2種酰胺類殺菌劑對4種非靶標(biāo)生物的急性毒性

楊石有，張 蕊，孔 瓊，蒲金基，袁盛勇*，張 賀*

（1.紅河學(xué)院生物科學(xué)與農(nóng)學(xué)學(xué)院云南省高校滇南特色生物資源研究與利用重點(diǎn)實驗室，云南蒙自 661199；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所，海口 571101）

酰胺類殺菌劑是一類化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有酰胺結(jié)構(gòu)的殺菌劑，在殺菌劑市場中占有相當(dāng)重要的地位[1]。從1966年第一個酰胺類殺菌劑萎銹靈被開發(fā)成功至今，酰胺類殺菌劑經(jīng)過近60年的發(fā)展，已經(jīng)有數(shù)十個品種，尤其是近些年通過雜環(huán)及氟原子的引入，不斷出現(xiàn)了一些結(jié)構(gòu)新穎的酰胺類殺菌劑品種。目前，酰胺類殺菌劑已成為年銷售額增長速率最快，最為活躍的殺菌劑品種之一[2-3]。噻呋酰胺是美國孟山都公司開發(fā)的噻唑酰胺類殺菌劑，具有用量少、藥效高、內(nèi)吸傳導(dǎo)性強(qiáng)和持效期長等特點(diǎn)，通過抑制琥珀酸脫氫酶的形成導(dǎo)致菌體死亡，對多種病原菌具有較好的防效，尤其是對紋枯病防效較好[4-6]。環(huán)酰菌胺是由德國拜爾公司于1989年開發(fā)的新型酰胺類內(nèi)吸性殺菌劑，主要抑制病原菌甾醇的生物合成，可用于防治灰霉病[7]。

酰胺類殺菌劑作為殺菌劑的重要類別，在作物病害防治方面發(fā)揮著重要作用。然而，由于我國目前施藥器械多以手動或小型機(jī)器為主，藥液霧滴粒徑較大，導(dǎo)致在靶標(biāo)葉片上的沉積量較少，很大部分藥液發(fā)生飄移而流失到空氣、水體、土壤中，給環(huán)境造成了嚴(yán)重的污染[8]。據(jù)調(diào)查，2017年我國手動噴霧器的市場占有率仍達(dá)80%[9]，其農(nóng)藥有效沉積率僅為10%~30%[10]。隨著國家重點(diǎn)研發(fā)計劃“化學(xué)肥料和農(nóng)藥減施增效綜合技術(shù)研發(fā)”項目的實施，農(nóng)藥器械和施藥技術(shù)得到快速發(fā)展，尤其是一些高效植保機(jī)械如自走式噴桿噴霧機(jī)[11]、植保無人飛機(jī)[12]、無人駕駛噴霧機(jī)器人[9]的發(fā)展，大大提高了我國的農(nóng)藥利用率。據(jù)報道，2020年我國水稻、小麥、玉米三大糧食作物上的農(nóng)藥沉積率為40.6%，比2015年提高4%[13]。雖然我國農(nóng)藥利用率整體得到較大提高，但還是有將近60%的農(nóng)藥未被充分利用而流失到環(huán)境中，對非靶標(biāo)生物帶來了巨大的挑戰(zhàn)。

農(nóng)藥對非靶標(biāo)生物的安全性評價是農(nóng)藥登記的必備材料，也是評價農(nóng)藥環(huán)境安全性的重要依據(jù)，對農(nóng)藥的科學(xué)合理使用具有重要的指導(dǎo)作用[14-15]。家蠶、蜜蜂、斑馬魚及蚯蚓是農(nóng)藥環(huán)境安全性評價研究中常用的靶標(biāo)對象，用于反映農(nóng)藥在空氣、水體、土壤中的暴露情況。目前，關(guān)于噻呋酰胺和環(huán)酰菌胺的研究主要集中在病害防治[4-7]、環(huán)境中的降解行為[4,16-17]等方面，而關(guān)于噻呋酰胺和環(huán)酰菌胺對非靶標(biāo)生物的急性毒性研究還較少，因此有必要開展其對非靶標(biāo)生物的安全性評價，了解其毒性情況，以期為該藥劑的使用提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 供試生物

