基于FTIR、UPLC-QTOF-MSE及UNIFI天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫快速鑒定普洱茶茶湯絮凝物中的化學(xué)成分

劉建國，巴根納，藺 煒，楊瑞冬，余建龍，韓之皓，侯兆乾，王彥平*

1. 內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司 液態(tài)奶事業(yè)部 研發(fā)部，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110；2. 沃特世科技（北京）有限公司，北京 100026

近年來，享有“飲料新貴”的茶飲料正以所向披靡的姿勢(shì)迅速占領(lǐng)飲料市場(chǎng)，而綠茶和紅茶類飲品幾近占據(jù)茶飲料市場(chǎng)的半壁江山，作為“后起之秀”的普洱茶類飲料也逐漸得到消費(fèi)者的青睞。市面上常見的普洱茶類飲品有東方樹葉青柑普洱茶、淳茶舍普洱消茶、麟瓏茶室桂花普洱茶等。普洱茶堪稱益壽茶，經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，普洱茶具有減肥降脂、降壓、降膽固醇、降血糖以及抗氧化、抗病毒及增強(qiáng)免疫力等保健功效，這得益于普洱茶中含有多種生物活性成分[1]。但在這類產(chǎn)品開發(fā)過程中，產(chǎn)品貨架期內(nèi)普遍存在較為嚴(yán)重的絮凝問題。這一問題使普洱茶飲料的研發(fā)和生產(chǎn)過程遭遇瓶頸，絮凝物造成茶飲料感官上的難以接受性成了整個(gè)茶飲料行業(yè)內(nèi)的共性問題，也是重要技術(shù)難題[2]。要解決普洱茶絮凝問題，首先要明確參與絮凝物形成的核心化學(xué)成分的種類。已有研究表明，茶飲料中絮凝物的產(chǎn)生是茶葉中多酚類、多酚氧化產(chǎn)物、蛋白質(zhì)、生物堿以及金屬離子等多種化合物通過氫鍵、離子鍵、疏水作用等相互作用的結(jié)果[3-6]。但這些研究大多集中于綠茶和紅茶，對(duì)于絮凝情況嚴(yán)重的普洱茶鮮有報(bào)道。且對(duì)于絮凝物成分的測(cè)定大多聚焦于常規(guī)化學(xué)成分，缺乏廣泛而深入的系統(tǒng)研究。

傅里葉變換紅外光譜技術(shù)（FTIR）是進(jìn)行未知化合物分子組成和結(jié)構(gòu)鑒定、有機(jī)化合物官能團(tuán)定性、研究分子內(nèi)部及分子間相互作用的有力工具[7]。超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜儀（UPLC-QTOF-MSE）聯(lián)用技術(shù)是超高效液相分離系統(tǒng)（ACQUITY UPLC I Class）和超高靈敏度的高分辨質(zhì)譜（Xevo G2-XS QTOF）的完美結(jié)合。超高效液相分離系統(tǒng)能夠提供極佳的分離效果，高分辨質(zhì)譜可以提供高分辨和高靈敏度的分析鑒定能力，該方法已廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物中未知化合物的鑒定[8-9]。UNIFI是基于Oracle數(shù)據(jù)庫的軟件，該軟件以UPLC/MSE為基礎(chǔ)，既可以控制儀器對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行MSE采集，又可高效處理數(shù)據(jù)并能生成報(bào)告[10-11]。本實(shí)驗(yàn)利用FTIR、UPLC-QTOF-MSE技術(shù)結(jié)合UNIFI天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫對(duì)普洱茶茶湯及絮凝物中的化學(xué)成分進(jìn)行快速鑒定，旨在為普洱茶飲料絮凝問題的解決提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器

1.1.1 試驗(yàn)材料

普洱茶購自浙江美町寶植物科技（中國）有限公司。

1.1.2 主要儀器

Thermo Nicolet iS10TM 傅 里 葉 變 換 紅 外光譜儀（美國賽默飛世爾科技公司），Waters ACQUITY UPLC I Class 超高效液相色譜系統(tǒng)（美國沃特世公司），Xevo G2-XS QTOF高分辨率飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（美國沃特世公司），H1850R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（湘儀離心機(jī)儀器有限公司），LRH-250F生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.1.3 試劑

