桑蠶絲膠/柞蠶絲素/明膠基共混抗菌膜的制備及表征

陳文凱, 王 新, 冼俊思, 鐘楊生, 陳芳艷

(華南農業(yè)大學 動物科學學院,廣州 510642)

感染是導致傷口修復效率較低甚至失敗的主要原因[1-2],因此,開發(fā)具有抗菌、抗感染的多功能生物材料是生物醫(yī)學研究的持續(xù)目標。臨床上常利用膠原蛋白、絲素蛋白、殼聚糖等醫(yī)用生物材料作為基料,這些基料能夠在分子、細胞和個體水平上加速傷口的愈合,其降解產物為安全無毒的氨基酸、糖類等物質[3-5]。柞蠶絲素、桑蠶絲膠和明膠三種材料均具有良好的生物相容性、可降解性和成膜性,有利于細胞的黏附和增殖,安全無毒而且來源廣泛。三種材料各有獨特的優(yōu)勢,明膠(GEL)是膠原蛋白水解產物,含有亞氨基、醛基等活性極強的基團,易發(fā)生交聯(lián),成膜性好,但其力學強度低,需與其他材料復合使用[6-8]。柞蠶絲素蛋白由于富含天然的精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸(RGD)三肽序列,特別有利于動物細胞的黏附和生長[9-11]。與絲素蛋白相比,絲膠蛋白含親水性氨基酸較多,具有較強的吸水能力,可防止水分流失,具有促進膠原增殖和遷移的能力,并且對革蘭氏陽性菌和陰性菌均有較理想的抑菌效果[12-14]。由于絲素、絲膠中絲氨酸的醇羥基、酪氨酸的酚羥基、賴氨酸的氨基、組氨酸的咪唑基等都具有活潑H的基團,可通過與聚乙二醇、戊二醛等交聯(lián)劑交聯(lián)成具有一定力學性能的生物材料[15-17]。雖然戊二醛交聯(lián)效果好,但是它有基因毒性和誘變的潛在危害[18],相比之下,聚乙二醇在安全性方面更有優(yōu)勢[19]。

抗菌性能對生物基材料的應用十分重要。然而,大多數(shù)的生物基材料本身不具備抗菌性能或抗菌能力較弱,因此,通過不同的抗菌劑修飾,可以有效提高生物材料的抗菌性能。目前用于制備抗菌生物材料的抗菌劑主要有黃酮類、多酚類、蒽醌類、季銨鹽類、抗生素類及溶菌酶等有機抗菌劑[20-23]和Ag、Zn、TiO2、石墨烯等無機抗菌劑[24-27]。醫(yī)藥領域的生物抗菌材料更趨向于選擇具有優(yōu)異抗菌殺菌能力、不產生耐藥性、進而能夠廣譜抗菌、生物低毒/無毒的抗菌劑[28]?？咕?Antimicrobial peptides,AMPs)是一類相對分子質量小的多肽,作為天然高效抗菌劑,是替代傳統(tǒng)抗生素最有潛力的新型藥物[29-30]。它具有抗菌譜廣、特異性高、耐藥性極低的特點,對多種耐藥菌具有殺傷作用,而且熱穩(wěn)定性和水溶性好,對高等動物的正常細胞幾乎無毒害作用,在生物醫(yī)藥領域具有一定的優(yōu)勢[31]。

因此,本研究選用柞蠶絲素蛋白、明膠和桑蠶絲膠蛋白作為生物膜的基材,以聚乙二醇為交聯(lián)劑,首先探討桑蠶絲膠/柞蠶絲素/明膠基共混膜的制備方法,并通過單因素和正交試驗優(yōu)化配方,在此基礎上,通過吸附的方式載入AMPs,獲得抗菌生物膜。本研究拓寬了蠶絲的應用領域,可為蠶絲蛋白在生物敷料等醫(yī)用抗菌生物材料研制和開發(fā)提供新的途徑。