意大利工蜂（Apis melliifera），購于海南省儋州市那大鎮(zhèn)養(yǎng)蜂場，挑選大小一致、活潑健康的成年工蜂饑餓2 h，用于急性經(jīng)口毒性試驗。

家蠶（Bombyx mori），卵塊購于山東廣通蠶種集團(tuán)有限公司，品種為‘菁松×皓月’，采用常規(guī)方法催青，于（25±2）℃、相對濕度為70%～85%的恒溫人工氣候箱中飼養(yǎng)。挑選健康活潑、大小一致的2齡蠶供試。

斑馬魚（Brachydanio rerio），購于海南省儋州市那大鎮(zhèn)花鳥市場，體長約為2 cm，于實驗室馴化7 d，挑選健康活潑、大小一致的幼魚進(jìn)行試驗，試驗前24 h停止喂食。

赤子愛勝蚯蚓（Eisenia foetida）購于天津賈立明蚯蚓養(yǎng)殖中心，于室內(nèi)避光馴養(yǎng)，待出現(xiàn)明顯繁殖環(huán)帶，挑選大小一致健康的成年蚯蚓進(jìn)行試驗。

1.2 供試藥劑

96%噻呋酰胺原藥，寧波三江益農(nóng)化學(xué)有限公司；98%環(huán)酰菌胺原藥，陜西恒潤化學(xué)工業(yè)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 意大利工蜂急性毒性試驗

參照GB/T 31270.10—2014《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準(zhǔn)則第10部分：蜜蜂急性毒性試驗》[18]，測定急性經(jīng)口毒性。在預(yù)試驗的基礎(chǔ)上，用50%的蔗糖水溶液分別將2種藥劑稀釋為5個濃度梯度，其中噻呋酰胺的濃度分別為100、200、300、400和500 mg/L，環(huán)酰菌胺的濃度分別為125、250、500、750和1 000 mg/L。取200 μL藥液分別加入離心管中，稱重后置于蜂籠中，向每個蜂籠中接入事先饑餓2 h的意大利工蜂各10頭，并置于黑布遮蓋的飼養(yǎng)架上，于3 h后取出離心管并稱重，記錄每組藥液的消耗量。之后替換為50%蔗糖水溶液飼養(yǎng)，以不添加藥劑的50%蔗糖水溶液為對照，每處理重復(fù)3次。分別于24和48 h觀察記錄意大利工蜂中毒癥狀和死亡數(shù)，計算48 h-LD50值，評價該藥劑對意大利工蜂的急性經(jīng)口毒性。

1.3.2 家蠶急性毒性試驗

參照GB/T 31270.11—2014《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準(zhǔn)則第11部分：家蠶急性毒性試驗》[19]，采用浸葉法進(jìn)行測定。在預(yù)試驗基礎(chǔ)上，分別設(shè)置5個藥劑濃度，其中噻呋酰胺藥劑濃度分別為200、300、400、500和600 mg/L，環(huán)酰菌胺藥劑濃度分別為4 000、5 000、6 000、7 000和8 000 mg/L，向不同藥劑溶液中分別添加50 μL吐溫-80，攪拌混合均勻即為試驗藥劑。將新鮮干凈的桑葉置于各濃度藥液中浸漬10 s，取出晾干后放入墊有濾紙的培養(yǎng)皿中，每皿分別接入20頭2齡家蠶，每處理重復(fù)3次，以清水和加體積分?jǐn)?shù)為1%丙酮的水溶液為對照。將各處理置于人工氣候箱內(nèi)在25℃條件下飼養(yǎng)，分別于24、48和96 h觀察家蠶的中毒癥狀及死亡情況，計算96 h-LC50值，評價該藥劑對家蠶的急性毒性。

