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    不同干燥方法對余甘子抗氧化成分及抑制酪氨酸酶活性的影響

    2022-12-15 11:32:22李樹全李小嬌趙典遠(yuǎn)鄭永仁
    貴州農(nóng)業(yè)科學(xué) 2022年12期
    關(guān)鍵詞:甘子曬干冷凍干燥

    吳 梅, 李樹全, 李小嬌, 趙典遠(yuǎn), 鄭永仁

    (1.云南中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院/云南省南藥可持續(xù)利用研究重點實驗室, 云南 昆明 650500; 2.云南省高校外用給藥系統(tǒng)與制劑技術(shù)研究重點實驗室, 云南 昆明 650500; 3.云南中醫(yī)藥大學(xué) 科研實驗中心, 云南 昆明 650500)

    0 引言

    【研究意義】余甘子又名滇橄欖,來源于大戟科(Euphorbiaceae)葉下珠屬植物余甘子(PhyllanthusemblicaL.)的果實,具有清熱涼血、消食健胃、生津止咳之功效[1]。余甘子是印度傳統(tǒng)醫(yī)藥阿育吠陀中最常用的藥漿“三果漿”的原料之一,使用頻率極高,在我國藏醫(yī)藥中亦占有十分重要地位,作為藏族習(xí)用藥材收錄于《中國藥典》,此外亦應(yīng)用于傣族、彝族等10余個少數(shù)民族醫(yī)藥,但在中醫(yī)方劑中較少應(yīng)用,李時珍在《本草綱目》中將其移入果部,多做果品食用[2-3]。余甘子鮮果味酸澀,且極難貯存,冷藏可減緩變質(zhì),但也只能延長保鮮6~9 d;其常規(guī)干燥方法為曬干,干燥過程中顏色逐漸加深成棕褐色或墨綠色,隨著果實褐變其化學(xué)成分也發(fā)生變化,如沒食子酸的含量逐漸增加[4]。因此,研究余甘子的干燥加工方法對其功能性食品的開發(fā)具有重要意義。【前人研究進展】自由基對生命過程起著重要的調(diào)控作用,過量自由基會引起生物膜及DNA的氧化性損傷,與癌癥、動脈硬化等疾病以及衰老密切相關(guān),抗氧化物質(zhì)可通過切斷過氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)而抑制自由基損傷,維生素C及植物多酚是膳食中重要的抗氧化物質(zhì),廣泛存在于水果、蔬菜及谷物中[5-7]。余甘子是一種營養(yǎng)價值較高的果品,富含維生素C等維生素、有機酸、蛋白質(zhì)、粗纖維以及鎂鉀等礦物質(zhì),含有豐富的植物多酚,同時余甘子具有較強的清除自由基、抗氧化活性[8-11]。加工方法及貯藏條件均影響余甘子中維生素C、植物多酚的含量,如張福平等[12-13]研究表明,鮮果若不及時干燥,維生素C的含量損失接近70%,低溫貯藏有利于余甘子營養(yǎng)物質(zhì)的保存;徐涓等[14]用高溫蒸汽處理余甘子果汁,可減輕因酶促導(dǎo)致的褐變,減輕維生素C的氧化分解以及多酚類物質(zhì)的氧化聚合?!狙芯壳腥朦c】余甘子干燥方法除直接曬干外,民間亦采用蒸后曬干、冷凍貯藏后再解凍曬干以及去皮后曬干,能減輕果實褐變,但不同干燥方法對余甘子中維生素C、植物多酚含量及抗氧化作用的影響尚不明確?!緮M解決的關(guān)鍵問題】通過測定不同干燥方法加工的余甘子中維生素C、植物多酚含量以及對酪氨酸酶活性的抑制作用,以期建立余甘子科學(xué)、合理的干燥加工方法,為余甘子在功能性食品方面的開發(fā)利用提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 余甘子 余甘子采自云南省普洱市景谷,經(jīng)鑒定為大戟科植物余甘子(P.emblicaL.)的果實。鮮品去核后,采用以下干燥加工方法:直接曬干,記作PE-曬干;去皮后曬干,記作PE-去皮;冷凍24 h后解凍再曬干,記作PE-凍后;烘干(50℃),記作PE-烘干;真空冷凍干燥,記作PE-凍干;蒸2 min、8 min或32 min后曬干,分別記作PE-蒸2、PE-蒸8、PE-蒸32。

