放不符合生產(chǎn)生活的要求。

2.4 超聲波-微波輔助提取

超聲波輔助提取法利用超聲波在一定頻率條件下會(huì)產(chǎn)生負(fù)壓，提取介質(zhì)物理化學(xué)性質(zhì)發(fā)生變化形成空穴破壞細(xì)胞壁，使得溶劑在細(xì)胞中加速擴(kuò)散提高了酚類(lèi)物質(zhì)的提取率。超聲輔助提取通常使用超聲棒或超聲池，此方法簡(jiǎn)單快速且只需要在常溫下進(jìn)行，非常適合活性化合物的提取。將甲醇和乙酸乙酯溶劑固液萃取和超聲波輔助法提取效果相比，超聲波輔助提取效率更高[18-21]。

何志勇等[22]通過(guò)實(shí)驗(yàn)得到在80 W超聲波功率條件下,超聲提取25 min時(shí)橄欖多酚的提取率最高。參照林玉芳的超聲輔助法,精確稱(chēng)量橄欖粉末，加入石油醚(沸程30 ℃～60 ℃)脫脂、去除色素，然后在常溫中加入料液比(g/mL)為1∶30，濃度為40%乙醇并攪拌均勻，超聲功率為300 W連續(xù)處理20 min，提取2次上清液，合并2次提取液連同殘?jiān)谷腚x心管，常溫條件下10 000 r/min離心10 min，上清液即為提取液[23]。橄欖苦苷的提取方法是用超聲波輔助提取并在線(xiàn)動(dòng)態(tài)檢測(cè)橄欖苦苷的含量，其提取效果高于溶劑提取。固液萃取加熱回流提取是利用微波提取植物多酚常采用的方法，其提取效率相對(duì)較低、耗時(shí)長(zhǎng)、能耗較高。超聲輔助提取法的優(yōu)點(diǎn)是油橄欖果渣多酚的提取量與常規(guī)溶劑提取方法相比提高了18%～38%，微波萃取極大的改善其固液萃取的缺點(diǎn)，提高效率有效降低耗能[24]。

2.5 超臨界CO2提取

多酚類(lèi)化合物常為極性化合物，在超臨界提取過(guò)程中通常需加入一些極性溶劑，例如甲醇或乙醇等[25]。黨建章等利用超臨界CO2流體從橄欖葉中萃取橄欖苦苷，其提取得率達(dá)到0.245 mg/g。超臨界CO2在有機(jī)溶劑的輔助下，提取的酚類(lèi)物質(zhì)比起固液萃取的酚類(lèi)物質(zhì)含量更高。不僅解決了固液萃取和微波輔助提取有機(jī)溶劑消耗大，回收溶劑困難的實(shí)驗(yàn)安全隱患，還解決了因高溫條件下，多酚物質(zhì)分解而引起提取率下降的難題。

3 橄欖果渣酚類(lèi)物質(zhì)的富集與測(cè)定

3.1 橄欖果渣多酚物質(zhì)的富集與分離純化

大孔吸附樹(shù)脂是利用物理原理有選擇的吸附溶液中物質(zhì)，吸附過(guò)程中不發(fā)生化學(xué)變化，樣品僅根據(jù)分子間的作用力和氫鍵達(dá)到分離純化和富集的目的。大孔吸附樹(shù)脂因其操作方式簡(jiǎn)便，目標(biāo)產(chǎn)物能夠很好地分離，所得樣品純度高，因此如今在世界上廣泛用于富集和分離純化。大孔吸附樹(shù)脂富集分離流程示意見(jiàn)圖2。

