基于IL-4/STAT6通路研究吳茱萸次堿對特應(yīng)性皮炎模型小鼠的改善作用*

頓耿，祁相煥，吳德福，臧馥蘭，王哲新

開封市人民醫(yī)院，河南 開封 475000

特應(yīng)性皮炎又稱遺傳過敏性皮炎，是一種慢性非特異性皮膚炎癥，好發(fā)于兒童，主要表現(xiàn)為瘙癢、皮膚干燥和濕疹，嚴重影響患者的生活質(zhì)量[1]。吳茱萸次堿是一種吲哚喹唑啉類生物堿，提取自傳統(tǒng)中藥吳茱萸。研究發(fā)現(xiàn)，吳茱萸次堿具有廣泛的藥理學活性，可通過調(diào)節(jié)免疫失衡、降低氧化應(yīng)激反應(yīng)保護局灶性腦缺血腦組織損傷[2]，口服吳茱萸次堿可激活抗氧化酶保護乙酰氨基酚誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷，改善肝功能[3]，吳茱萸堿衍生物還可通過抑制核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體3(nucleotides bind to oligomeric domain-like receptor 3，NLRP3)炎癥體相關(guān)炎癥因子調(diào)節(jié)膽固醇轉(zhuǎn)運，從而減輕動脈粥樣硬化[4]。輔助性T淋巴細胞1(T-helper 1，Th1)/Th2細胞亞群功能失衡是特應(yīng)性皮炎發(fā)病的主要原因之一，白細胞介素-4(interleukin-4，IL-4)是誘導(dǎo)Th2細胞分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，也是Th2細胞的特征性細胞因子，而信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子6(signal transducer and activator of transcription 6，STAT6)是Th2細胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子[5]，研究發(fā)現(xiàn)，白頭翁皂苷B4可通過抑制IL-4/STAT6信號通路降低炎癥反應(yīng)，改善慢性阻塞性肺疾病損傷[6]。既往研究顯示，吳茱萸次堿可改善炎癥性皮膚病(銀屑病)的癥狀，調(diào)節(jié)免疫細胞，減輕炎癥反應(yīng)[7]。本研究通過建立特應(yīng)性皮炎小鼠模型，探討吳茱萸次堿對炎癥性皮膚病的治療作用機制。

1 材料

1.1 動物50只4周齡SPF級雄性C57BL/6小鼠，體質(zhì)量20～25 g，購自北京北科華夏生物醫(yī)藥科技有限公司，使用許可證號：SYXK(京)2017-0044，飼養(yǎng)環(huán)境：室溫20～25 ℃，相對濕度50%～70%，自由飲食飲水，晝夜交替12 h。該實驗經(jīng)開封市人民醫(yī)院動物倫理委員會批準，倫理審批號：KFSRMYY2019050026。

1.2 藥物與試劑吳茱萸次堿(武漢科斯坦生物科技有限公司，純度≥98%，批號：84-26-4)；潑尼松龍(北京康瑞納生物科技有限公司，批號：B6374)。HE試劑盒、丙酮、橄欖油(上海碧云天生物科技有限公司，批號：C0105、ST1663、KNK437)；2，4-二硝基氟苯(2，4-dinitrofluorobenzene，DNFB，美國Sigma公司，批號：265179)；細胞因子干擾素γ(interferon gamma，IFN-γ)、IL-4、IL-5、免疫球蛋白E(immunoglobulin E，IgE)試劑盒(美國Invitrogen公司，批號：KHC4021、A42893、BMS610、EMIGHE)；兔抗鼠STAT6抗體、嗜酸粒細胞趨化因子(eotaxin)抗體、細胞因子信號抑制因子1(suppressor of cytokine signaling 1，SOCS1)抗體、GAPDH抗體(美國Abcam公司，貨號：ab32108、ab133604、ab280884、ab8245)。

1.3 儀器1658033型電泳儀(美國BIO-RAD公司)；A51119500C型酶標儀、ST16R型低溫高速離心機(美國Thermo Fisher Scientific公司)；XPR226CDR/AC型電子天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)；EG1150型包埋機、RM2255型切片機、DM2700P型顯微鏡(德國徠卡公司)；VE-186型轉(zhuǎn)移電泳槽、Tannon-2500型凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)。