乙腈為LC-MS級(jí)色譜純，購自美國賽默飛世爾科技公司；水為超純水，其余試劑為分析純。

1.2 樣品前處理

1.2.1 茶湯制備

準(zhǔn)確稱取 50 ～ 100 g 普洱茶置于萃茶桶中，按 1 ∶20 ～ 1 ∶10 的茶水比，用 70℃ ～ 90℃的萃茶水進(jìn)行萃取。萃茶過程采用間歇式攪拌（攪拌 2 min，靜置 1 min），萃取時(shí)間控制在 12 ～30 min。萃取結(jié)束后，茶湯和茶葉共同倒入方桶上方的篩網(wǎng)，靜置5 ～ 10 min，確保茶湯與茶葉充分分離，茶湯全部進(jìn)入方桶中。茶湯依次經(jīng)過1.5 mm粗濾、150目篩網(wǎng)、40目單聯(lián)或雙聯(lián)過濾器進(jìn)行渣液分離。茶湯全部進(jìn)入萃取液灌，冷卻至 1℃ ～ 15℃。茶湯冷卻后保持靜置 5 ～ 10 min。然后對(duì)茶湯進(jìn)行離心分離，離心機(jī)轉(zhuǎn)速8000 ～ 12000 rpm，離心 20 ～ 30 min。離心后將茶湯經(jīng)過138℃、30 s殺菌并灌裝，然后將茶湯冷卻至 1℃ ～ 15℃貯存待用。

1.2.2 加速茶湯樣品制備

將上述茶湯放入45℃生化培養(yǎng)箱中，分別進(jìn)行1 d、2 d、3 d以及長時(shí)間（＞ 7 d）加速處理，處理后的樣品取出冷卻至1℃ ～ 15℃貯存待用。

1.2.3 茶湯絮狀物的富集

將經(jīng)過長時(shí)間加速的茶湯靜置，棄去上清液，將瓶底部無法去除的茶湯及絮狀物倒入離心管，離心機(jī)轉(zhuǎn)速 8000 ～ 12000 rpm 離心 20 ～30 min。棄去離心管上清液，得到茶湯絮狀物。將冷凍離心獲得的絮凝物通過90℃熱水復(fù)溶解后得到絮狀物液體。

1.3 FTIR 檢測(cè)條件

將1.2.3處理過程中得到的絮狀物常溫晾干，然后取樣進(jìn)行紅外光譜分析。測(cè)量范圍為400 ～4000 cm-1，光譜分辨率為 4 cm-1，選用衰減全反射光譜（ATR）模式，光譜范圍 580 ～ 4000 cm-1。

1.4 UPLC 檢測(cè)條件

取 茶 湯 上 清 液 2 mL 過 0.22 μm 孔 徑 濾膜，然后上樣進(jìn)行UPLC-QTOF-MSE分析。色譜柱為 Waters ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），以水（A）-乙腈（B）為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫：0 ～ 2 min，0% ～ 2%B；2 ～ 10 min，2% ～ 98%B；10 ～ 12 min，98%B；12 ～ 12.5 min，98% ～ 2%B；12.5 ～ 15 min，2%B。柱溫40℃，體積流量0.3 mL/min，進(jìn)樣體積2 μL。

1.5 MS 檢測(cè)條件

采用電噴霧離子源（ESI），正、負(fù)離子模式，霧化氣（N2）體積流量為1000 L/h，脫溶劑氣溫度為550℃，錐孔氣流量為50 L/h，離子源溫度120℃，錐孔電壓為20 V，毛細(xì)管電壓為（ESI+）3.0 kV 和（ESI-）2.5 kV；MSE 掃描模式檢測(cè)，掃描范圍為 50 ～ 1200 m/z。