圖2 大孔吸附樹(shù)脂富集分離流程圖

利用大孔樹(shù)脂進(jìn)行富集純化，首先需要判斷樣品極性來(lái)選擇對(duì)應(yīng)型號(hào)的樹(shù)脂，其次用95%的乙醇溶液進(jìn)行預(yù)處理，然后對(duì)樹(shù)脂進(jìn)行篩選，最終完成洗脫和富集。橄欖多酚富集效果和損失率受樹(shù)脂型號(hào)、洗脫液、洗脫時(shí)間、pH值等影響。樹(shù)脂分離純化橄欖中的多酚活性物質(zhì)洗脫效率較高，其吸附率均在85%以上，解析率和純度比例都比較高，多酚物質(zhì)得到很好的富集與純化[26]。其中作為富集純化橄欖中的多酚物質(zhì)洗脫劑最好使用廉價(jià)易得、安全無(wú)毒的乙醇作為解析劑。因?yàn)樘崛〉拈蠙於喾佣嘤糜谑称芳?jí)或醫(yī)藥行業(yè)，所以選用對(duì)人體危害最小乙醇解析劑。

許偉[27]創(chuàng)新使用碳納米管新型材料富集橄欖多酚，由于碳納米管具有 強(qiáng)度高、耐酸堿、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)勢(shì)，被廣泛應(yīng)用于分離科學(xué)領(lǐng)域，其中包括分離純化橄欖多酚。橄欖多酚在乙腈、乙醚等為洗脫劑的碳納米管中洗脫效率均在78.43%～95.77%，甲醇的吸附率在83.42%～95.93%，其效率與大孔樹(shù)脂吸附相比吸附率較高但使用率較低。其一是因?yàn)樘技{米管本身對(duì)人體會(huì)產(chǎn)生一定的危害且也會(huì)導(dǎo)致水生生物生長(zhǎng)緩慢甚至死亡；其二是碳納米管作為新型超導(dǎo)材料制作工藝條件的嚴(yán)苛導(dǎo)致其價(jià)格昂貴，與具有同樣作用的大孔吸附樹(shù)脂相比價(jià)格相差甚遠(yuǎn)。因此碳納米管分離純化多酚物質(zhì)常用于實(shí)驗(yàn)室方法，由于成本過(guò)高不適用于工廠(chǎng)大規(guī)模使用。

3.2 橄欖果渣酚類(lèi)物質(zhì)含量測(cè)定方法

高錳酸鉀氧化法、高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法、原子吸收光譜法等都為目前測(cè)定多酚含量比較常用的方法[28]。油橄欖果渣中多酚含量測(cè)定最為常用的方法是分光光度法，其中福林酚法最為常用。Folin-Cilcalteu比色法的工作原理是通過(guò)配制的一系列濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制一條標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線(xiàn)，再利用分光光度計(jì)測(cè)樣品的吸光度，樣品吸光利用標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線(xiàn)得到樣品多酚的含量。福林酚和NaCO2的用量以及間隔、反應(yīng)和作用時(shí)間等因素都會(huì)影響測(cè)定油橄欖果渣中多酚物質(zhì)的含量，其中福林酚-標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法與酒石酸亞鐵-換算系數(shù)法和酒石酸亞鐵標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法中測(cè)得多酚含量相對(duì)比較低。

4 總結(jié)與展望

橄欖果渣中含有大量對(duì)人體有益的活性物質(zhì)，但目前市場(chǎng)上橄欖果渣利用率不高。從橄欖果渣中有效提取其中的酚類(lèi)物質(zhì)，我們可以利用固液萃取、水解作用、超聲波輔助提取等方法。其中利用超聲波輔助提取法操作更便捷、殘留量少且提取率較高，是目前使用最為廣泛的提取方法。酚類(lèi)物質(zhì)提取后選擇適宜的大孔樹(shù)脂對(duì)其進(jìn)行純化與富集，最終利用分光光度法利用沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)來(lái)測(cè)定提取物中多酚的含量。

現(xiàn)在通過(guò)確定橄欖果渣中主要活性物質(zhì)，以及提取其中的活性物質(zhì)的研究，豐富了橄欖果渣中提取酚類(lèi)物質(zhì)的理論，為提高橄欖果渣多酚活性物質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。但是在橄欖果渣活性物提取的研究中，如何明確提取酚類(lèi)物質(zhì)的實(shí)驗(yàn)方法，以及將酚類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行精練純化和能否單獨(dú)在橄欖果渣中提取一種目標(biāo)物質(zhì)，是橄欖果渣活性物質(zhì)研究中遇到的新課題，今后有待進(jìn)一步研究。