肺癌早期診斷相關(guān)標(biāo)志物研究進(jìn)展

朱曉莉，許露

0 引言

肺癌是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一，根據(jù)統(tǒng)計(jì)，2020年我國(guó)新增肺癌確診病例81.6萬(wàn)例，肺癌相關(guān)死亡71.5萬(wàn)例[1]。肺癌高死亡率的重要原因之一是早期多以肺結(jié)節(jié)形式存在，缺乏特異性臨床癥狀，腫瘤的發(fā)生進(jìn)展往往容易被忽視，因此大多數(shù)肺癌患者在初次就診時(shí)已處于晚期。研究表明，Ⅰa期肺癌手術(shù)后5年生存率可達(dá)到80%，而Ⅲa～Ⅳ期肺癌患者5年生存率降至36%以下。因此，肺癌早診早篩對(duì)改善預(yù)后有重要意義[2]。本文就近年來(lái)較為新穎的肺癌相關(guān)生物標(biāo)志物進(jìn)行歸納總結(jié)，從而提高臨床醫(yī)生對(duì)肺癌早期診斷的認(rèn)識(shí)。

肺癌診斷標(biāo)志物有多種來(lái)源，其中血液生物標(biāo)志物是最有前景的，基于血液的生物標(biāo)志物可以協(xié)助腫瘤診斷、組織分型、預(yù)后判斷以及指導(dǎo)治療。由于肺癌的解剖學(xué)特點(diǎn)，痰、支氣管灌洗、呼出氣或氣道上皮樣本是特有的潛在的肺部或其他呼吸道腫瘤的生物標(biāo)志物。這些生物標(biāo)志物可能在早期提供一定的分子生物學(xué)信息，協(xié)助篩選早期肺癌。本文綜述了目前比較有前景的生物標(biāo)志物如miRNA、循環(huán)腫瘤DNA、DNA甲基化的發(fā)現(xiàn)和研究狀況，同時(shí)對(duì)其他新興的生物標(biāo)志物或新技術(shù)進(jìn)行歸納總結(jié)。

1 MicroRNA (miRNA)

miRNA是一類內(nèi)源性非編碼RNA，它廣泛存在于動(dòng)植物、真菌和病毒的基因組中，通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)的方法與靶基因的3’-UTR區(qū)互補(bǔ)，從而在轉(zhuǎn)錄后水平改變基因表達(dá)。miRNA在致癌和抑癌過(guò)程中扮演著至關(guān)重要的角色，不僅在細(xì)胞外的各種生物體液中極其穩(wěn)定，而且極易獲得，這些特征使miRNA成為了腫瘤診斷極具潛力的生物標(biāo)志物。

有研究揭示了肺癌患者組中miR-31的表達(dá)明顯高于健康對(duì)照組，該研究同時(shí)說(shuō)明miR-31高表達(dá)組患者的平均生存期（25.23月）比低表達(dá)組（38.44月）短[3]。另一項(xiàng)研究報(bào)道了miR-34家族可以有效地用于肺癌的診斷，其中miR-34a和miR-34c的過(guò)表達(dá)與無(wú)病生存期和總生存期相關(guān)[4]。有研究分析了90名肺癌患者和85例健康者血漿中miR-944和miR-3662的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)肺癌組中這些miRNA的表達(dá)比健康對(duì)照組升高，該研究同時(shí)說(shuō)明了這些miRNA在晚期肺癌中的表達(dá)更高[5]。

基于miRNA的非侵入性生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)具有重要前景，但開(kāi)發(fā)用于肺癌早期診斷的miRNA仍然面臨許多挑戰(zhàn)。首先，缺乏肺癌特異性miRNA，一種miRNA可能在多種癌癥的血清中高表達(dá)。其次，miRNA的提取及檢測(cè)過(guò)程需要規(guī)范化，包括樣品獲取和處理方法、檢測(cè)平臺(tái)及數(shù)據(jù)分析。用于肺癌早期診斷的miRNA相關(guān)臨床研究多為單中心研究，且樣本量偏少，導(dǎo)致研究結(jié)果的可重復(fù)性差，目前尚需大量臨床研究數(shù)據(jù)對(duì)miRNA早期診斷肺癌的特異性進(jìn)行論證。