1.3.3 斑馬魚急性毒性試驗

參照GB/T 31270.12—2014《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準(zhǔn)則第12部分：斑馬魚急性毒性試驗》[20]，采用半靜態(tài)法進(jìn)行測定。在預(yù)試驗的基礎(chǔ)上，用事先經(jīng)過脫氯處理的自來水將噻呋酰胺和環(huán)酰菌胺母液均稀釋為0.5、1、2、4和6 mg/L 5個濃度，挑選事先經(jīng)過實驗室馴化7 d，健康活潑，長約2 cm大小的幼魚，分別飼養(yǎng)于不同濃度藥液中，以事先脫氯處理并加入相同體積溶劑的自來水為空白對照，每處理重復(fù)3次，每重復(fù)10條斑馬魚。每隔24 h更換1次藥液，在試驗開始后6 h內(nèi)隨時觀察記錄受試魚的中毒及死亡情況，其后在24、48、72及96 h分別觀察斑馬魚的中毒癥狀及死亡情況，及時清除死魚，計算96 h-LC50值，評價該藥劑對斑馬魚的急性毒性。

1.3.4 赤子愛勝蚯蚓急性毒性試驗

參照GB/T 31270.15—2014《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準(zhǔn)則第15部分：蚯蚓急性毒性試驗》[21]，采用人工土壤接觸法進(jìn)行測定。在預(yù)試驗的基礎(chǔ)上，將人工土與藥液充分混勻后置于通風(fēng)櫥中蒸發(fā)去除丙酮，使毒土中噻呋酰胺濃度分別為50、100、200、300和500 mg/kg，環(huán)酰菌胺濃度分別為100、200、400、600和800 mg/kg。用蒸餾水將土壤含水量調(diào)至30%，以不含藥劑、含水量30%的人工土為對照，將土樣裝入標(biāo)本瓶中，挑選大小一致、出現(xiàn)明顯繁殖環(huán)帶的成年蚯蚓放入標(biāo)本瓶中，每處理重復(fù)3次，每重復(fù)放入10條蚯蚓。用紗布封口后置于（20±1）℃、相對濕度為80%～85%的人工培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于7和14 d觀察記錄蚯蚓的中毒及死亡情況，及時清除死亡的蚯蚓，計算14 d-LC50值，評價該藥劑對赤子愛勝蚯蚓的急性毒性。

1.4 數(shù)據(jù)處理分析及毒性評價

采用Probit回歸方法計算噻呋酰胺和環(huán)酰菌胺對4種非靶標(biāo)生物的LC50值和LD50值。毒性評價依據(jù)《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準(zhǔn)則》[18-22]中的標(biāo)準(zhǔn)，評價藥劑對意大利工蜂、家蠶、斑馬魚、赤子愛勝蚯蚓的毒性等級。

2 結(jié)果與分析

2.1 對意大利工蜂的急性毒性

本研究分別測定了噻呋酰胺和環(huán)酰菌胺對意大利工蜂的急性經(jīng)口毒性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)藥劑處理后24 h，高濃度處理組意大利工蜂出現(xiàn)輕微中毒癥狀，少量中毒意大利工蜂出現(xiàn)激烈飛行，然后行動逐漸變緩、靜止趴著不動，而低濃度處理組未出現(xiàn)中毒和死亡現(xiàn)象。48 h后，各濃度處理組意大利工蜂均出現(xiàn)了不同程度的中毒癥狀和死亡，中毒癥狀和死亡率與藥劑濃度成正比，中毒意大利工蜂身體出現(xiàn)顫抖、抽搐、蜷縮現(xiàn)象，翅膀呈“一”或“V”字形展開，同時腹部出現(xiàn)發(fā)黑現(xiàn)象，而試驗過程中對照組均未出現(xiàn)死亡。噻呋酰胺和環(huán)酰菌胺對意大利工蜂的48 h急性經(jīng)口毒性LD50值分別為6.51和9.12 μg/蜂（表1）。根據(jù)試驗準(zhǔn)則中農(nóng)藥對蜜蜂的毒性等級劃分標(biāo)準(zhǔn)[18]，噻呋酰胺和環(huán)酰菌胺對意大利工蜂的急性經(jīng)口毒性等級均為中毒。