2 結(jié)果與分析

2.1 傅里葉變換紅外光譜分析結(jié)果

傅里葉變換紅外光譜可以客觀體現(xiàn)所測(cè)物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)，光譜圖中每個(gè)吸收峰都對(duì)應(yīng)于不同分子及其所含基團(tuán)的振動(dòng)形式[7]。本試驗(yàn)分別對(duì)70℃和90℃萃取的茶湯絮凝物進(jìn)行傅里葉變換紅外光譜測(cè)定。從圖1可以看出，70℃下絮凝物的紅外光譜中，3264 cm-1附近的極強(qiáng)且寬的吸收峰主要?dú)w屬于羥基（-OH）的伸縮振動(dòng)[12-13]，說明絮凝物中存在醇類和酚類化合物；1685 cm-1為酰胺Ⅰ帶吸收峰，同時(shí)還可能有多糖振動(dòng)吸收的貢獻(xiàn)，由茶多酚、咖啡堿、茶多糖及蛋白質(zhì)的C=O伸縮振動(dòng)產(chǎn)生[14]，由于蛋白質(zhì)及茶多糖含量很小，對(duì)光譜的影響較小，所以認(rèn)為此峰對(duì)應(yīng)普洱茶中的化合物為兒茶素類和咖啡堿，這與羅婧和許娜等的研究結(jié)果一致[15-16]；1589 cm-1為蛋白質(zhì)肽鍵酰胺Ⅱ帶偶合峰，歸屬為N-H的彎曲振動(dòng)和C-N的伸縮振動(dòng)[12,17]，說明此吸收峰對(duì)應(yīng)的化合物為蛋白質(zhì)及氨基酸[18]；1490 cm-1和 1441 cm-1可由苯環(huán)上的C=C伸縮振動(dòng)產(chǎn)生；1373 cm-1和1317 cm-1吸收峰是由于羧酸（COO-）的C-O伸縮振動(dòng)產(chǎn)生，此吸收峰與多酚氧化產(chǎn)物及含量有關(guān)[19]，說明絮凝物中可能存在多酚的氧化產(chǎn)物如茶黃素、茶紅素或茶褐素；由于吸收頻率在1000 ～1300 cm-1范圍內(nèi)為醇、酚、酯等類的C-O或C-O-C伸縮振動(dòng)吸收 峰，故 1260 cm-1、1192 cm-1、1102 cm-1和 1065 cm-1處吸收峰的變化分別由絮凝物中茶多酚中的酚、叔醇、仲醇和伯醇產(chǎn)生[19]；919 cm-1、829 cm-1和 752 cm-1屬 于 950 cm-1以下的指紋區(qū)[20]，此區(qū)域?qū)Ψ肿咏Y(jié)構(gòu)十分敏感，細(xì)微變化會(huì)引起吸收峰位置和強(qiáng)度明顯變化，由芳烴的C-OH彎曲振動(dòng)及C-H變形振動(dòng)產(chǎn)生，意味著樣品中具有較多的芳烴類物質(zhì)成分，如茶多酚，就是芳烴的含羥基衍生物。

圖1 70℃、90℃下茶湯絮凝物的傅里葉變換紅外光譜圖Figure 1 then fourier transform infrared transform spectra of tea soup flocs at 70℃ and 90℃

90℃下絮凝物的紅外光譜與70℃差別可視為由萃取溫度不同所致，主要涉及各吸收峰的強(qiáng)度和位置的變化，對(duì)應(yīng)于其中化合物結(jié)構(gòu)和含量的變化。由此可推斷普洱茶茶湯絮凝物中可能含有兒茶素類、咖啡堿、蛋白質(zhì)（氨基酸）及茶多酚氧化產(chǎn)物類。

2.2 常溫樣品、加速茶湯樣品與茶湯絮凝物樣品的總離子流圖

本研究采用UPLC-QTOF-MSE技術(shù)分別檢測(cè)普洱茶茶湯常溫樣品以及45℃加速樣品和絮狀物樣品的極性和非極性組分，通過分析不同處理?xiàng)l件下普洱茶化學(xué)成分變化情況以及絮狀物90℃復(fù)溶后液體成分，以推斷茶湯絮凝物的形成機(jī)理及可能存在的化學(xué)成分。因此本研究分別采用正離子模式和負(fù)離子模式對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，比較不同處理?xiàng)l件下樣品的輪廓差異，得到其原始譜圖及數(shù)據(jù)。如圖2所示，為正、負(fù)離子模式下的常溫樣品、加速茶湯樣品與茶湯絮狀物樣品的總離子流圖。由圖可知，正、負(fù)離子采集模式下常溫茶湯樣品及不同加速時(shí)間點(diǎn)茶湯樣品與茶湯絮凝物樣品相比總離子流圖均存在峰強(qiáng)度的差異，表明常溫普洱茶湯及加速普洱茶湯與茶湯絮凝物的化學(xué)成分有所差異。

圖2 正、負(fù)離子模式下常溫樣品、加速茶湯樣品與茶湯絮凝物的總離子流圖Figure 2 Total ion current (TIC) chromatogram of the normal temperature sample, accelerated tea soup samples and tea soup flocs in positive and negative ions mode