2 循環(huán)腫瘤DNA

循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA,ctDNA）是壞死或凋亡的腫瘤細(xì)胞、循環(huán)腫瘤細(xì)胞和細(xì)胞外囊泡分泌釋放的腫瘤DNA片段，攜帶有突變、缺失、插入、拷貝數(shù)異常的特征，廣泛存在于體液中，包括血液、尿液、唾液等[6]。它除了有腫瘤特異性的分子特征外，在晚期腫瘤如乳腺癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌和胃食管癌組織中ctDNA水平也高于早期腫瘤。然而，ctDNA水平并不是簡(jiǎn)單地與腫瘤體積相關(guān)，而是在不同類型的腫瘤中存在差異[7]。此外，ctDNA既可來(lái)自原發(fā)腫瘤，也可來(lái)自轉(zhuǎn)移灶，因此ctDNA水平與腫瘤的病理狀態(tài)密切相關(guān)。由于ctDNA來(lái)源不同，與單一的存在一定風(fēng)險(xiǎn)的實(shí)體腫瘤組織活檢分析相比，液體活檢結(jié)合ctDNA分析可能更能反映腫瘤基因的多樣性，使其在癌癥患者的診斷和管理方面優(yōu)于組織活檢分析[8]。ctDNA提供了腫瘤患者的全景基因數(shù)據(jù)，可以同時(shí)反映腫瘤負(fù)荷水平和腫瘤對(duì)治療反應(yīng)的動(dòng)態(tài)變化，在腫瘤臨床診斷和治療中具有廣泛的應(yīng)用潛力。

一項(xiàng)多中心臨床研究納入了192例可手術(shù)的肺占位性病變患者，其中64%的癌癥患者處于Ⅰ期，對(duì)65個(gè)肺癌相關(guān)基因編碼區(qū)進(jìn)行基因測(cè)序，發(fā)現(xiàn)血漿ctDNA檢測(cè)特異性達(dá)到96%，但敏感度偏低[9]。ctDNA聯(lián)合臨床信息和血清生物標(biāo)志物后，敏感度提高到了80%，說(shuō)明血漿ctDNA可用于早期癌癥檢測(cè)，結(jié)合臨床信息可提高檢測(cè)性能。2018年報(bào)道了一種通過(guò)聯(lián)合循環(huán)蛋白質(zhì)水平和ctDNA突變來(lái)診斷八種常見(jiàn)癌癥的研究，該研究共入組104例肺癌患者，敏感度為59%[10]。目前ctDNA主要用于晚期癌癥的檢測(cè)，ctDNA應(yīng)用于肺癌早期診斷的臨床研究依然有限。

ctDNA在外周血中含量少，且容易與血漿蛋白結(jié)合，常規(guī)的提取效率不高。目前缺乏ctDNA樣本采集和提取的標(biāo)準(zhǔn)流程。近年來(lái)與ctDNA有關(guān)的研究主要集中在晚期癌癥，有研究顯示：ctDNA可以用來(lái)評(píng)估手術(shù)等治療后的預(yù)后[11]，監(jiān)測(cè)腫瘤早期復(fù)發(fā)，針對(duì)不同的基因突變制定個(gè)體化治療方案[12]。然而癌癥早期組織中ctDNA濃度偏低，缺乏相關(guān)的研究經(jīng)驗(yàn)[13]。ctDNA昂貴的經(jīng)濟(jì)成本也是其走向臨床的阻礙。