1 試 驗

1.1 材料及儀器

材料:柞蠶繭殼(遼寧省蠶業(yè)科學研究所),桑蠶繭殼(華南農業(yè)大學蠶絲科學系),抗菌肽(Mw=2 512 Da)(華南農業(yè)大學蠶絲科學系蠶桑資源利用實驗室),活性檢測指示菌希埃氏大腸桿菌(K12D31)、金黃色葡萄球菌(SA)(華南農業(yè)大學蠶絲科學系蠶桑資源利用實驗室)。

試劑:硝酸鈣和明膠(廣州化學試劑廠),碳酸鈉(天津大茂化學試劑廠),聚乙二醇200(PEG 200)(廣州金華大化學試劑有限公司),無水乙醇(乙醇含量≥99.7%)(上海凌峰化學試劑有限公司),均為分析純;透析袋(Mw=8～10 kDa)(上海源葉生物科技有限公司)。

儀器:AGS-X型萬能機械測試機(日本Shimadzu公司),VERTEX型傅里葉變換紅外光譜儀(德國BRUKER公司),XRD-6100型X-射線衍射儀(日本Shimadzu公司),XL-30-ESEM型掃描電子顯微鏡(荷蘭FEI公司),UV-1800型紫外分光光度計(日本Shimadzu公司)。

1.2 方 法

1.2.1 桑蠶絲膠溶液的制備

稱取桑蠶繭殼10 g,置于500 mL圓底燒瓶中,然后加入120 mL蒸餾水,于100 ℃冷凝回流提取30 min后過濾,收集濾液,得到質量濃度為4.50 μg/mL絲膠溶液,4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 柞蠶絲素溶液的制備

稱取柞蠶繭殼10 g,置于含500 mL 1% Na2CO3的燒杯中,于100 ℃的條件下攪拌15 min;脫膠結束后,用60 ℃蒸餾水沖洗干凈,以上過程重復3次,得到脫膠柞蠶絲素;最后將其在75 ℃條件下干燥2.5 h,扯松,獲得網(wǎng)狀絲素纖維。然后,參照肖露等[33]的方法制備柞蠶絲素溶液。首先稱取180 g的硝酸鈣于燒杯中,80 ℃下攪拌30 min后,得到熔融的硝酸鈣,用量筒量取100 mL熔融的硝酸鈣,置于圓底燒瓶中;然后加入10 g剪碎的柞蠶絲素纖維,放置于油浴鍋中,加熱到120 ℃并攪拌2 h,得到柞蠶絲素溶液,待其冷卻后,裝入截留相對分子質量為8～10 kDa的透析袋中,透析除鹽,得到質量濃度為27.5 mg/mL柞蠶絲素溶液,置于4 ℃下儲藏備用。

1.2.3 蛋白質含量的測定

按Bradford法測定絲膠蛋白和絲素蛋白的含量[33],并以牛血清白蛋白為標準蛋白質。

1.2.4 桑蠶絲膠/柞蠶絲素/明膠基(BS-TSF-GEL)共混膜制備單因素試驗

稱取3.6 g明膠粉末,加入到6.4 mL蒸餾水中,磁力攪拌至完全溶解,配制溫度為60 ℃,靜置除去氣泡,制得質量濃度為360 mg/mL的明膠溶液。量取一定體積的桑蠶絲膠(4.50 μg/mL)、柞蠶絲素(27.5 mg/mL)、明膠(360 mg/mL)溶液和聚乙二醇200(質量分數(shù)100%)交聯(lián)劑,室溫下混合均勻后,取5 mL混合液倒入直徑6 cm的培養(yǎng)皿中,在溫度為30 ℃的條件下,放置48 h,成膜后浸泡于一定質量分數(shù)的乙醇中處理24 h,在通風櫥中自然干燥即可得到BS-TSF-GEL共混膜。設置單因素試驗考察絲膠、絲素、聚乙二醇、明膠溶液的添加量對共混膜溶失率的影響。

