異常原料乳中一株短小芽孢桿菌的分離與鑒定

劉祥杰，張家浩，邢瀟月，李虎，李蓮瑞*

（1.塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 新疆阿拉爾 843300；2.塔里木畜牧科技兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 新疆阿拉爾 843300；3.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木動(dòng)物疫病診斷與防控工程實(shí)驗(yàn)室 新疆阿拉爾 843300）

原料乳是從泌乳牛體內(nèi)擠出的未經(jīng)任何加工如純白絲綢般的乳液，奶味醇香，潤如滑脂，也稱為“生鮮乳”或“原奶”。隨著改革開放的腳步，牛乳成為了家家戶戶所必需的營養(yǎng)品。牛乳不再是只有少數(shù)的富人才能擁有的奢侈品，它早已轉(zhuǎn)變?yōu)椤帮w入尋常百姓家”的產(chǎn)品。隨著牛乳需求的增加，全國各地的乳品企業(yè)紛紛興起。牛乳已經(jīng)不單單只是拿來飲用，各種乳制品也應(yīng)運(yùn)而生。酸奶、奶酪、奶粉等已屢見不鮮。然而，牛乳的衛(wèi)生問題卻令人堪憂。微生物含量過高會(huì)導(dǎo)致原料乳快速腐敗變質(zhì)，微生物的種類不僅影響原料乳及乳制品的品質(zhì)，還可造成疾病暴發(fā)。

短小芽孢桿菌（bacillus pumilus）是一種短桿狀，能運(yùn)動(dòng)，兼性營養(yǎng)，革蘭氏陽性菌，同屬芽孢桿菌科屬[1,2]。牛乳在加工的過程中，必須要經(jīng)過高溫消毒滅菌，但也不能殺滅所有的細(xì)菌，也會(huì)有一些耐熱菌殘留，短小芽孢桿菌就是一種常見的耐熱菌，要在高溫（55℃）下才能培養(yǎng)出來。本研究通過對(duì)異常原料乳分離培養(yǎng)測(cè)序后，分離的菌株為短小芽孢桿菌。為今后原料乳的衛(wèi)生問題提供有力的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

樣品：原料乳，由阿拉爾乳業(yè)公司提供，取自原料乳儲(chǔ)存罐，機(jī)械隨機(jī)取樣。取回后4℃存放，以備后面分離短小芽孢桿菌。

1.2 試劑與儀器

實(shí)驗(yàn)試劑：95%乙醇溶液、結(jié)晶紫溶液、碘液、0.5%番紅乙醇溶液、錳鹽營養(yǎng)瓊脂、普通營養(yǎng)瓊脂、嗜冷菌計(jì)數(shù)瓊脂。

實(shí)驗(yàn)儀器：見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)儀器清單

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1）菌株的篩選、分離、純化。在潔凈工作臺(tái)里，在無菌錐形瓶中加入100mL 乳樣，置于80℃水浴20min 后，倍比稀釋5 個(gè)梯度后用涂布法分別接種于錳鹽（55℃）、普通（37℃）營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基倒置培養(yǎng)24～48h，嗜冷菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基（5℃）倒置培養(yǎng)5～7d，對(duì)菌落進(jìn)行形態(tài)觀察，選取不同的菌落，在平板上劃線培養(yǎng)。載玻片上加10μ L 無菌水，挑取純化的單菌落均勻涂布，自然晾干或酒精燈外焰烘干固定，進(jìn)行革蘭染色鏡檢。選取鏡檢有芽孢的單菌落，接種到細(xì)菌瓶中置于搖床過夜培養(yǎng)，增加菌體濃度。將分離的菌液與50%甘油溶液按1:1 比例混合均勻，凍存于-20℃和-80℃。

2）異常原料乳中短小芽孢桿菌DNA 的提取。無菌離心管中加菌液1mL，高速離心60s，棄上清，重復(fù)1 次，收集適量菌體沉淀。然后開始提取菌體DNA，提取完成后凍存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

3）異常原料乳中短小芽孢桿菌16s rRNA 擴(kuò)增。菌體DNA 提取按照DNA 提取試劑盒說明書進(jìn)行。采用細(xì)菌的通用引物16s 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)條件如下：27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' 和 1492R：5'-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3'；DNA模板1μ L，EasyTaq SuperMix12.5μ L，上、下游引物各0.5μ L，ddH2O 10.5μ L；94℃預(yù)變性 5min；94℃變性 30s，56℃退火30s，72℃延伸90s，72℃再延伸10 min，35 個(gè)循環(huán)。PCR 結(jié)束后，將產(chǎn)物置于1%瓊脂糖凝膠電泳，電泳到達(dá)第四小格觀察是否有目的條帶并拍照保存。

