基于網(wǎng)絡藥理學和分子對接技術探索黃芪建中湯治療功能性消化不良的作用機制

趙先平，楊通平，向江*

（1.張家界市中醫(yī)醫(yī)院，湖南 張家界 427000；2.湖南醫(yī)藥學院，湖南 懷化 418000）

0 引言

功能性消化不良（Functional Dyspepsia，F(xiàn)D）是一種慢性功能性消化系統(tǒng)疾病，以上腹痛、上腹燒灼感、餐后飽脹及早飽感等為主要臨床表現(xiàn)[1]。該病在全球范圍內(nèi)的患病率約為10%~30%[2]，在我國的患病率亦在20%以上，且呈逐年上升的趨勢[3]。雖然FD為非致命性疾病，但具有發(fā)病率高、病程長、易反復的特點，嚴重影響患者的精神心理狀態(tài)與生活質量[4]。目前西醫(yī)方面多以抑酸、促胃腸動力、抗焦慮抑郁等對癥治療為主，雖可在一定程度上改善臨床癥狀，但長期應用，存在較高的不良反應發(fā)生率[5]。已有多項研究證實中醫(yī)藥治療FD療效明顯，且不良反應較少[3,6-8]。

中醫(yī)雖無FD之名，但根據(jù)FD的癥狀，可將該病歸屬于“痞滿”“積滯”“胃脘痛”等范疇，其基本病機多以脾虛為本，氣滯為標，治療則多以健脾和胃，溫中散寒為主[9]。黃芪建中湯是《金匱要略》中治療“虛勞諸不足”的經(jīng)典方劑，具有溫中補虛，緩急止痛之功。有多項研究顯示，該方治療脾胃氣虛型FD臨床療效顯著[10-13]。因此，探究其分子作用機制十分必要。

網(wǎng)絡藥理學可揭示中藥成分和靶點之間的協(xié)同作用機制，為客觀評價和優(yōu)化中藥復方的療效性提供關鍵技術支撐，同時有助于推動中醫(yī)從經(jīng)驗醫(yī)學向循證醫(yī)學的創(chuàng)新性轉變[14]。分子對接技術可體現(xiàn)藥物成分與靶點之間的結合活性，對所獲得的潛在作用機制進行驗證，為網(wǎng)絡藥理學結果提供一定的客觀依據(jù)。目前，關于黃芪建中湯是通過哪些通路以發(fā)揮治療FD的作用，仍未有相關報道。本研究將通過網(wǎng)絡藥理學和分子對接技術，初步探索黃芪建中湯治療FD的分子作用機制，為該方治療FD及后續(xù)深入研究提供一定的理論依據(jù)。

1 方法

1.1 黃芪建中湯有效成分及靶點的收集與篩選

本研究通過中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php），檢索黃芪建中湯的有效活性成分。因該數(shù)據(jù)庫中暫缺“飴糖”的相關成分，亦未在TCMID （http://www.megabionet.org/tcmid/）檢索到，故本研究未將其納入。以口服利用度≥30%，類藥性≥0.18為標準進行篩選；運用UniProt數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）對靶點基因進行標準化匹配。

1.2 黃芪建中湯治療FD相關靶點的篩選

運用OMIM數(shù)據(jù)庫（https://www.omim.org/）、GeneCards數(shù)據(jù)庫（https://genecards.org/）及Drugbank數(shù)據(jù)庫（https://go.drugbank.com/）對FD的相關基因進行檢索，獲取疾病基因與黃芪建中湯的藥物基因的交集靶點；利用Cytoscape 3.7.1繪圖軟件繪制中藥—成分—靶點網(wǎng)絡圖。

1.3 PPI網(wǎng)絡構建與分析

將黃芪建中湯治療FD的靶點導入String（https://string-db.org/）數(shù)據(jù)庫，物種設為“Homo Sapiens”，獲取蛋白—蛋白相互作用（protein proteininteraction，PPI）關系；運用Cytoscape 3.7.1軟件構建PPI網(wǎng)絡圖；借助R 4.0.0軟件繪制核心靶點蛋白PPI條形圖。

1.4 富集分析

通過微生信在線繪圖工具（https://www.bioinformatics.com.cn）對黃芪建中湯與FD的交集基因進行GO和KEGG富集分析，對結果進行可視化處理。

1.5 分子對接技術驗證

選取PPI結果中排名前5的核心靶點蛋白，在PDB數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org/）獲取靶點蛋白的結構；利用PyMOL 2.4.0軟件對蛋白去水、切除配體，使用Auto Docks Tools 1.5.6軟件對其進行加氫處理；通過Pubchem數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）下載對應活性成分的2D結構。運行AutoDock進行分子對接，借助PyMOL 2.4.0軟件對分析結果進行可視化處理，以對網(wǎng)絡藥理學結果進行驗證。

2 結果

2.1 黃芪建中湯的潛在活性成分及靶點

將TCMSP數(shù)據(jù)中檢索到的成分進行去重，共得到有效活性成分122種；將UniProt數(shù)據(jù)庫中查詢到的靶點蛋白進行去重，共有248個。各個中藥成分和靶點數(shù)量具體見表1。