    1.1.2 試劑 沒食子酸對照品(J&K, 純度99%)、維生素C對照品(中國食品藥品檢定研究院,批號:1021H023,純度100%)、曲酸對照品(J&K, 純度99%)、酪氨酸酶(上海源葉,1 240 U/mg)、左旋多巴(Adamas-beta,純度99%)、福林酚試劑乙(上海藍(lán)季生物)、甲醇(Fisher,色譜級),其他試劑均為分析純,試驗用水為娃哈哈純凈水。

    1.1.3 儀器 真空冷凍干燥機(新芝SCIENTZ-30F)、高效液相色譜儀(Waters e2695,配2489UV-Vis 檢測器)、紫外分光光度計(島津UV-2450)、多功能酶標(biāo)儀(TECAN Spark 10 M)、水浴鍋(Leica HI1210)、電子分析天平(島津AUW220D)、超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)KH7200B,400 W,40 kHz)。

    1.2 方法

    1.2.1 余甘子總多酚含量測定 采用福林酚比色法測定總多酚含量[15]。

    1) 系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備。參考《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》(GB/T 8313—2008),取適量沒食子酸對照品,精密稱定,加50%甲醇溶解,配制成濃度分別為5.28 mg/L、10.56 mg/L、21.12 mg/L、31.68 mg/L、42.24 mg/L、52.80 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

    2) 供試品溶液的制備。精密稱定供試品粉末50 mg,置具塞錐形瓶中,精密加入50 mL 50%甲醇,稱定重量,水浴回流1 h,放冷,用50%甲醇補足質(zhì)量,搖勻,過濾,取續(xù)濾液,即得。

    3) 測定方法。分別精密吸取系列標(biāo)準(zhǔn)溶液與供試品溶液各1 mL至具塞試管中,加10%福林酚試劑5 mL搖勻,靜置5 min后,再加入7.5%碳酸鈉溶液4 mL搖勻,室溫下避光靜置1 h后,在波長765 nm處測定吸光度,按干燥品計算總多酚含量。

    1.2.2 余甘子維生素C含量測定 參照文獻[16]的方法適當(dāng)調(diào)整。

    1) 色譜條件。采用Inertsil ODS-SP色譜柱(4.6 mm × 250 mm,5 μm);以甲醇-0.15 mmol/L磷酸二氫鉀溶液(5∶95)為流動相;檢測波長為243 nm;流速0.4 mL/min;柱溫30℃。

    2) 對照品溶液的制備。精密稱取維生素C對照品,用6% 醋酸(冷新沸水配制)溶解,制成每1 mL中含有維生素C 80 μg,臨用前配制。

    3) 供試品溶液的制備。精密稱定供試品粉末0.1 g,置具塞錐形瓶中,精密加入6% 醋酸50 mL,稱定重量,超聲處理20 min(控制溫度<10℃),用6%醋酸補足質(zhì)量,搖勻,過0.45 μm微孔濾膜,取續(xù)濾液,即得。

    4) 測定方法。分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各5~10 μL,注入液相色譜儀,測定,按干燥品計算維生素C的含量。

    1.2.3 余甘子抗氧化活性測定 采用酪氨酸酶活性抑制試驗評價抗氧化活性[17]。

    1) 對照品溶液的制備。精密稱取曲酸對照品,用磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(pH 6.8)溶解,逐級稀釋成1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.04 mg/mL、0.008 mg/mL系列濃度,臨用前配制,用于試驗有效性驗證。

    2) 供試品溶液的制備。精密稱定供試品粉末1 g,置具塞錐形瓶中,精密加入50 mL水,稱定重量,超聲處理20 min(控制溫度<10℃),用水補足質(zhì)量,搖勻,過0.45 μm微孔濾膜,取續(xù)濾液,再逐級稀釋,制成20 mg/mL、10 mg/mL、5 mg/mL、2.5 mg/mL系列濃度。