2.3 化合物鑒定結(jié)果

應(yīng)用UPLC-QTOF-MSE模式采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)，并采用UNIFI數(shù)據(jù)庫中的自動(dòng)識(shí)別處理系統(tǒng)對(duì)普洱茶茶湯及絮凝物中的化學(xué)成分進(jìn)行自動(dòng)鑒別。通過UNIFI數(shù)據(jù)庫自動(dòng)檢出再結(jié)合文獻(xiàn)檢索及人工核對(duì)，共檢測(cè)到多種化合物，其中對(duì)27個(gè)化合物進(jìn)行了歸屬，包括黃烷醇類、黃酮醇類、黃酮類、異黃酮類、酚酸類化合物和氨基酸、咖啡堿等化合物，結(jié)果見表1和表2。

表1 正離子模式下茶湯及絮凝物化學(xué)成分的UPLC-Q-TOF-MSE鑒定結(jié)果Table 1 Identification of chemical components from tea soup and flocs by UPLC-Q-TOF-MSE in positive ion mode

表2 負(fù)離子模式下茶湯及絮凝物化學(xué)成分的UPLC-Q-TOF-MSE鑒定結(jié)果Table 2 Identification of chemical components from tea soup and flocs by UPLC-Q-TOF-MSE in negative ion mode

2.4 參與普洱茶絮凝的化合物

2.4.1 多酚類化合物

2.4.1.1 黃烷類化合物

茶湯中的多酚類物質(zhì)主要以黃烷醇類化合物為主，占茶多酚含量的60% ～ 80%左右[21]。如圖3所示，在常溫以及不同時(shí)間處理下的普洱茶湯中共鑒定出5種黃烷醇類化合物，其中含有4種主要兒茶素類化合物：兒茶素、表兒茶素、兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素，且這4種兒茶素含量呈顯著下降趨勢(shì)，表明兒茶素類化合物可能與其他化合物相互作用從而形成茶絮凝?，F(xiàn)有研究表明，兒茶素參與形成茶絮凝的機(jī)理源于其分子結(jié)構(gòu)中含有較多的羥基，由于共軛效應(yīng)，極易與其他化合物（如咖啡堿和蛋白質(zhì)等）形成氫鍵締合物，締合度的不斷增加帶來的是其分子量及粒徑不斷增大，導(dǎo)致茶湯由清轉(zhuǎn)渾，嚴(yán)重時(shí)可形成絮狀物沉淀析出[22]。此外有研究表明，酯型兒茶素由于C環(huán)上帶有沒食子?；鶊F(tuán)，比非酯型兒茶素?fù)碛懈嗟牧u基，這些基團(tuán)猶如爪子一樣可將咖啡堿等其他化合物牢牢地抓住，所以更容易參與茶絮凝的形成[23]。另一種黃烷醇類化合物為原花青素B1，在樣品中的響應(yīng)規(guī)律和兒茶素類似，隨著加速時(shí)間的延長，原花青素B1含量呈顯著下降趨勢(shì)，表明原花青素B1可能同樣與其他化合物相互作用，參與茶絮凝的形成。原花青素B1為一分子兒茶素和一分子表兒茶素通過C-C鍵連接而形成的二聚體結(jié)構(gòu)[24]，推測(cè)其參與茶絮凝的機(jī)理與兒茶素類似，同樣通過氫鍵作用與其他化合物形成絡(luò)合物，且由于原花青素B1為二聚體結(jié)構(gòu)，含有較多的酚羥基，能夠提供更多的結(jié)合位點(diǎn)，其參與茶絮凝的機(jī)會(huì)更大。