表1 中藥—成分—靶點基本信息統(tǒng)計

2.2 黃芪建中湯治療FD的相關靶點

以“Functional Dyspepsia”為檢索詞，在GeneCards數(shù)據(jù)庫中得到2523個靶點，在OMIM數(shù)據(jù)庫中獲得13個，在Drugbank數(shù)據(jù)庫得到2個，經(jīng)去重，最終共得到2533個基因。將FD基因與黃芪建中湯中的基因取交集，相交基因共有155個，具體見圖1。將相關藥物、成分、靶點導入Cytoscape 3.7.1軟件，繪制中藥—成分—靶點網(wǎng)絡圖，共得到378個節(jié)點，3078條邊，見圖2。圖中三角形代表藥物，圓形代表藥物的有效活性成分（其中深藍色圓形為藥物之間的共有成分），菱形代表靶點基因；圖中圖形大小代表degree值的高低。

2.3 PPI網(wǎng)絡構建與分析

在String數(shù)據(jù)庫中導入黃芪建中湯治療FD的相關靶點，設最低要求互動得分為0.4，將其PPI關系以TSV格式文件導出；應用Cytoscape 3.7.1軟件繪制PPI網(wǎng)絡圖，見圖3。圖中圓形的大小和顏色深淺與度值成正相關。利用R 4.0.0軟件作PPI條形圖，按度值排序，排名前5的蛋白分別為蛋白激酶B1（AKT1）、腫瘤蛋白53（TP53）、腫瘤壞死因子（TNF）、白介素6（IL-6）、胱天蛋白酶3（CASP3）、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA），具體見圖4。

2.4 富集分析

對黃芪建中湯治療FD的靶點進行GO功能富集分析，如圖5。圖中圖形的顏色與P值功能富集的顯著性密切相關，圖形的大小與功能的靶點數(shù)目成正相關。結果顯示，黃芪建中湯治療FD的機制主要與細胞運動的正向調(diào)控、細胞成分的正向調(diào)控、激素反應及無機物反應有關。對黃芪建中湯治療FD的靶點進行KEGG通路富集分析，將顯著性排名前15的通路進行結果展示，見圖6。圖中圓形顏色越深，P值功能富集的顯著性越大；圓形越大，該功能富集的靶點數(shù)目越多。由圖可知，黃芪建中湯治療FD主要與脂質和動脈粥樣硬化通路、流體剪切應力和動脈粥樣硬化通路、晚期糖基化終產(chǎn)物—糖基化終產(chǎn)物受體（AGE-RAGE）通路有關。

2.5 分子對接驗證

將PPI結果中排名前5的核心靶點蛋白（AKT1、TP53、TNF、IL-6、CASP3、VEFGA）與相應的化合物（槲皮素、柚皮素、山奈酚、芍藥苷、β-谷甾醇、β-胡蘿卜素）進行分子對接。一般認為，結合能<-5kcal/mol時，提示靶點與分子之間結合活性較好。結果顯示，有超過3/4的結合能<-5.0 kcal/mol，表明本研究中靶點與相應成分結合活性較好，網(wǎng)絡藥理學結果較為可靠；其中槲皮素、柚皮素、山奈酚、芍藥苷、β-谷甾醇可能是黃芪建中湯治療FD的主要有效活性成分，具體見表2。在各種對接方式中，以β-谷甾醇與CASP3結合活性最強，其次是芍藥苷與TNF、芍藥苷與IL-6，對接結果展示圖見圖7。

表2 核心靶點蛋白與活性成分分子對接結合能

3 討論

根據(jù)分子對接結果可知，槲皮素、柚皮素、山奈酚、芍藥苷、β-谷甾醇與相應靶點結合活性較好，可能是黃芪建中湯治療FD的主要有效活性成分。研究表明，槲皮素可獨立于一氧化氮途徑，直接通過調(diào)控鉀離子ATP通道而誘導胃腸平滑肌松弛，從而發(fā)揮改善胃腸肌肉運動障礙，治療功能性消化不良的作用[15]。柚皮素可減輕焦慮樣行為障礙，考慮可能與改善線粒體功能，增強外核苷酸酶和乙酰膽堿酯酶活性有關[16]。山奈酚具有較強的抗炎活性，可對抗幽門螺桿菌引起的炎癥反應，考慮可能與該成分能夠下調(diào)促炎因子（TNF-α、IL-1β、IL-8等）的表達以及抑制幽門螺桿菌細胞毒素相關基因A (CagA) 和空泡化細胞毒素A (VacA) 易位有關[17]。芍藥苷具有促胃腸動力的作用，這可能與提高胃促生長素和胃動素水平有關；同時，該成分又可發(fā)揮類似氟西汀的抗抑郁作用，其機制可能與升高血漿超氧化物歧化酶和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子，降低血漿丙二醛及海馬一氧化氮等有關[18]。β-谷甾醇同樣亦可發(fā)揮抗抑郁作用，其機制可能與調(diào)控5-羥色胺、多巴胺及γ氨基丁酸等有關[19]；亦有研究表明，但該作用需經(jīng)過酯化衍生化處理，增加脂溶性后才可實現(xiàn)[20]。綜上，以上5個成分可能是黃芪建中湯治療FD的物質基礎。

