病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)研究進展

康立茹，王 永，楊永峰，高 婧，董 婧，王黎勝，劉 燕*

(1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031；2.烏拉特中旗水利局，內(nèi)蒙古 烏拉特中旗 015300；3.烏海市農(nóng)業(yè)發(fā)展中心，內(nèi)蒙古 烏海 016000;4.呼倫貝爾市農(nóng)畜產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，內(nèi)蒙古 呼倫貝爾 021000)

隨著許多作物全基因組測序工作的完成，從反向遺傳學(xué)角度，即根據(jù)已知序列克隆相關(guān)基因，利用生物技術(shù)從基因缺失和基因獲得兩個互補的方面研究基因的功能，已經(jīng)成為近年來基因功能研究的主要策略。這一策略的基礎(chǔ)大多是要蛋白組或者轉(zhuǎn)錄組等高通量測序技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)的分析，首先獲得不同時間點、不同植物組織等處理下基因的表達譜，篩選出與處理直接相關(guān)的目標基因，再進行功能驗證。

1 VIGS 技術(shù)的機制及發(fā)展

病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù) （VIGS,Virus-induced gene silencing）正如字面意思一樣，病毒作為異源的核酸，在其侵染植物時，會被植物識別，而后啟動一系列的調(diào)控機制來降解病毒的RNA。 研究人員根據(jù)這一原理，改造病毒載體，使其攜帶目的基因cDNA 后侵染植物，病毒RNA 在復(fù)制過程中會與植物轉(zhuǎn)錄后自身的RNA 配對形成雜合的雙鏈RNA（double stranded RNA, dsRNA），植物細胞會識別這種錯誤的dsRNA，并啟動特異性核酸內(nèi)切酶Dicer 類似物對其進行切割，最終形成21～23 nt 大小的小干擾RNA（Small interfering RNA，siRNA）[1]，siRNA、 植物靶基因翻譯后形成的單鏈 RNA、Agronaute1（AGO1）蛋白等結(jié)合形成RNA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex，RISC）[2]，最終通過特異性降解轉(zhuǎn)錄過程中的靶基因的RNA 序列而達到基因沉默的目的，屬于轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默（Post-transcriptional gene silencing，PTGS）[3]。

病毒作為VIGS 技術(shù)中的重要載體，最早科研人員主要圍繞RNA 病毒進行研究，涉及作物主要有本氏煙、 番茄等。 Kumagai MT 用煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus, TMV）作為侵染載體，使其攜帶PDS 目標基因cDNA 反義鏈，侵染煙草后，葉片出現(xiàn)白化。自此以后大量的研究都證明了煙草脆裂病毒（Tobacco rattle virus, TRV） 是植物病毒中寄主范圍最廣的病毒，可以對50 多個雙子葉和單子葉植物中的400 多個品種造成侵染，當(dāng)然很多寄主侵染而不引起癥狀。TRV 病毒作為VIGS 載體的體系不斷探索和建立，Ratcliff F 等[4]證明了TRV 可以用于本氏煙中基因功能研究，可造成系統(tǒng)侵染，且不會造成病毒癥狀；Liu Y 等[5]利用TRV 病毒載體成功侵染番茄植株，致使番茄中PDS、CTR1 和CTR2 三個基因沉默，同時該病毒還可侵染番茄果實，導(dǎo)致基因沉默[6]；Chung E[7]首次用TRV 侵染辣椒葉片，PDS 沉默后葉片出現(xiàn)光漂白現(xiàn)象，證明了該技術(shù)可用于辣椒中基因功能研究；此外該技術(shù)同樣成功應(yīng)用在矮牽牛[8]、草莓[9]等作物中。