2 方法

2.1 動物分組、模型制備和給藥50只小鼠隨機分為正常組、模型組、陽性對照組、吳茱萸次堿低劑量組和吳茱萸次堿高劑量組，每組10只，除正常組外，其余組小鼠建立特應(yīng)性皮炎模型[8]，具體操作如下：在小鼠耳部無損傷皮膚3 mm×3 mm范圍內(nèi)剃毛，丙酮和橄欖油以體積比31配制，添加DNFB制成濃度為1%的混懸液，第1天和第8天在每只小鼠耳部裸露皮膚上涂抹100 μL 1% DNFB混懸液，第15天和第16天相同部位剃毛，涂抹50 μL 1% DNFB混懸液，以出現(xiàn)抓痕、紅斑出血、結(jié)痂等表現(xiàn)視為造模成功，正常組小鼠相同部位剃去毛發(fā)，并于相同時間點涂抹丙酮和橄欖油混懸液。造模成功4 h后，陽性對照組小鼠灌胃給予10 mg·kg-1潑尼松龍溶液，吳茱萸次堿低、高劑量組小鼠灌胃給予10 mg·kg-1、20 mg·kg-1吳茱萸次堿溶液，正常組和模型組小鼠灌胃等量生理鹽水，每天1次，連續(xù)14 d。

2.2 耳部炎癥評分測定末次給藥結(jié)束后，評估耳部皮損處炎癥嚴重程度，并進行評分，0分為無皮損；1分為無皮損但可察覺紅斑和丘疹或浸潤；2分為輕度紅斑和丘疹或浸潤；3分為中度紅斑和丘疹或浸潤；4分為重度紅斑和丘疹或浸潤；5分為非常嚴重的紅斑和丘疹或浸潤，同時伴有滲出和結(jié)痂。手術(shù)剪獲取各組小鼠右耳，并用游標卡尺測量皮損部位厚度。

2.3 ELISA檢測小鼠血清中IFN-γ、IL-4、IL-5和IgE含量小鼠麻醉后，打開胸腔，收集主動脈血，室溫靜置30 min，3 000 r·min-1離心10 min(離心半徑8 cm)，收集上清為待測樣品，根據(jù)ELISA試劑盒說明書，梯度稀釋標準品，設(shè)置空白孔、對照孔和待測樣品孔。加入待測樣品后，輕輕搖晃混勻，置于37 ℃水浴鍋中避光孵育30 min，加入抗體稀釋液后，37 ℃水浴鍋中避光孵育30 min，加入親和素過氧化物酶復(fù)合物后，37 ℃避光孵育30 min，洗滌液清洗5次，甩干，加入顯色液，顯色30 min，加入終止液終止反應(yīng)，置于酶標儀上，測定波長450 nm處的吸光度(absorbance，A)值，根據(jù)標準品，建立標準曲線，測定待測樣品濃度。

2.4 耳部組織HE染色剪取部分耳組織，常規(guī)脫水、包埋、制成厚度為4 μm的石蠟切片，滴加蘇木素染液于組織切片上染色5 min，酸性乙醇分化，雙蒸水沖洗，滴加伊紅染液于組織切片上染色3 min，雙蒸水清洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，晾干后置于顯微鏡下觀察并拍照。

2.5 Western Blot檢測耳組織中相關(guān)蛋白表達水平取部分耳組織，液氮中研磨，加入裂解液裂解 30 min，12 000 r·min-1離心10 min(離心半徑 10 cm)，收集上層蛋白樣品，BCA試劑盒測定蛋白濃度，裂解液調(diào)整蛋白濃度，100 ℃煮沸10 min使蛋白變性穩(wěn)定。設(shè)置電泳儀恒壓80 V電泳30 min后120 V電泳1.5 h，電泳結(jié)束后，設(shè)定電泳儀參數(shù)恒流0.3 A濕轉(zhuǎn)2 h，TBST洗膜3次，胎牛血清室溫封閉1 h，加入STAT6、SOCS1、eotaxin和GAPDH一抗(稀釋比例為11 000)4 ℃孵育過夜，加入二抗(稀釋比例為15 000)室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，ECL法顯色，Image J分析蛋白條帶灰度值，目的蛋白相對表達量=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。

3 結(jié)果

3.1 吳茱萸次堿對特應(yīng)性皮炎小鼠皮炎評分及右耳厚度的影響與正常組比較，模型組小鼠耳部出現(xiàn)充血水腫、糜爛、干燥脫屑、結(jié)痂等炎性癥狀，皮炎評分及右耳厚度顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，各給藥組小鼠耳部炎性癥狀減輕，皮炎評分及右耳厚度明顯降低(P<0.05)；與陽性對照組比較，吳茱萸次堿低、高劑量組小鼠皮炎評分及右耳厚度顯著升高(P<0.05)；與吳茱萸次堿低劑量組比較，吳茱萸次堿高劑量組小鼠皮炎評分及右耳厚度顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 吳茱萸次堿對特應(yīng)性皮炎小鼠皮炎評分及右耳厚度的影響