表1 噻呋酰胺和環(huán)酰菌胺對意大利工蜂的48 h急性毒性

2.2 對家蠶的急性毒性

本研究分別測定了噻呋酰胺和環(huán)酰菌胺對家蠶的急性毒性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)處理組家蠶經(jīng)浸漬桑葉給藥24 h，家蠶未出現(xiàn)明顯的中毒癥狀，和對照組相比差異不大。給藥48 h后高濃度組家蠶出現(xiàn)頭部翹起、取食減少，少量家蠶出現(xiàn)吐液、死亡情況，而低濃度處理組與對照組無明顯差異，未出現(xiàn)死亡。給藥96 h后高濃度組家蠶出現(xiàn)吐液、體縮及死亡現(xiàn)象，低濃度處理組家蠶出現(xiàn)拒食現(xiàn)象，部分家蠶還出現(xiàn)晃頭、扭曲掙扎、假死現(xiàn)象，少量家蠶死亡，而試驗過程中對照組家蠶均未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。噻呋酰胺和環(huán)酰菌胺對家蠶的急性毒性96 h-LC50值分別為375.51和5 802.32 mg/L（表2）。根據(jù)試驗準(zhǔn)則中農(nóng)藥對家蠶的毒性等級劃分標(biāo)準(zhǔn)[19]，噻呋酰胺和環(huán)酰菌胺對家蠶的急性毒性等級為低毒。

表2 噻呋酰胺和環(huán)酰菌胺對家蠶的急性毒性（96 h）

2.3 對斑馬魚的急性毒性

本研究分別測定了噻呋酰胺和環(huán)酰菌胺對斑馬魚的急性毒性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著藥劑濃度的增加和染毒時間的延長，斑馬魚的中毒癥狀和死亡率呈逐漸增加趨勢。高濃度藥劑對斑馬魚的影響較大，斑馬魚在接觸藥劑短時間內(nèi)活動出現(xiàn)異常，表現(xiàn)為快速游動、時而竄動等中毒癥狀，隨后表現(xiàn)為反應(yīng)遲緩、游速減慢、側(cè)翻、鰓部發(fā)紅、魚體發(fā)白、腹部腫大并沉于水底。低濃度處理組斑馬魚中毒癥狀出現(xiàn)緩慢并出現(xiàn)少量死亡，而對照組未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。噻呋酰胺和環(huán)酰菌胺對斑馬魚的急性毒性96 h-LC50值分別為2.95和2.39 mg/L（表3）。根據(jù)試驗準(zhǔn)則中農(nóng)藥對魚類的毒性等級劃分標(biāo)準(zhǔn)[20]，噻呋酰胺和環(huán)酰菌胺對斑馬魚的急性毒性等級為中毒。