病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)中應(yīng)用的病毒載體除了煙草脆裂病毒TRV 以外，另外涉及的病毒載體還有很多，如Ruiz MT 等構(gòu)建帶有本氏煙PDS 基因cDNA 序列的馬鈴薯X 病毒 （potato virus X,PVX）[10]載體，侵染煙草后植株出現(xiàn)光漂白現(xiàn)象，并能造成系統(tǒng)性基因沉默。 Faivre-Rampant O 等[11]研究表明，PVX 可誘導(dǎo)二倍體和四倍體馬鈴薯中的PDS 基因沉默而使馬鈴薯葉片出現(xiàn)光漂白的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象在多代擴繁的組培苗和微型薯塊中都可觀察到。此外豌豆早枯病毒（Pea early browning virus，PEBV）[12]、大麥條紋花葉病毒（Barley stripe mosaic virus，BSMV)[13]等VIGS 載體均被研究和應(yīng)用，突破VIGS 技術(shù)因作物種類和病毒類型所限，而被廣泛應(yīng)用于多種作物對相應(yīng)處理中某個或某些基因功能的研究中。

2 VIGS 技術(shù)在植物抗病基因功能研究中的應(yīng)用

根據(jù)目前報道，VIGS 是鑒定植物基因功能的主要工具，應(yīng)用領(lǐng)域涉及番茄、茄子、棉花、黑麥、小麥等多種植物的抗病基因、代謝和發(fā)育相關(guān)基因、逆境脅迫，還有花色花香相關(guān)基因的研究工作，其中植物抗病基因功能研究是應(yīng)用最多的領(lǐng)域之一。

黃賽花等[14]利用VIGS 技術(shù)對大豆抗大豆花葉病毒（SMV）候選基因Gm Z15 進行功能分析，認為該基因正向調(diào)控大豆對SMV 的抗性。 石嶸[15]分析油菜與黑莖病菌互作的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，得到抗病相關(guān)基因WRKY70 和LRR-RLK，并利用VIGS 技術(shù)進行了功能驗證，認為基因沉默后植株葉片病斑面積變大，褪綠發(fā)黃更明顯。李雪瑩[16]利用TRV-VIGS 技術(shù)研究了CmWRKY15-1 基因在菊花抗白色銹病中的功能，證明了CmWRKY15-1 基因沉默后會抑制SA 通路相關(guān)基因的表達，也參與SA 合成，從而調(diào)控菊花對白色銹病的響應(yīng)。Zhou X 等[17]將VIGS 技術(shù)應(yīng)用于番茄抗病基因中功能的研究中，沉默掉SlTPR2 和SlTPR4兩個基因后，植株更感病。

就VIGS 技術(shù)在馬鈴薯中的應(yīng)用來講，相關(guān)研究主要有，2001 年Takken 等[18]利用灌根法成功沉默馬鈴薯PB7 基因，并在接種后20 d 左右觀察到癥狀。2004 年，F(xiàn)aivre-Rampant O 等[19]利 用 馬 鈴 薯X 病 毒（PVX）作為VIGS 載體，在四倍體和二倍體馬鈴薯組培苗中成功沉默PDS 基因，白化癥狀可以在無性繁殖中連續(xù)多代存在，并且在微型薯中也可觀察到。 隨后張曉蘿[20]優(yōu)化了VIGS 技術(shù)在馬鈴薯中的接種方法，并比較了品種差異對VIGS 效率的影響，同時利用該方法證明了StRac 基因在馬鈴薯抗晚疫病過程中是正向調(diào)控因子。 田再民[21]也用VIGS 方法研究馬鈴薯StRab5b、StRab 兩個基因在抗晚疫病中的功能，基因沉默后葉片病斑面積更大。

VIGS 技術(shù)在植物與黃萎病互作基因功能研究中的應(yīng)用也有大量報道，在棉花抗黃萎病相關(guān)基因 GhVe1、GbVe1、G hNDR1、Gb CAD1、GhMKK2、GhBAK1、GhEDS1、GhSKIP35 和 GhMLP28、GhB2、GbCRK18 等[22-24]，經(jīng)過驗證有些基因沉默后植株抗性增加，也有些基因沉默后會使植株抗性降低，即基因調(diào)控棉花對大麗輪枝菌的抗性呈正負兩個方向。當(dāng)然，相關(guān)研究主要集中在棉花這種作物上，關(guān)于馬鈴薯與黃萎病互作基因功能的研究未見報道。