1)桑蠶絲膠與柞蠶絲素體積比對BS-TSF-GEL共混膜溶失率的影響。將絲膠與絲素溶液分別按體積比3︰0、2.5︰0.5、2︰1、1.5︰1.5、1︰2、0.5︰2.5、0︰3的比例混合,得到體積比不同的絲膠/絲素混合液,分別取3 mL不同體積比的絲膠/絲素混合液于燒杯中,再依次加入3 mL聚乙二醇200和1.5 mL明膠溶液,固定絲膠/絲素混合液占整個體系的比例為40%。成膜后測定不同絲膠、絲素體積比對共混膜溶失率的影響。

2)聚乙二醇200添加量對BS-TSF-GEL共混膜溶失率的影響。依次吸取0.000、0.500、1.125、1.930、3.000、4.500、6.750 mL的聚乙二醇200于燒杯中,然后加入3 mL體積比為2︰1的絲膠/絲素混合液,1.5 mL明膠溶液,使聚乙二醇200占整個體系的比例分別為0、10%、20%、30%、40%、50%、60%。成膜后測定聚乙二醇200添加量對共混膜溶失率的影響。

3)明膠添加量對BS-TSF-GEL共混膜溶失率的影響。依次吸取0.00、0.32、0.67、1.06、1.50、2.00、2.57 mL明膠溶液于燒杯中,再依次加入3 mL體積比為2︰1的絲膠/絲素混合液,3 mL聚乙二醇200,使明膠溶液占整個體系的比例為0、5%、10%、15%、20%、25%、30%。成膜后測定明膠添加量對共混膜溶失率的影響。

1.2.5 BS-TSF-GEL共混膜制備的正交試驗

根據(jù)上述單因素試驗結果,綜合考察絲膠與絲素體積比、聚乙二醇200和明膠添加量三因素對BS-TSF-GEL共混膜溶失率的影響,設計L9(33)正交試驗,如表1所示。

表1 正交試驗因素與水平Tab.1 Orthogonal test factors and levels

1.2.6 乙醇質量分數(shù)對BS-TSF-GEL共混膜溶失率的影響

取6塊上述最優(yōu)配方條件下制備的BS-TSF-GEL膜,分別置于質量分數(shù)為60%、70%、80%、90%、100%的乙醇中浸泡24 h后取出,待乙醇揮發(fā)后,測定共混膜的溶失率。

1.2.7 BS-TSF-GEL共混膜溶失率測試方法

溶失率的測定參考謝瑞娟等[34]的方法,并作適當改進。將采用同一方法制備的膜平分為質量相同的兩份,一份在100 ℃的烘箱中烘至恒重后,在50%相對濕度下平衡48 h,稱取質量(Wi);另一份在37 ℃的PBS中以1 (g)︰30 (mL)的浴比振蕩1 h,收集余膜,置于100 ℃烘箱中烘至恒重,50%相對濕度下平衡48 h后,稱取質量(Wt)。溶失率測試重復3次,溶失率(R)計算公式如下:

(1)

式中:Wi為初始樣品的干重,g;Wt為樣品溶失率測試結束后的干重,g。

1.2.8 掃描電子顯微鏡(SEM)分析

將BS-TSF-GEL膜切割成5 mm×5 mm大小,臨界點干燥,放置在導電膠上,然后覆蓋金薄層。使用掃描電子顯微鏡對BS-TSF-GEL膜的微觀形貌進行分析。

1.2.9 拉伸性能測試

將BS-TSF-GEL共混膜切割成20 mm×10 mm大小,厚度為3.2 mm的標準長條形試樣,在50%的相對濕度下平衡48 h,按照GB/T 1040—2006《塑料 拉伸性能的測定》標準,使用萬能材料試驗機以10 mm/min的恒定速率進行拉伸測試。