    3) 測定方法。精密吸取樣品溶液、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(pH 6.8)及酪氨酸酶溶液(100 U/mL)充分混勻(表1),置37℃水浴孵育10 min,再加入左旋多巴溶液(1 mg/mL),反應(yīng)5 min,在475 nm處測定吸光度。

    表1 酪氨酸酶活性測定反應(yīng)液配比

    酪氨酸酶活性抑制率=[1-(T-T0)/(C-C0)]×100%

    1.3 數(shù)據(jù)分析

    采用單因素方差分析(ANOVA)及Tukey多重比較分析數(shù)據(jù)間顯著性差異;Probit回歸分析估計酪氨酸酶活性抑制作用的IC50(95%置信限);相關(guān)性分析采用 Spearman檢驗,檢驗水準(zhǔn)P<0.05。以上數(shù)據(jù)均使用SPSS 17.0進行統(tǒng)計分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 余甘子總多酚的含量

    由圖1可見,建立沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線,線性回歸方程為y= 0.008 4x+ 0.056 3(R2=0.999 2),沒食子酸為5.28~52.80 mg/L,線性關(guān)系良好。

    由表2可見,不同干燥方法加工的余甘子中總多酚含量均較高,其中,真空冷凍干燥的余甘子中總多酚含量最高,達37.39 mg/g,冷凍24 h后解凍再曬干的余甘子總多酚含量最低,僅23.78 mg/g,與其他干燥方式有顯著性差異;直接曬干、去皮曬干、蒸后曬干及烘干等方法間無顯著性差異,總多酚含量為28.60~30.74 mg/g(F7,16=73.21,P<0.05)。

    圖 1 沒食子酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線

    表2 不同干燥方法處理余甘子總多酚、維生素C含量及酪氨酸酶的活性

    2.2 余甘子維生素C的含量

    2.2.1 方法學(xué)考察

    1) 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗。經(jīng)測定,色譜峰分離度良好(R>1.5),理論塔板數(shù)大于3 000,符合含量測定要求(圖2)。

    注:A,陰性對照;B,維生素C對照品;C,供試品。

    2) 線性關(guān)系。經(jīng)測定,以峰面積為縱坐標(biāo)(y)、進樣量(μg)為橫坐標(biāo)(x),線性回歸方程為y= 8×106x+ 52 897(R2=0.999 6),維生素C為0.025~1.242 μg,線性關(guān)系良好。

    3) 精密度試驗。相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.42%(n=6),表明儀器精密度良好。

    4) 穩(wěn)定性試驗。RSD為2.97%(n=6),表明樣品溶液在室溫下放置7 h內(nèi)穩(wěn)定。

    5) 重復(fù)性試驗。RSD為2.07%(n=6),表明該方法重復(fù)性好。

    6) 加樣回收率試驗。平均加樣回收率為94.8%,RSD為2.61%(n=9),表明該方法準(zhǔn)確可靠。

    2.2.2 維生素C含量 由表2可見,不同干燥方法對余甘子中維生素C的含量有顯著性影響(F7,16=394.57,P<0.05),其中,真空冷凍干燥的維生素C含量最高,達20.44 mg/g;直接曬干的為17.33 mg/g,去皮曬干、烘干與其無顯著性差異;冷凍24 h后解凍再曬干的維生素C含量僅14.75 mg/g,與上述干燥方法有顯著性差異;蒸后曬干的維生素C含量顯著下降,為10.51~10.78 mg/g,蒸2 min、8 min、32 min后曬干間無顯著性差異。

    2.3 余甘子的抗氧化活性

    2.3.1 有效性驗證 陽性對照曲酸抑制酪氨酸酶活性的IC50為0.076 mg/mL,在有效范圍0.05~0.15 mg/mL內(nèi),表明該試驗體系有效。