由PPI結果可知，TP53、IL-6、TNF、AKT1、VEFGA、CASP3為黃芪建中湯治療FD的核心靶點。TP53是目前已知與人類腫瘤發(fā)生相關性最高的抑癌基因，有研究表明該基因多態(tài)性可增加幽門螺桿菌感染者發(fā)生胃癌的風險，且與病理分級有關[21]。TNF作為受關注度較高的炎癥因子之一，同樣與幽門螺桿菌感染密切相關，嚴重者可致胃黏膜屏障受損，發(fā)展為胃潰瘍[22]。IL-6作為另一重要的炎癥因子，與胃腸功能有一定的相關性。研究表明，IL-6水平與FD患者焦慮、抑郁評分成正相關性，臨床中應重視此指標的檢測[23]。AKT1與組織細胞生長、發(fā)育及存活密切相關，激活后可加速炎癥反應，考慮可能與幽門螺桿菌感染有關；另外，該靶點雖有抗抑郁作用[24]，但目前仍無黃芪建中湯抗抑郁的相關機制研究。VEGF具有促進神經(jīng)細胞增長、保護神經(jīng)細胞的作用。研究表明VEGF與抗抑郁療效之間可能存在一定的相關性，其水平偏低，抑郁核心癥狀程度越重，可能是潛在的療效指標[25]。CASP3作為細胞凋亡途徑中的關鍵酶，是白芍的作用靶點之一，亦與抗抑郁相關[26]，但目前尚需更深層次的研究。經(jīng)分子對接驗證，以上靶點與黃芪建中湯成分結合活性較好，可能在治療FD方面發(fā)揮著主要作用，驗證了網(wǎng)絡藥理學結果的可靠性。

根據(jù)GO功能富集分析可知，黃芪建中湯治療FD主要與細胞運動的正向調(diào)控、細胞成分的正向調(diào)控及激素反應等生物過程有關，體現(xiàn)了其治療過程的多樣性。由KEGG通路富集分析可知，黃芪建中湯治療FD的機制主要與AGE-RAGE通路、流體剪切應力和動脈粥樣硬化通路及脂質和動脈粥樣硬化通路有關。研究發(fā)現(xiàn)，冠狀動脈粥樣硬化斑塊與幽門螺桿菌存在密切的關系，即動脈粥樣硬化斑塊中存在幽門螺桿菌，而幽門螺桿菌又可通過增強局部炎癥反應，加劇冠狀動脈粥樣硬化嚴重程度[27,28]，故臨床中應將抗動脈粥樣硬化與抗幽門螺桿菌協(xié)同治療，齊頭并進，以起到較好的療效。AGEs和RAGE與動脈粥樣硬化斑塊的破裂和內(nèi)皮的損傷密切相關[29]，而AGEs又與動脈僵硬度相關，是冠狀動脈疾病的獨立危險因素[30]；剪切應力是作用于血管腔表面的摩擦阻力，過高或過低均可促進動脈粥樣硬化的形成[31,32]；脂質代謝紊亂亦是動脈粥樣硬化病變的獨立危險因素[33]。因此，動脈粥樣硬化是黃芪建中湯治療FD的關鍵性機制，而以上3條通路均與動脈粥樣硬化關聯(lián)密切，間接參與FD的發(fā)病，但目前仍無較為直接的相關性研究，今后可嘗試從此通路進一步加深對FD的研究。此外，從中醫(yī)角度亦可解釋以上3條通路與FD的關系。動脈粥樣硬化斑塊的中醫(yī)病因可歸屬于“虛”“痰”“瘀”[34]，氣虛不足以推動津血運行，致津聚為痰，氣機不暢，瘀血阻絡，這與FD“脾虛為本，氣滯為標”的病機極為相似?！督饏T要略·血痹虛勞篇》云：“虛勞里急，諸不足，黃芪建中湯主之”，故以補虛為根本治則，采用黃芪建中湯治療FD具有一定的中醫(yī)理論依據(jù)。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡藥理學方法和分子對接技術，初步探討了黃芪建中湯治療FD的分子作用機制。黃芪建中湯治療FD的主要有效活性成分可能是槲皮素、柚皮素、山奈酚、芍藥苷、β-谷甾醇，該方可能通過調(diào)控AGERAGE通路、流體剪切應力和動脈粥樣硬化通路及脂質和動脈粥樣硬化通路，作用于TP53、IL-6、TNF、AKT1、VEFGA、CASP3等核心靶點，而促胃動力、抗幽門螺桿菌、改善焦慮抑郁狀態(tài)，最終發(fā)揮治療FD的作用。因目前關于黃芪建中湯治療FD的相關機制研究較少，本課題組今后將參考網(wǎng)絡藥理學結果，設計相關動物實驗，以進行更深層次的機制研究。