3.2 吳茱萸次堿對特應(yīng)性皮炎小鼠血清中IFN-γ、IL-4、IL-5和IgE含量的影響與正常組比較，模型組IL-4、IL-5和IgE含量顯著升高(P<0.05)，IFN-γ含量顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，各給藥組IL-4、IL-5和IgE含量顯著降低(P<0.05)，IFN-γ含量顯著升高(P<0.05)；與陽性對照組比較，吳茱萸次堿低、高劑量組IL-4、IL-5和IgE含量顯著升高(P<0.05)，IFN-γ含量顯著降低(P<0.05)；與吳茱萸次堿低劑量組比較，吳茱萸次堿高劑量組IL-4、IL-5和IgE含量顯著降低(P<0.05)，IFN-γ含量顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 吳茱萸次堿對特應(yīng)性皮炎小鼠血清中IFN-γ、IL-4、IL-5和IgE含量的影響

3.3 吳茱萸次堿對特應(yīng)性皮炎小鼠耳部組織結(jié)構(gòu)的影響正常組小鼠耳部組織皮膚結(jié)構(gòu)正常完整，無水腫和炎性細胞浸潤；模型組小鼠皮膚結(jié)構(gòu)缺失，明顯水腫，可見大量炎性細胞浸潤；與模型組比較，各給藥組小鼠耳部組織病理損傷得到顯著改善，其中陽性對照組和吳茱萸次堿高劑量組小鼠皮膚結(jié)構(gòu)較完整，細胞輕度水腫，少量炎性細胞浸潤。見圖1。

注：A：正常組；B：模型組；C：陽性對照組；D：吳茱萸次堿低劑量組；E：吳茱萸次堿高劑量組圖1 小鼠耳部組織HE染色(×200)

3.4 吳茱萸次堿對特應(yīng)性皮炎小鼠耳部組織中 IL-4/STAT6信號通路相關(guān)蛋白表達水平的影響與正常組比較，模型組IL-4、STAT6和eotaxin蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，SOCS1蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，各給藥組 IL-4、STAT6和eotaxin蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，SOCS1蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)；與陽性對照組比較，吳茱萸次堿低、高劑量組IL-4、STAT6和eotaxin蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，SOCS1蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)；與吳茱萸次堿低劑量組比較，吳茱萸次堿高劑量組IL-4、STAT6和eotaxin蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，SOCS1蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。見表3，圖2。

表3 吳茱萸次堿對特應(yīng)性皮炎小鼠耳部組織中IL-4/STAT6信號通路相關(guān)蛋白表達水平的影響

注：A：正常組；B：模型組；C：陽性對照組；D：吳茱萸次堿低劑量組；E：吳茱萸次堿高劑量組圖2 Western Blot檢測特應(yīng)性皮炎小鼠耳部組織IL-4/STAT6信號通路相關(guān)蛋白表達水平

4 討論

特應(yīng)性皮炎是一種由皮膚功能障礙及免疫反應(yīng)引起的慢性皮膚病，其致病因素與遺傳、感染、免疫失衡等有關(guān)，受干擾部分的皮膚組織對外部抗原或過敏原滲透性增強，導(dǎo)致角質(zhì)層細胞先天免疫因子釋放增加及Th2型T細胞浸潤增加，Th2細胞分泌多種炎性因子，包括IL-4、IL-5和IL-13，多種炎性細胞的浸潤導(dǎo)致特應(yīng)性皮炎的發(fā)生[9]。目前，對于特應(yīng)性皮炎的治療常采用局部使用類固醇或抗菌藥物，但常規(guī)治療手段存在不良反應(yīng)，因此尋找有效的治療藥物和靶點是臨床研究的熱點。