3 DNA甲基化

甲基化是核酸中一種重要的相對(duì)穩(wěn)定的修飾方式，通過(guò)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的作用，伴隨DNA的復(fù)制過(guò)程遺傳給子代DNA。研究表明大多數(shù)癌癥患者的基因組水平均有DNA甲基化的異常，這種異常是很多腫瘤發(fā)生的重要原因。DNA甲基化通常發(fā)生在基因啟動(dòng)子區(qū)域，在調(diào)控下游基因表達(dá)中起關(guān)鍵作用，異常的DNA甲基化通常發(fā)生在癌癥的早期階段，并在癌癥的發(fā)展過(guò)程中持續(xù)異常表達(dá)[14]。

早在20年前，Esteller等[15]用PCR法檢測(cè)了22名非小細(xì)胞肺癌患者腫瘤組織及血清樣本，有15例患者（68%）在腫瘤組織中檢測(cè)到至少有一種高甲基化（共四種研究基因），其中11例表現(xiàn)出血清DNA中的異常甲基化。2017年，Ooki等[16]建立了一個(gè)新的癌癥特異性甲基化基因組（共六種研究基因）用于早期非小細(xì)胞肺癌的診斷，在43例ⅠA期試驗(yàn)組和42例對(duì)照組中，該甲基化基因組敏感度為72%，特異性為71%。Hulbert等[17]篩選出3種DNA甲基化組聯(lián)合檢測(cè)用于肺癌的診斷，研究對(duì)象為CT圖像上有高危肺結(jié)節(jié)的患者（150例Ⅰ～Ⅱ期NSCLC和60例對(duì)照組），術(shù)前采集血漿和痰液，DNA甲基化組在血漿標(biāo)本中敏感度為98%，特異性為71%，相較于痰標(biāo)本，血漿標(biāo)本中的敏感度及特異性下降，該結(jié)論可能與肺癌特異性的侵襲模式——?dú)獾啦ド⒂嘘P(guān)，同時(shí)說(shuō)明了在無(wú)法獲得痰液的情況下，血漿可以替代痰液標(biāo)本進(jìn)行DNA甲基化檢測(cè)。

DNA甲基化檢測(cè)技術(shù)隨著表觀遺傳學(xué)及分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展得到了快速發(fā)展。高通量的檢測(cè)方法可以同時(shí)檢測(cè)更多位點(diǎn)的甲基化，DNA甲基化研究能夠提高早期肺癌的檢出率。制定規(guī)范的甲基化檢測(cè)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)有利于該技術(shù)進(jìn)一步的臨床應(yīng)用。由于DNA甲基化狀態(tài)的改變是可逆的，DNA去甲基化藥物將是未來(lái)研究的焦點(diǎn)[18]。

4 自身抗體

在腫瘤發(fā)病早期，異常表達(dá)的蛋白可刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生大量的抗體，即腫瘤相關(guān)自身抗體（tumor associated autoantibody,TAAB）。在無(wú)癥狀早期階段或影像學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)前，自身抗體（autoantibodies,AAbs）即可在患者的外周血中出現(xiàn)，這也提示通過(guò)檢測(cè)自身抗體可以在很早期發(fā)現(xiàn)癌癥。同時(shí)，自身抗體在外周血中穩(wěn)定性好，使用常規(guī)的酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)就可進(jìn)行抗體檢測(cè)，技術(shù)簡(jiǎn)便易行[19]。

單獨(dú)的自身抗體分子敏感度和特異性都偏低，因此采用自身抗體譜以提高肺癌診斷的敏感度和特異性。一項(xiàng)對(duì)1 600例高危患者（61例肺癌，1/3處于Ⅰ期）的統(tǒng)計(jì)研究發(fā)現(xiàn)，7種抗體譜（EarlyCDT-Lung: p53、CAGE、NY-ESO-1、SOX2、GBU4-5、MAGE A4和HuD）有高特異性，達(dá)到91%，但敏感度偏低，僅有37%[20]。EarlyCDT-Lung與CT影像具有一定的互補(bǔ)性，可聯(lián)合應(yīng)用于高危肺結(jié)節(jié)的管理。我國(guó)的七種自身抗體譜（p53、CAGE、GBU4-5、SOX2、MAGE-A1、PGP9 5、GAGE7）對(duì)早期肺癌也顯示出有較好的診斷效能。Ren等[21]開(kāi)展的多中心、大樣本的臨床研究顯示，對(duì)于Ⅰ、Ⅱ期非小細(xì)胞肺癌，7種抗體譜的敏感度分別為62%和59%，這些研究的敏感度遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)生物標(biāo)志物（包括CEA、NSE和CYFRA21-1）。值得關(guān)注的是，該研究說(shuō)明7種抗體譜聯(lián)合低劑量計(jì)算機(jī)斷層掃描顯著提高了肺結(jié)節(jié)患者的診斷率。