2.4.1.2 黃酮類化合物

黃酮類化合物是植物多酚最主要的一大類化合物，包括黃酮類、黃酮醇類以及異黃酮類，其很少以游離形式存在，大多與糖或碳結(jié)合成糖苷或C-苷[25]。有研究表明，在綠茶茶湯中黃酮類化合物是參與茶湯絮凝形成的重要組分[4]，但所占比例較小，約占總絮凝物的2.26% ～3.21%[5]。如圖3所示，在常溫以及不同時(shí)間處理下的普洱茶中共鑒定出5種主要黃酮類化合物：芹黃苷、6''-O-乙?；S豆黃苷、木犀草素、木犀草素-7-O-葡萄糖苷、木犀草素7-芹糖（1-2）-葡萄糖苷；6種主要黃酮醇類化合物：槲皮素、二氫槲皮素、槲皮素-3-O-葡萄糖-7-O-鼠李糖苷、槲皮素-3-O-半乳糖苷、槲皮素-3'-硫酸鹽、山奈酚-3-O-蕓香糖苷；3種主要異黃酮類化合物：3'-羥基染料木黃酮、大豆苷元-7-O-葡萄糖醛酸苷、5,7-二羥基-8,4'-二甲氧基異黃酮。其中6''-O-乙?；S豆黃苷、木犀草素及其糖苷、槲皮素及其糖苷在加速時(shí)期的響應(yīng)值呈衰減趨勢(shì)，且在絮凝物中均有較高的響應(yīng)值，說明這幾種化合物均有可能與其他化合物反應(yīng)，參與茶絮凝的形成；而芹黃苷和山奈酚-3-O-蕓香糖苷在加速早期響應(yīng)值呈衰減趨勢(shì)，加速后期又呈上升趨勢(shì)，說明茶湯中一直存在化合物間的反應(yīng)，絮凝物中也有較高響應(yīng)值，說明芹黃苷與山奈酚-3-O-蕓香糖苷也有可能是絮凝物的一部分；3種主要異黃酮類化合物響應(yīng)值在加速期間有增長的趨勢(shì)，說明45℃加速促進(jìn)了異黃酮類化合物的生成，至于其是否參與絮凝的形成還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。關(guān)于黃酮類化合物參與絮凝的報(bào)道較少，但確有研究表明在絮凝物中檢測(cè)到黃酮類化合物，如黃酮醇糖苷[3]。推測(cè)其形成絮凝物的機(jī)理是由于其分子結(jié)構(gòu)上具有一定數(shù)量的酚羥基，能夠提供氫鍵結(jié)合位點(diǎn)。但糖苷與其他極性基團(tuán)會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性占據(jù)這些位點(diǎn)，從而間接影響多酚類與其他化合物的締合[26]。

2.4.1.3 其它酚類化合物

如圖3所示，在絮凝物中發(fā)現(xiàn)沒食子酸響應(yīng)值非常高，說明沒食子酸參與絮凝物的形成。同樣在不同樣品中發(fā)現(xiàn)另外兩種酚酸：二羥基苯甲酸與咖啡酸有響應(yīng)，且響應(yīng)值隨著加速時(shí)間的延長呈顯著下降趨勢(shì)，表明這兩種酚酸可能與其他化合物相互作用參與茶絮凝的形成，這與之前的研究結(jié)果類似[4]。沒食子酸參與絮凝形成的機(jī)理可能是由于其苯環(huán)結(jié)構(gòu)上含有羥基，可作為氫鍵結(jié)合位點(diǎn)與其他化合物發(fā)生締合反應(yīng)。在絮凝物中發(fā)現(xiàn)連苯三酚（焦性沒食子酸）也有較高的響應(yīng)值，說明連苯三酚參與絮凝物的形成。不難推測(cè)，連苯三酚參與絮凝的主要原因同樣是由于其分子結(jié)構(gòu)中含有3個(gè)酚羥基，能夠與咖啡堿或蛋白質(zhì)分子中的極性基團(tuán)形成氫鍵。但由于連苯三酚分子量較小，如果其濃度不夠大時(shí)應(yīng)該很難形成大分子的締合物。有研究報(bào)道，連苯三酚能夠與茶湯溶液中的蛋白質(zhì)反應(yīng)，如果它們?cè)谌芤褐械臐舛茸銐虼?，有可能推?dòng)有利于多酚-蛋白質(zhì)復(fù)合物的平衡，從而在蛋白質(zhì)表面形成簡(jiǎn)單酚分子的疏水層，當(dāng)締合度加劇，分子粒徑會(huì)進(jìn)一步增加，最終導(dǎo)致絮凝物的產(chǎn)生[27]。Reddy等[28]通過C-NMR技術(shù)研究沒食子酸、焦性沒食子酸、兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯與膠原蛋白的互作機(jī)理時(shí)發(fā)現(xiàn)，沒食子酸除了通過羥基形成氫鍵，還可通過羧基與蛋白結(jié)合。而焦性沒食子酸分子中只存在羥基不存在羧基，因而與蛋白結(jié)合能力極弱，所以發(fā)現(xiàn)4種酚類與膠原蛋白的結(jié)合能力結(jié)果為：表沒食子兒茶素沒食子酸酯＞兒茶素＞沒食子酸＞焦性沒食子酸。