1.2.10 傅里葉變換紅外光譜(FTIR)測試

利用傅里葉變換紅外光譜儀的ATR附件,以空氣為背景測定BS-TSF-GEL膜的紅外光譜。掃描范圍400～4 000 cm-1,分辨率為4 cm-1,掃描次數(shù)16次。用OPUS軟件對波數(shù)在1 600～1 700 cm-1內的圖譜進行剪切,之后進行二階求導,作為分峰位置的參照;再退卷積處理,各子峰的峰位由二階導數(shù)圖譜確定;再對圖譜進行譜線擬合,得到曲線擬合數(shù)值,統(tǒng)計α螺旋、無規(guī)卷曲、β折疊和β轉角結構含量。

1.2.11 X-射線衍射分析(XRD)

利用日本島津XRD-6100型射線衍射儀測定BS-TSF-GEL共混膜的X射線衍射譜。參數(shù)設定:管電流40 mA,管電壓40 kV,銅靶,λ=15.406 nm,掃描范圍2θ=5°～45°,掃描速度3 (°)/min。

1.2.12 BS-TSF-GEL共混抗菌膜的制備

將BS-TSF-GEL共混膜分別浸泡于質量分數(shù)為0.062 5%、0.125 0%、0.250 0%、0.500 0%、1.000 0%的抗菌肽溶液中,30 min后取出,用蒸餾水將吸附在膜表面的抗菌肽沖洗干凈,風干后獲得抗菌膜。

1.2.13 抗菌性能測試

采用Kirby-Bauer擴散法[35]對載有抗菌肽的BS-TSF-GEL共混膜進行抗菌能力評價。以革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌SA)和革蘭氏陰性菌(希埃氏大腸桿菌K12D31)為指示菌。

將滅菌后的LB培養(yǎng)基置于室溫,待其冷卻至48～50 ℃時,向100 μL無菌LB培養(yǎng)基中加入8 μL濁度為1×108cfu/mL的菌液(金黃色葡萄球菌SA或希埃氏大腸桿菌K12D31),搖勻。吸取含菌LB培養(yǎng)基15 mL,均勻攤平在60 mm培養(yǎng)皿底部,放置在超凈工作臺的臺面上使其冷卻凝固后,將直徑為2.5 mm的抗菌膜鋪在LB培養(yǎng)基表面,靜置30 min后,于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中,倒置培養(yǎng)過夜,觀察并用游標卡尺測量抑菌圈直徑,記錄數(shù)據(jù)。

1.2.14 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2007整理后,用SPSS 24.0軟件完成統(tǒng)計,得到平均數(shù)±標準差(X±S)。

2 結果與分析

2.1 BS-TSF-GEL共混膜制備

2.1.1 BS-TSF-GEL共混膜制備的單因素條件優(yōu)化

溶失率通常用來評價生物醫(yī)學材料在體內和體外的穩(wěn)定性[36-37]。本試驗首先設置了7個體積比不同的絲膠/絲素混合液制備共混膜,探究絲膠/絲素溶液體積比對共混膜溶失率的影響,結果如圖1所示。

圖1 桑蠶絲膠/柞蠶絲素體積比對BS-TSF-GE共混膜溶失率的影響Fig.1 Effect of volume ratio of bombyx mori sericin and tussah silkfibroin on the dissolution rate of BS-TSF-GE blended films

當絲膠與絲素體積比低于2︰1時,膜的溶失率保持在65%左右,變化不大;當絲膠與絲素體積比達到2︰1后,繼續(xù)增加柞蠶絲素溶液比例,共混膜的溶解率開始隨著絲素含量的增加而提高,這一變化趨勢與馬芳等[15]研究結果一致。這是因為絲素分子之間主要以氫鍵結合,在水溶液中絲素大分子之間的氫鍵易被水與絲素大分子形成的氫鍵取代,所以容易溶解[36]。因此,考慮柞蠶絲素在細胞促生長方面優(yōu)異的生物學特性,本研究將絲膠與絲素體積比確定為2︰1。