在肺癌的早期診斷領(lǐng)域，腫瘤抗體譜初步顯示出良好的特異性，但當(dāng)前腫瘤相關(guān)抗體譜的診斷效能還不夠理想，自身抗體譜的優(yōu)勢(shì)主要體現(xiàn)在與低劑量螺旋CT（LDCT）有效的互補(bǔ)。未來(lái)需要開(kāi)發(fā)出更多與肺癌相關(guān)的自身抗體，進(jìn)一步改進(jìn)抗體檢測(cè)的技術(shù)，以提高其在肺癌早期診斷領(lǐng)域的應(yīng)用價(jià)值。

5 循環(huán)腫瘤細(xì)胞

循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell,CTCs）是指原發(fā)或轉(zhuǎn)移性腫瘤組織流入血液循環(huán)的癌細(xì)胞，與腫瘤的轉(zhuǎn)移和增殖密切相關(guān)，在腫瘤診斷、管理和治療中有較好的應(yīng)用前景[22]。2018年的一項(xiàng)研究說(shuō)明了CTCs的檢測(cè)可用作篩查肺結(jié)節(jié)和診斷早期肺癌，聯(lián)合CTCs水平和CEA可顯著提高肺腺癌診斷的效能[23]。此外，2022年的研究納入了538例肺占位性病變患者，包括163例腺癌、71例鱗狀細(xì)胞癌和48例小細(xì)胞肺癌，證實(shí)了在不同組織類型的肺癌中，CTCs聯(lián)合血清生物標(biāo)志物的診斷模型能提高不同組織類型肺癌的診斷效率[24]。國(guó)內(nèi)的一項(xiàng)研究對(duì)CTCs陽(yáng)性患者進(jìn)行血清液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS）代謝組學(xué)分析，認(rèn)為CTCs的NGS檢測(cè)聯(lián)合代謝組學(xué)可能成為新的肺癌早期診斷腫瘤標(biāo)志物[25]。Ye等通過(guò)前瞻性研究構(gòu)建了結(jié)合CTC等多種指標(biāo)的早期肺癌預(yù)測(cè)模型，證實(shí)了應(yīng)用該模型可以早期診斷惡性結(jié)節(jié)患者[26]。

CTCs應(yīng)用于癌癥早期檢測(cè)的最大挑戰(zhàn)是極少數(shù)CTC細(xì)胞的富集，這些細(xì)胞通常以單個(gè)腫瘤細(xì)胞的形式存在于數(shù)百萬(wàn)血細(xì)胞中[27]。病灶的體積越小，血液中CTCs的數(shù)量就越少，從而導(dǎo)致CTCs對(duì)早期肺癌診斷的敏感度偏低。研究表明，肺腺癌患者的CTCs數(shù)目可能與原發(fā)腫瘤體積有關(guān)[28]。根據(jù)CTCs的物理和生物學(xué)特性，目前已有多種技術(shù)用于CTCs的富集，如免疫磁珠陰性富集、微流體裝置富集、基于形態(tài)學(xué)富集的膜過(guò)濾等[29]，仍需繼續(xù)開(kāi)發(fā)易于推廣的、可以有效提高CTCs檢測(cè)敏感度的技術(shù)及設(shè)備。