圖3 常溫樣品、加速茶湯樣品與茶湯絮凝物中多酚類化合物響應(yīng)值的變化Figure 3 Changes of response values of polyphenols in normal temperature samples, accelerated tea soup samples and tea soup flocs

2.4.2 咖啡堿

咖啡堿是茶葉中最主要的生物堿，含量顯著高于其他嘌呤堿如可可堿和茶堿[29]。如圖4所示，在不同樣品中發(fā)現(xiàn)咖啡堿響應(yīng)值非常高，且隨著加速時(shí)間的延長咖啡堿含量呈顯著下降趨勢(shì)，說明咖啡堿參與茶絮凝的形成。在絮凝物中咖啡堿的響應(yīng)值達(dá)到852553，說明絮凝物中有較高含量的咖啡堿。這與烏龍茶絮凝物化合物鑒定結(jié)果吻合，研究人員通過C-NMR核磁共振技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，烏龍茶茶湯絮凝物中主要化合物為兒茶素類和咖啡堿[30]。有研究表明，咖啡堿可與兒茶素及其氧化產(chǎn)物（如茶黃素、茶紅素等）形成締合物導(dǎo)致茶湯絮凝沉淀[31]?？Х葔A分子中含有兩個(gè)酮胺基，可與其他含羥基化合物中的羥基反應(yīng)，形成氫鍵締合物。另外咖啡堿分子在1,3,5,7處含有N原子，每個(gè)N原子具有一對(duì)孤對(duì)電子，同樣可以吸引多酚類化合物中羥基上的H原子，兩者互作形成氫鍵，生成氫鍵締合物。且締合物的形成同萃茶溫度及咖啡堿和茶多酚及其氧化產(chǎn)物的濃度密切相關(guān)[32]，溫度較高或濃度較低時(shí)咖啡堿及其他多酚化合物各自呈游離狀態(tài)，隨著溫度降低，締合加劇伴隨著粒徑增大，最終形成絮凝物[33]。通過X-射線衍射技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，兒茶素及其氧化產(chǎn)物與咖啡堿除了可通過氫鍵作用締合外，咖啡堿的六元環(huán)可與多酚的苯環(huán)間形成π-π堆積相互作用[34]。但不同的兒茶素類單體及其氧化產(chǎn)物與咖啡堿的結(jié)合比例不同，如EGCG、EC、ECG、GCG、茶黃素與咖啡堿結(jié)合的分子數(shù)之比分別為2∶2、1∶1、2∶4、2∶2和1∶2[35-37]。

圖4 常溫樣品、加速茶湯樣品與茶湯絮凝物中氨基酸類化合物及咖啡堿響應(yīng)值的變化Figure 4 Changes of response values of amino acids and caffeine in normal temperature samples, accelerated tea soup samples and tea soup flocs

2.4.3 氨基酸

茶的滋味及香氣呈現(xiàn)離不開茶湯中的氨基酸，但氨基酸的存在同樣對(duì)茶湯絮凝物的形成有顯著影響。氨基酸分子中含有酰胺基、氨基和羧基，這些基團(tuán)可提供孤對(duì)電子吸引多酚中羥基上的H原子從而形成氫鍵[3]。如圖4所示，在不同樣品中共檢出3種類型的氨基酸，分別是纈氨酸、天冬氨酸和異亮氨酸，這三種氨基酸的響應(yīng)值隨著加速時(shí)間的延長呈顯著下降趨勢(shì)。其中纈氨酸響應(yīng)值較高且在絮凝物中也有較高的響應(yīng)，說明纈氨酸參與茶絮凝的可能性更大。而天冬氨酸和異亮氨酸僅在茶湯中有響應(yīng)且響應(yīng)值很低，在絮凝物中并無響應(yīng)，推測(cè)可能是由于這兩種氨基酸含量較少，形成的締合物分子量較小，不足以形成大分子絮凝物。這與前人研究分析吻合，其指出在氨基酸（蛋白質(zhì)）濃度較低時(shí)其不能提供足夠的結(jié)合位點(diǎn)與多酚交聯(lián)，形成的單層結(jié)構(gòu)難以絮凝；而在高濃度下，通過將多酚絡(luò)合到蛋白質(zhì)上，多酚未結(jié)合的羥基又可以通過氫鍵同另一蛋白質(zhì)分子結(jié)合，使締合物分子直徑迅速增大，當(dāng)相對(duì)分子質(zhì)量足夠大時(shí)就形成白色棉絮狀物漂浮在茶湯中[27,38]。由于蛋白質(zhì)是由多個(gè)氨基酸脫水縮合而成，所以其與多酚形成絡(luò)合物的機(jī)理也是通過氫鍵作用，其中還包括蛋白質(zhì)疏水基團(tuán)與多酚分子間的疏水相互作用[39]。蛋白質(zhì)（氨基酸）與茶多酚的作用強(qiáng)弱除了取決于蛋白質(zhì)（氨基酸）濃度的大小，還取決于多酚類物質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)的多少。研究表明，酯型兒茶素如ECG與EGCG由于有沒食子?；拇嬖?，含有更多的酚羥基，因此與蛋白質(zhì)結(jié)合的能力較非酯型兒茶素強(qiáng)[40-41]。