在確定絲膠與絲素體積比后,考察聚乙二醇200添加量對共混膜溶失率的影響,結果如圖2所示。由圖2可知,隨著聚乙二醇200添加量的增加,共混膜的溶失率呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢。當聚乙二醇200添加量為40%時,共混膜的溶失率最低(63.44%)。聚乙二醇的兩個活潑羥基容易與絲素、絲膠的氨基酸殘基中的活潑基團發(fā)生交聯(lián)反應,從而增加共混膜的穩(wěn)定性[36]。但聚乙二醇200添加到一定量后,膜的溶失率上升,這可能是由于聚乙二醇較強的親水性所致。因此,聚乙二醇200添加40%較為適宜。

圖2 聚乙二醇200添加量對BS-TSF-GE共混膜溶失率的影響Fig.2 Effect of polyethylene glycol 200 concentration on thedissolution rate of BS-TSF-GE blended films

探究明膠添加量對共混膜溶失率的影響,結果如圖3所示。共混膜的溶失率隨著明膠添加量的增大呈現(xiàn)顯著降低,最后趨于穩(wěn)定。當明膠溶液添加量為20%時,溶失率為61.74%。由于絲素和絲膠的等電點低于7.0,而明膠等電點大于7.0,在pH 7.0的環(huán)境中,絲膠、絲素和明膠帶相反的電荷,正負電荷相互作用,有利于交聯(lián)[38]。

圖3 明膠添加量對BS-TSF-GE共混膜溶失率的影響Fig.3 Effect of gelatin concentration on the dissolutionrate of BS-TSF-GE blended films

2.1.2 BS-TSF-GEL共混膜制備的正交試驗條件優(yōu)化

通過設置正交試驗進一步優(yōu)化BS-TSF-GEL共混膜各組分間的配比,正交試驗結果如表2所示。從表3的極差分析可知,3個因素影響B(tài)S-TSF-GEL共混膜溶失率的主次為:桑蠶絲膠與柞蠶絲素體積比(A)>PEG 200質量分數(shù)(B)>明膠質量分數(shù)(C)。對應的最優(yōu)配方是A2B3C2,即體積比為2︰1的絲膠/絲素溶液、聚乙二醇200、明膠溶液,它們分別占總體系的35%、40%和25%。為了進一步驗證最佳組合A2B3C2的真實性,進行了3次重復表征試驗,BS-TSF-GEL共混膜的平均溶失率為(59.19±1.23)%。

表2 正交試驗結果Tab.2 Orthogonal test results

表3 極差分析結果Tab.3 Range analysis results

2.2 BS-TSF-GEL共混膜穩(wěn)定性及拉伸性能優(yōu)化

現(xiàn)有的研究表明,乙醇處理可有效改善絲素蛋白結構和功能特性,同時,乙醇是對絲素蛋白材料水不溶性處理的有效手段[15,39]。為進一步提高BS-TSF-GEL共混膜的穩(wěn)定性,本研究將膜浸入不同質量分數(shù)乙醇中浸泡處理,對膜的性能進行優(yōu)化,檢測膜的溶失率,結果如圖4所示。

圖4 不同質量分數(shù)乙醇處理對BS-TSF-GEL膜溶失率的影響Fig.4 Effect of different concentrations of ethanol treatment onthe dissolution rate of BS-TSF-GEL blended films

由圖4可知,隨著乙醇質量分數(shù)升高,溶失率呈現(xiàn)下降趨勢;但溶失率下降的幅度隨著乙醇質量分數(shù)的增加而變小,當乙醇質量分數(shù)達到90%時,繼續(xù)增加乙醇質量分數(shù)膜的溶失率下降不顯著。這可能是因為經(jīng)過一定質量分數(shù)的乙醇處理后共混膜中蛋白大分子的結構趨向穩(wěn)定,此后膜的溶失率隨乙醇質量分數(shù)變化很小。乙醇質量分數(shù)為100%時,溶失率為34.62%,與未經(jīng)乙醇處理的共混膜相比,膜溶失率降低了24.57%。