    2.3.2 酪氨酸酶活性 由表2可見,不同方法干燥余甘子均具有抑制酪氨酸酶活性的作用,其中,直接曬干和真空冷凍干燥的余甘子抑制作用的IC50分別為9.8 mg/mL和10.3 mg/mL,而蒸2 min后曬干、蒸8 min后曬干、蒸32 min后曬干、冷凍24 h后解凍再曬干的IC50>12 mg/mL。抑制作用為直接曬干>真空冷凍干燥>去皮后曬干>50℃烘干>蒸32 min后曬干>蒸2 min后曬干>冷凍24 h后解凍再曬干>蒸8 min后曬干。

    2.4 余甘子中維生素C、總多酚及酪氨酸酶活性抑制作用間的相關(guān)性

    經(jīng)相關(guān)性分析,余甘子中維生素C含量與總多酚含量間無顯著相關(guān)性(r=0.567,P>0.05);余甘子中維生素C含量與酪氨酸酶活性抑制作用間呈正相關(guān)性(r=0.816,P<0.05);余甘子中總多酚含量與酪氨酸酶活性抑制作用間無顯著相關(guān)性(r=0.570,P>0.05)。

    3 討論

    余甘子可用干品或鮮食,但鮮果與干果的化學(xué)成分有顯著差異,主要是鞣質(zhì)類成分,其干燥過程、貯藏過程及含量測定的提取環(huán)節(jié)等導(dǎo)致大分子鞣質(zhì)水解或縮合,如訶黎勒酸水解產(chǎn)生柯里拉京和訶子次酸,而柯里拉京又可繼續(xù)水解生成沒食子酸和鞣花酸,干果(不包括真空冷凍干燥)中沒食子酸、鞣花酸等小分子鞣質(zhì)的含量遠(yuǎn)高于鮮果[18-20]。余甘子主要有效成分為沒食子酸、鞣花酸及柯里拉京[21-22]。因此,本研究中雖然真空冷凍干燥的余甘子中維生素C及總多酚的含量均最高(與鮮果成分相近),但抑制酪氨酸酶活性作用卻略弱于直接曬干的余甘子。毛正睿[23]研究表明,熱風(fēng)烘干、自然風(fēng)干與真空冷凍干燥的余甘子均具有較強的羥基自由基清除作用;熱風(fēng)烘干、自然風(fēng)干對a-淀粉酶活性的抑制作用明顯強于真空冷凍干燥。余甘子具有清熱利咽、調(diào)節(jié)口腔微生態(tài)、促腸蠕動緩解便秘及抗氧化延緩衰老等作用[24-27],在功能性食品領(lǐng)域有廣闊市場,在開發(fā)不同保健功能時使用干鮮果應(yīng)有所選擇。

    余甘子果核中主要含有脂肪酸類成分,鞣質(zhì)含量遠(yuǎn)低于果肉,且抗氧化作用遠(yuǎn)不及果肉[28]。故本試驗均采用去核后再干燥的加工方式,一定程度提高了干燥效率。直接曬干是最常用的干燥方法,簡便經(jīng)濟,但果實表面顏色較深;去皮后再曬干的余甘子表面產(chǎn)生1層白霜,干后顏色較淺且澀味減弱;烘干(50℃)的干燥效率較高,口感上有較強膠質(zhì)感。上述3種方法加工的余甘子在維生素C及總多酚含量上均無顯著性差異。本試驗中冷凍24 h后解凍再曬干的余甘子顏色較淺,但在維生素C及總多酚含量上均有顯著降低,不適合作為余甘子的干燥方法;蒸會導(dǎo)致余甘子中維生素C的含量顯著降低,雖然余甘子所含豐富的有機酸及多酚類成分有利于維生素C的穩(wěn)定,直接曬干、去皮曬干及烘干(50℃)的余甘子中維生素C較真空冷凍干燥約降低15%,但仍對高溫敏感。不同干燥方式對余甘子化學(xué)成分及功效的影響還有待進一步深入研究。

    4 結(jié)論

    真空冷凍干燥、直接曬干、去皮后曬干及烘干(50℃)的余甘子中均含有豐富的維生素C及總多酚,其中,真空冷凍干燥的含量最高;以對酪氨酸酶活性抑制作用的強弱為評價指標(biāo),直接曬干及真空冷凍干燥是余甘子最佳的干燥方法,維生素C含量與抑制作用的強弱正相關(guān)。

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