3 討論

本試驗(yàn)研究采用FTIR光譜技術(shù)對(duì)普洱茶茶湯絮凝物進(jìn)行測(cè)定，經(jīng)過對(duì)光譜圖中每個(gè)吸收峰位置及強(qiáng)度的研究，結(jié)合茶葉中各化學(xué)成分官能團(tuán)對(duì)吸收峰產(chǎn)生的影響分析，推測(cè)絮凝物中可能存在的化合物為兒茶素類、咖啡堿、蛋白質(zhì)（氨基酸）及茶多酚氧化產(chǎn)物類化合物。表明采用FTIR光譜技術(shù)可以作為普洱茶絮凝物化學(xué)成分判斷的初步依據(jù)。

本試驗(yàn)研究采用UPLC-QTOF-MSE技術(shù)分別對(duì)普洱茶茶湯常溫樣品以及45℃加速樣品和絮狀物樣品進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果顯示常溫茶湯樣品及不同加速時(shí)間點(diǎn)茶湯樣品與茶湯絮凝物樣品相比正、負(fù)離子模式下的總離子流圖均存在峰強(qiáng)度的差異，表明不同處理?xiàng)l件下化學(xué)成分有所差異。經(jīng)過對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)的分析，并結(jié)合UNIFI天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫對(duì)其進(jìn)行化學(xué)成分自動(dòng)鑒別，再結(jié)合文獻(xiàn)檢索核對(duì)，共檢測(cè)到多種化合物信號(hào)，并對(duì)其中27種化合物進(jìn)行了歸屬，包括黃烷醇類、黃酮醇類、黃酮類、異黃酮類、酚酸類化合物及氨基酸、咖啡堿等化合物，與前人研究結(jié)果吻合。因此，采用UPLC-QTOFMSE技術(shù)結(jié)合UNIFI天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫可以完成對(duì)普洱茶絮凝物化學(xué)成分的鑒定。

已有研究表明，普洱茶含有豐富的生物活性成分，而有些物質(zhì)如茶多酚、多酚氧化產(chǎn)物、咖啡堿、蛋白質(zhì)、茶多糖、果膠及金屬離子等的存在，易使茶湯冷卻后產(chǎn)生“冷后渾”現(xiàn)象[42]。但本次液-質(zhì)聯(lián)用對(duì)其絮凝物進(jìn)行檢測(cè)時(shí)并未鑒定到文獻(xiàn)報(bào)道過的茶黃素、葉綠素及多糖成分，推測(cè)可能這些成分在普洱茶的絮凝物中所占比例較低，未能達(dá)到檢測(cè)下限。

另外有研究表明，不同產(chǎn)地、不同發(fā)酵年份的普洱茶其所含化學(xué)成分有所不同[43-44]，這些因素也會(huì)導(dǎo)致參與絮凝物的化學(xué)成分及含量上存在差異。今后還需進(jìn)行不同產(chǎn)地、不同發(fā)酵年份、不同季節(jié)及不同等級(jí)等的普洱茶茶湯絮凝物進(jìn)行化合物鑒定，進(jìn)而為普洱茶飲料絮凝問題的解決提供理論依據(jù)。