表3 噻呋酰胺和環(huán)酰菌胺對斑馬魚的急性毒性（96 h）

2.4 對赤子愛勝蚯蚓的急性毒性

本研究分別測定了噻呋酰胺和環(huán)酰菌胺對赤子愛勝蚯蚓的急性毒性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)空白對照組赤子愛勝蚯蚓活動正常，無死亡現(xiàn)象，藥劑處理組出現(xiàn)不同程度的死亡，死亡率與藥劑濃度和暴露時間呈正相關(guān)，低濃度藥劑對赤子愛勝蚯蚓影響不大。赤子愛勝蚯蚓在處理組土壤中暴露7 d后，高濃度處理組中的部分赤子愛勝蚯蚓出現(xiàn)身體潰爛、體液滲出等中毒癥狀，存活的赤子愛勝蚯蚓出現(xiàn)身體縮短變細(xì)、活動少、爬行困難、環(huán)帶膨大等中毒癥狀，而低濃度處理組中的赤子愛勝蚯蚓與對照組變化不大。在毒土中暴露14 d后，中毒癥狀逐漸加深，死亡率增加，高濃度處理組中的赤子愛勝蚯蚓出現(xiàn)身體斷裂、潰爛等癥狀，而低濃度處理組中的赤子愛勝蚯蚓出現(xiàn)少量死亡，身體變軟。噻呋酰胺和環(huán)酰菌胺對赤子愛勝蚯蚓的急性毒性14 d-LC50值分別為171.73和383.37 mg/kg干土（表4）。根據(jù)試驗準(zhǔn)則中農(nóng)藥對蚯蚓的毒性等級劃分標(biāo)準(zhǔn)[21]，噻呋酰胺和環(huán)酰菌胺對赤子愛勝蚯蚓的急性毒性等級為低毒。

表4 噻呋酰胺和環(huán)酰菌胺對赤子愛勝蚯蚓的急性毒性（14 d）

3 討 論

施藥技術(shù)的落后和農(nóng)藥的不合理使用，致使大量農(nóng)藥進(jìn)入環(huán)境中，對非靶標(biāo)生物帶來了巨大的風(fēng)險。開展農(nóng)藥對非靶標(biāo)生物的安全性評價是農(nóng)藥開發(fā)與應(yīng)用中必不可少的環(huán)節(jié)，急性毒性試驗操作簡單、快速，可在短時間內(nèi)確定農(nóng)藥對非靶標(biāo)生物的毒性高低，為慢性毒性試驗和藥劑使用提供依據(jù)和參考。

蜜蜂作為生態(tài)系統(tǒng)中的重要授粉昆蟲，經(jīng)口毒性試驗可模擬田間施藥后蜜蜂覓食受污染花粉的情況，反映污染物對蜜蜂的毒性大小。本研究中發(fā)現(xiàn)噻呋酰胺和環(huán)酰菌胺對意大利工蜂的急性經(jīng)口毒性等級均為中毒，因此，在藥劑使用時，應(yīng)盡量避開養(yǎng)蜂區(qū)、開花期或者選擇在無風(fēng)或微風(fēng)天氣施藥，避免藥劑飄移對蜜蜂產(chǎn)生毒害。農(nóng)藥除了對蜜蜂會產(chǎn)生直接毒殺作用外，亞致死劑量還會干擾蜜蜂的行為，如覓食、飛行和方向感等。張寶蘭等[22]發(fā)現(xiàn)低濃度阿維菌素會減弱蜜蜂的趨光性，造成蜜蜂的爬行、飛行等運(yùn)動能力不可逆的損傷。本試驗發(fā)現(xiàn)中毒意大利工蜂出現(xiàn)激烈飛行且無方向感、覓食降低、活動減弱等現(xiàn)象。

家蠶是重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲，桑葉在生長過程中容易受到周圍農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境和桑園自身防治病蟲害所用農(nóng)藥的污染，導(dǎo)致家蠶急性或慢性中毒事件時有發(fā)生，這桑業(yè)造成一定的損失[23]。本試驗中發(fā)現(xiàn)噻呋酰胺和環(huán)酰菌胺對家蠶的急性經(jīng)口毒性等級均為低毒，說明其對家蠶安全。農(nóng)藥除對家蠶產(chǎn)生直接影響外，低濃度農(nóng)藥還會造成家蠶慢性中毒，影響家蠶的生長發(fā)育、生理代謝和經(jīng)濟(jì)性狀，如眠蠶體重、全繭量、繭層量、繭層率、結(jié)繭率和化蛹率等[24-25]。本試驗對96 h處理未死亡的家蠶換為健康桑葉繼續(xù)飼養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)家蠶結(jié)繭率、化蛹率、繭層量等指標(biāo)均低于空白對照，說明噻呋酰胺和環(huán)酰菌胺會引起家蠶中毒，在藥劑使用時應(yīng)當(dāng)注意施藥濃度、次數(shù)、安全間隔期等，避免慢性毒性的產(chǎn)生。