中醫(yī)認為特應(yīng)性皮炎屬于“乳癬”“奶癬”“胎斂瘡”等病證范疇，中醫(yī)學者對其具體病因有豐富的論述，多數(shù)學者認為該病因為先天稟賦不足、脾失健運、生濕化熱，復(fù)感風濕邪熱，蘊結(jié)肌膚，內(nèi)外合邪而致，根據(jù)病因不同可分為胎熱型、脾虛型和血造型。吳茱萸屬蕓香科植物，所含化學成分包括生物堿、苦味素和揮發(fā)油等，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其主要成分吳茱萸次堿具有多種藥理學活性，可保護阿霉素造成的H9C2心肌細胞損傷，增強細胞活力，抑制細胞凋亡[10]，還可通過調(diào)節(jié)免疫平衡，在前列腺癌小鼠中發(fā)揮抗癌作用[11]，改善高蔗糖誘導(dǎo)的阿爾茨海默病小鼠認知功能障礙[12]，抑制Toll樣受體4(toll like receptor 4，TLR4)/核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)炎性信號通路保護大鼠心肌缺血再灌注損傷[13]。此外，吳茱萸次堿在炎癥性疾病中具有顯著療效，可降低葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎小鼠炎癥因子，減輕結(jié)腸組織病理損傷[14]，通過調(diào)節(jié)降鈣素基因相關(guān)肽減輕急性胰腺炎小鼠病理損傷[15]。本研究通過建立特應(yīng)性皮炎小鼠模型，探討吳茱萸次堿對該疾病的作用，結(jié)果顯示，特應(yīng)性皮炎小鼠耳部皮損組織結(jié)構(gòu)缺失，明顯水腫，可見大量炎性細胞浸潤，皮炎評分升高，右耳明顯增厚，吳茱萸次堿治療后小鼠耳部皮膚組織結(jié)構(gòu)較完整，細胞輕度水腫，少量炎性細胞浸潤，皮炎評分降低，右耳厚度減小。免疫細胞Th1和Th2之間的平衡對于保持機體免疫功能穩(wěn)定尤為重要，Th1/Th2失衡可導(dǎo)致多種疾病，如過敏性疾病和免疫失調(diào)[16-18]。已有研究發(fā)現(xiàn)，免疫細胞失衡與特應(yīng)性皮炎密切相關(guān)[19]。IFN-γ是Th1細胞群分泌的主要細胞因子之一，IFN-γ可抑制IgE的合成，IgE水平與特應(yīng)性皮炎小鼠皮損嚴重程度有關(guān)[20]。IL-4和IL-5是Th2細胞群分泌的主要細胞因子，二者可促進B淋巴細胞合成IgE[21]。此外，IFN-γ抑制Th2細胞群分泌IL-4和IL-5，抑制免疫細胞向Th2分化，使免疫細胞向Th1分化，阻斷IgE合成，降低嗜酸性粒細胞表達和浸潤[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，特應(yīng)性皮炎小鼠血清中IL-4、IL-5和IgE含量升高，而IFN-γ含量降低，吳茱萸次堿治療后IL-4、IL-5和IgE含量降低，而IFN-γ含量升高，提示吳茱萸次堿可改善特應(yīng)性皮炎小鼠病理癥狀，調(diào)節(jié)免疫平衡。

IL-4是誘導(dǎo)Th2細胞分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，也是Th2細胞特征性細胞因子。STAT6是具有信號傳遞及轉(zhuǎn)錄因子雙重功效的DNA結(jié)合蛋白，其核轉(zhuǎn)位及轉(zhuǎn)錄活性由IL-4和IL-3調(diào)節(jié)，IL-4可使STAT6單體募集到IL-4受體的α鏈上，發(fā)生磷酸化，磷酸化后的STAT6二聚化轉(zhuǎn)位入核，并結(jié)合于特定的DNA元件上，激活I(lǐng)L-4相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄及蛋白質(zhì)合成[23]。SOCS1的表達活性由STAT6基因在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)，參與下調(diào)IL-4受體活性，通過STATs通路參與Th細胞極化，在穩(wěn)定Th1和Th2表型中具有重要作用[24]。eotaxin屬于CC趨化因子成員，其受體是CCR3，主要作用于單核細胞、巨噬細胞、嗜酸性粒細胞等。研究發(fā)現(xiàn)，在A549肺癌細胞中，IL-4激活STAT6和eotaxin，促進癌細胞的炎癥反應(yīng)[25]。本研究檢測特應(yīng)性皮炎小鼠耳部組織中各蛋白變化發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠耳組織中STAT6和eotaxin蛋白相對表達量升高，SOCS1蛋白相對表達量降低，而吳茱萸次堿低、高劑量組小鼠耳組織中STAT6和eotaxin蛋白相對表達量降低，SOCS1蛋白相對表達量升高，提示，吳茱萸次堿參與調(diào)節(jié)IL-4/STAT6/SOCS1/eotaxin信號通路。

綜上所述，吳茱萸次堿可改善特應(yīng)性皮炎小鼠癥狀，降低炎癥反應(yīng)，其機制可能與調(diào)控IL-4/STAT6信號通路有關(guān)，為臨床治療特應(yīng)性皮炎提供理論依據(jù)。