測定60%～100%乙醇處理后的BS-TSF-GEL共混膜的力學性能,結果如圖5所示。隨著乙醇質量分數(shù)的升高,膜的斷裂伸長率逐漸減小,斷裂強度逐漸增加。乙醇質量分數(shù)為100%時,膜的斷裂強度最高,為578.8 kPa,此時斷裂伸長率可達到34.15%,優(yōu)于桑蠶絲的平均斷裂伸長率(15%～25%)。因此,選擇100%為最優(yōu)處理質量分數(shù),由于乙醇可以增強蛋白大分子多肽鏈之間的部分氫鍵和范德華力,誘導蛋白質從α螺旋和無規(guī)則卷曲向β折疊構象的轉變[39],從而使共混膜的斷裂強度得到提高。

圖5 乙醇質量分數(shù)對BS-TSF-GEL共混膜的拉伸性能Fig.5 Effect of ethanol mass fraction on the tensile propertiesof BS-TSF-GEL blended films

2.3 BS-TSF-GEL共混膜的形貌及結構

BS-TSF-GEL共混膜外觀形貌如圖6(a)所示,可見共混膜外觀均勻,呈淡黃色,無相分離現(xiàn)象,手感順滑柔軟,富有彈性。BS-TSF-GEL共混膜的微觀形貌如圖6(b～c)所示,可見共混膜表面存在微小的孔隙。有研究認為,膜的表面孔隙可以增大吸附的比表面積,提高載藥量,吸收傷口滲出液,促進傷口愈合[17]?？紫洞笮?、分布、孔隙率的多少,以及添加PEG和乙醇處理對孔隙的影響有待于今后開展深入的研究。

圖6 BS-TSF-GEL共混膜的形貌Fig.6 Morphology of BS-TSF-GEL blended films

進一步地,采用傅里葉紅外光譜(FTIR)法分析共混膜的二級結構。FTIR光譜法可量化蛋白質的二級結構,酰胺Ⅰ帶對研究蛋白質的二級結構最有價值[40]。酰胺Ⅰ帶中1 610～1 640 cm-1譜峰屬于β折疊,1 640～1 650 cm-1譜峰屬于無規(guī)卷曲,1 650～1 660 cm-1譜峰屬于α螺旋,1 660～1 700 cm-1譜峰屬于β轉角[41]。BS-TSF-GEL共混膜的傅里葉紅外光譜如圖7(a)所示。BS-TSF-GEL共混膜在1 630 cm-1處有很強的吸收峰,這是β折疊結構的特征吸收峰膜;1 647 cm-1有一個較弱的吸收峰,這是無規(guī)卷曲的特征吸收峰;1 662、1 678 cm-1和1 692 cm-1處的吸收峰歸屬于β轉角結構。

將傅里葉自去卷積應用于共混膜的酰胺Ⅰ帶,以確定其二級結構的含量[41],自去卷積結果如圖7(b)所示。BS-TSF-GEL共混膜主要以β折疊為主,其相對含量高達37.29%,α螺旋/無規(guī)卷曲的相對含量為14.67%,β轉角的相對含量為27.77%。FTIR結果表明,BS-TSF-GEL共混膜由β折疊、α螺旋/無規(guī)卷曲、β轉角結構組成,且以β折疊為主,屬于Silk Ⅱ結晶構型。通常純絲素膜的構象主要以α螺旋和無規(guī)卷曲結構為主,是典型的Silk Ⅰ結晶構型[41]。因此,可以推斷,PEG 200與蛋白大分子發(fā)生了相互作用,加之乙醇的后處理進一步促進了共混膜內分子鏈之間形成了β折疊結構。乙醇浸入共混膜內,破壞了共混膜中原有的氫鍵,分子鏈段發(fā)生重排形成了更加穩(wěn)定的蛋白質氫鍵,從而誘導β折疊分子構象的形成[39]。