6 其他標(biāo)志物

揮發(fā)性有機(jī)化合物（volatile organic compounds,VOCs）診斷技術(shù)是一種方便快速、非侵入性的技術(shù)手段。VOCs是人體氧化應(yīng)激等代謝過(guò)程產(chǎn)生的內(nèi)源性化合物，可以通過(guò)多種技術(shù)捕獲和分析，包括氣相色譜/質(zhì)譜法（gas chromatography/mass spectrometry,GC/MS）、電子鼻（electronic nose,E-nose）、各種傳感器。2021年發(fā)表的一項(xiàng)研究[30]納入了47例肺結(jié)節(jié)患者，收集他們的CT圖像和VOCs數(shù)據(jù)，說(shuō)明聯(lián)合VOCs和CT檢查對(duì)肺癌進(jìn)行早期診斷可以達(dá)到97.3%的敏感度和100%的特異性。盡管現(xiàn)有的VOCs收集、富集、分析、統(tǒng)計(jì)技術(shù)都相對(duì)成熟，但目前仍缺乏單純分析VOCs的臨床研究。這主要是由于客觀條件制約下，VOCs采集及分析過(guò)程缺乏標(biāo)準(zhǔn)化。另一個(gè)重要原因是，哪些VOCs可以作為診斷標(biāo)志物鮮有共識(shí)。VOCs相較于其他檢測(cè)方法，起步較晚，但發(fā)展?jié)摿薮蟆?/p>

隨著核磁共振以及質(zhì)譜（mass spectrum,MS）等分析平臺(tái)的發(fā)展，肺癌的代謝組學(xué)相關(guān)研究也得以飛速進(jìn)展。代謝組學(xué)通過(guò)分析內(nèi)源性代謝物質(zhì)（中間或代謝終產(chǎn)物）在體液及組織內(nèi)的變化規(guī)律，提供了與肺癌發(fā)展及其微環(huán)境相關(guān)的代謝表型特征。代謝組學(xué)可檢測(cè)的生物樣本范圍廣泛，包括血液、痰液、尿液或呼出氣冷凝液。Xie等[31]進(jìn)行的研究提出結(jié)合代謝組學(xué)和機(jī)器學(xué)習(xí)方法來(lái)早期診斷肺癌，該研究也顯示了代謝生物組學(xué)對(duì)早期肺癌具有顯著的診斷能力。代謝組學(xué)研究的主要問(wèn)題在于目前檢測(cè)的代謝產(chǎn)物并非腫瘤特異性表達(dá)，由于個(gè)體差異性和機(jī)體內(nèi)環(huán)境的復(fù)雜性，缺乏足夠的機(jī)制研究證明代謝物與腫瘤之間的聯(lián)系。

7 總結(jié)

盡管現(xiàn)有的肺癌早期診斷方法具有巨大的潛力，但目前還沒(méi)有單一的肺癌早期診斷生物標(biāo)志物被常規(guī)用于臨床檢測(cè)。現(xiàn)有的部分生物標(biāo)志物可以在多種腫瘤中異常表達(dá)，缺乏肺癌特異性生物標(biāo)志物。對(duì)現(xiàn)有的生物標(biāo)志物進(jìn)行臨床驗(yàn)證和應(yīng)用尤為關(guān)鍵，但較開(kāi)發(fā)性研究和回顧性驗(yàn)證需要更多的資源和時(shí)間。不同的檢測(cè)方式各有優(yōu)缺點(diǎn)，需要進(jìn)一步從多維度比較各種診斷標(biāo)志物的優(yōu)缺點(diǎn)。通過(guò)不同方式整合有前景的生物標(biāo)志物并篩選出最合適的組合也是可行的研究方向。在精準(zhǔn)醫(yī)療時(shí)代，構(gòu)建大數(shù)據(jù)整合采集平臺(tái)，對(duì)已有的大量數(shù)據(jù)進(jìn)行深度挖掘，可能對(duì)生物標(biāo)志物的研究有所幫助。如何證明這些檢測(cè)方法的成本效益，獲得監(jiān)管機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)，這些也是在開(kāi)發(fā)及篩選分子生物標(biāo)志物時(shí)面臨的一系列挑戰(zhàn)。