魚類種群是水生生態(tài)系統(tǒng)重要的組成部分，斑馬魚是開展農(nóng)藥對魚類急性毒性和慢性毒性試驗的重要生物材料，可以反映農(nóng)藥進(jìn)入水體的風(fēng)險程度。本試驗中發(fā)現(xiàn)噻呋酰胺和環(huán)酰菌胺對斑馬魚的急性毒性等級均為中毒，這與沈艷、楊陽等[26-27]研究結(jié)果一致，二者均發(fā)現(xiàn)噻呋酰胺對斑馬魚的急性毒性為中毒。因此，在藥劑配制時應(yīng)盡量避開河道或溝渠，同時藥劑施用時應(yīng)盡量遠(yuǎn)離水源，嚴(yán)禁將使用完的農(nóng)藥包裝品丟棄至河道或溝渠。相同的農(nóng)藥有效成分，不同的劑型種類對斑馬魚的毒性存在差異，24%噻呋酰胺懸浮劑對斑馬魚的急性毒性為低毒，而本試驗中發(fā)現(xiàn)96%噻呋酰胺原藥對斑馬魚的急性毒性為中毒。張國福等[28]發(fā)現(xiàn)不同劑型苯醚甲環(huán)唑和嘧菌酯及其原藥對斑馬魚的急性毒性存在差異，毒性從高到低依次為原藥、懸浮種衣劑、懸浮劑、水分散粒劑，說明經(jīng)過劑型加工后可以降低藥劑對斑馬魚的毒性，故在噻呋酰胺和環(huán)酰菌胺的劑型加工過程中可適當(dāng)考慮向水分散粒劑或其他緩釋性劑型方向發(fā)展。

蚯蚓作為土壤中的主要非靶標(biāo)動物，對土壤富集營養(yǎng)和有機(jī)物、無機(jī)物的分解有著極其重要的作用[29]。蚯蚓對環(huán)境變化較為敏感，常作為模式生物用于土壤污染監(jiān)測[30]。農(nóng)藥是土壤污染物的重要來源，蚯蚓可通過皮膚直接接觸或取食土壤中受污染的食物而接觸農(nóng)藥，從而引起蚯蚓死亡或影響其生長。蚯蚓急性毒性的測定方法主要有濾紙接觸法、人工土壤法、飼喂法、注射法、浸入法、點(diǎn)滴法、強(qiáng)迫攝食法和自然土壤法等，人工土壤法為開展化學(xué)品對蚯蚓急性毒性試驗的標(biāo)準(zhǔn)方法[31]。本研究發(fā)現(xiàn)噻呋酰胺和環(huán)酰菌胺對赤子愛勝蚯蚓的急性毒性等級為低毒，14 d-LC50值分別為171.73和383.37 mg/kg干土，遠(yuǎn)高于國標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)（低毒14 d-LC50值＞10 mg/kg干土）。施海燕等[32]測定了噻呋酰胺在南京黃棕壤、東北黑土、江西紅壤中的降解，其半衰期分別為9.4、17.8和20.1 d；許振嵐等[33]測定了環(huán)酰菌胺在紅壤和水稻土中的降解，其半衰期分別為0.63和5.06 d。以上結(jié)果表明2種藥劑均為易降解藥劑，在土壤中的殘存期短，對蚯蚓的安全性較好。

開展農(nóng)藥對非靶標(biāo)生物的急性毒性試驗可在較快時間內(nèi)獲得農(nóng)藥對非靶標(biāo)生物的安全性數(shù)據(jù)，對農(nóng)藥的環(huán)境安全性評價和藥劑使用具有重要的指導(dǎo)作用。有關(guān)2種藥劑對4種非靶標(biāo)生物的慢性毒性還未知，本團(tuán)隊將在接下來的研究中繼續(xù)開展慢性毒性試驗，以期為2種藥劑的使用提供數(shù)據(jù)支撐。