圖7 BS-TSF-GEL膜的二級結構Fig.7 Secondary structure of BS-TSF-GEL blended films

為驗證BS-TSF-GEL共混膜的構象,對共混膜做了X-射線衍射分析,BS-TSF-GEL共混膜的XRD圖譜如圖8所示。Silk Ⅰ(α螺旋和β轉角)的衍射主要出現(xiàn)在12.2°、19.7°、24.7°、28.2°、32.3°、36.8°和40.1°;Silk Ⅱ(β折疊)的衍射主要出現(xiàn)在9.10°、18.9°、20.7°、24.3°和39.7°[42]。BS-TSF-GEL共混膜在2θ=24.49°附近出現(xiàn)了很強的衍射峰,表明BS-TSF-GEL共混膜以β折疊結構為主,結晶結構為Silk Ⅱ型。而在2θ=40.97°附近出現(xiàn)了一個弱而寬的“饅頭峰”,說明BS-TSF-GEL膜有少量的Silk Ⅰ結構存在。XRD測試結果表明,BS-TSF-GEL共混膜以Silk Ⅱ為主,并有少量的Silk Ⅰ結構存在,該結果與FTIR結果一致。相對于Silk Ⅰ和無定型結構,Silk Ⅱ結構更加穩(wěn)定,BS-TSF-GEL共混膜的這種結構使其在溶失率較低的同時機械性能也較好。

圖8 BS-TSF-GEL共混膜的X-射線衍射圖譜Fig.8 X-ray diffraction pattern of BS-TSF-GEL blended films

2.4 負載抗菌肽BS-TSF-GEL共混膜的抗菌性能

用抑菌圈大小評價BS-TSF-GEL共混膜的抑菌效果和負載能力,BS-TSF-GEL共混膜抑菌性能如圖9和表4所示。

圖9 載有抗菌肽的BS-TSF-GEL共混膜平板抑菌圈Fig.9 Plate inhibition zone of BS-TSF-GEL blended films loaded with antimicrobial peptides

表4 BS-TSF-GEL共混抗菌膜的抑菌圈直徑Tab.4 Diameter of inhibition zone of BS-TSF-GELblended antibacterial biofilms

由圖9可見,在共混膜的周圍會形成透明的抑菌圈,隨著抗菌肽質量分數(shù)的增加,抑菌圈增大,當抗菌肽質量分數(shù)達到1.0%時,對金黃葡萄球菌(革蘭氏陽性菌)的抑菌圈直徑為3.93 mm,對大腸桿菌(革蘭氏陰性菌)的抑菌圈直徑為3.55 mm(表4),說明BS-TSF-GEL共混膜對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有較好的抑菌效果,同時也表明共混膜對抗菌肽有較強的負載能力。這主要是因為抗菌肽(正電荷)能夠以靜電吸附的方式,負載到帶有負電荷的絲素和絲膠共混膜中[28,38]。

此外,作為對照,沒有負載抗菌肽的BS-TSF-GEL共混膜周圍也觀察到一點點的透明圈,說明未負載抗菌肽的共混膜也有微弱的抑菌作用,這是由于共混膜中絲膠蛋白本身具有良好的抗菌性能。研究表明絲膠蛋白可以改變細菌形狀,破壞細菌細胞膜,導致細胞內容物外泄而發(fā)揮抑菌作用[12]。共混膜負載抗菌肽后,其抗菌效果增強。

3 結 論

采用柞蠶絲素蛋白、明膠和桑蠶絲膠蛋白作為生物膜的基材,以聚乙二醇200作為交聯(lián)劑成功制備共混膜;利用乙醇對共混膜進行改性,提高其強度和結晶度;通過負載抗菌肽獲得抗菌效果。制備的共混抗菌膜穩(wěn)定性好,溶失率34.62%,斷裂伸長率34.15%,斷裂強度578.8 kPa,對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均具有良好的抑菌效果。BS-TSF-GEL共混抗菌膜在生物醫(yī)用材料領域具有明顯的優(yōu)勢,本研究為蠶絲蛋白的應用探索了新的途徑。

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