PCR 結(jié)束后，將產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳到達(dá)第四小格觀察是否有目的條帶并拍照保存。

4）短小芽孢桿菌16s rRNA 克隆與pMD-19T 載體自連克隆。

5）PCR 產(chǎn)物切膠回收。參照北京全式金生物技術(shù)有限公司膠回收試劑盒（L41118）說明書進(jìn)行切膠回收，回收產(chǎn)物保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

6）目的基因和pMD-19T 載體連接。該菌16s rRNA 的基因序列與pMD-19T 連接后轉(zhuǎn)化DH5α，提取質(zhì)粒送測(cè)序。

7）提取質(zhì)粒。質(zhì)粒提取根據(jù)質(zhì)粒小提試劑盒說明書進(jìn)行，質(zhì)粒DNA 保存?zhèn)溆?。質(zhì)粒DNA 用通用引物進(jìn)行擴(kuò)增，在1%瓊脂糖電泳后，觀察條帶大小。

8）測(cè)序。選取鑒定后的陽性質(zhì)粒DNA 送測(cè)序。

1.3 菌株16s rRNA 同源性及進(jìn)化樹分析

將序列在NCBI 上進(jìn)行BLAST 比對(duì)分析，選取同源序列，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的形態(tài)特征

該菌的菌落呈小而圓的淡黃色有光澤半透明隆突。革蘭氏染色，為兩極濃染，菌體中間有折光芽孢的革蘭氏陽性菌[1,2]，初步鑒定疑似短小芽孢桿菌，鏡檢結(jié)果顯示見圖1。

圖1 革蘭染色鏡檢結(jié)果圖（10× 100）

2.2 16s rRNA 的鑒定結(jié)果

1）16s rRNA 的擴(kuò)增結(jié)果如圖2。

圖2 16s rRNA 的擴(kuò)增結(jié)果

2）16s rRNA 質(zhì)粒的鑒定結(jié)果如圖3。

圖3 16s rRNA 質(zhì)粒的鑒定結(jié)果

3）異常原料乳中短小芽胞桿菌的16s rRNA 的測(cè)序結(jié)果。

細(xì)菌lxj 的序列如下：

GTTtCGGCTgTCACTTACAGAWGGACCGCGgCSCATtAGCT AGTtGGTGGGgTAaTGKcTCaCCAaGGcGRCGaTGSGTAGCSGAc CTGAGAGGGTGATCGgCCACAcTGGgACTGAGACaCggCCCAG ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGgAaTCTtCcGCAaTGgACGA AAGTCtGACGgAGCaACGCCGCGTGAGKGATGAaGgTTTTCgGA TCGTAAAGCTCTGTtGTTAGGGAaGAaCAaGTGCGAGAGTaACT GCTCGCACCTtGACGGTACCTAaCCAGAAAGcCACGGCTAACT ACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGT CCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAA GTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTG GAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTC CACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACC AGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGA GCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAG TCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCC GCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGG GGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGG GGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCA ACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACCC TAGAGATAGGGCTTTCCCTTCGGGGACAGAGTGACAGgTGGT GCATGRtTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTtGGGTtAAGTC CCGCAaCGAGCGCAaCCCTtGATCTtAGTtGCCAGCATTtAGTtG GGCACTCTaAGGTGACTGCCGgTGACAAACCGgAGgAaGGTgG GGATGACGTCAAaTCATCATGCCccTTATGACcTGGGCTACaCA CGTGCTACAATGRASAgAACAAAGGgCTcGCGAGAMCGcAaGg TTtAGCCAaTCCcATAAaTCTGTTCcTCAGTTCGgAT

4）16s rRNA 基因同源性與遺傳進(jìn)化樹分析。測(cè)序結(jié)果比對(duì)后，構(gòu)建了基因系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖4，圖5）。結(jié)果表明，該菌株與登錄號(hào)為ON287144、ON287180、MT704414、OM341623、OM346695、OM6583 69、ON165743、OM617828 的短小芽胞桿菌處于同一分支，且根據(jù)同源性分析，該菌株與短小芽孢桿菌的同源性為99%，綜上所述，確定為短小芽孢桿菌。

圖4 系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖5 同源性分析

3 討論

短小芽孢桿菌對(duì)乳品能夠產(chǎn)生不小的危害，社會(huì)上卻很少有關(guān)于短小芽孢桿菌能引起食物中毒的報(bào)道，可能是短小芽孢桿菌污染食品的機(jī)率小[3]，也可能是乳品企業(yè)的管理工作做得好。造成乳品污染的原因有很多種，可能是乳品生產(chǎn)環(huán)境中微生物，加工車間和加工生產(chǎn)設(shè)備[4]；也可能是原料乳的源頭出現(xiàn)問題，奶牛的生活環(huán)境、接觸生奶的用具、管道、工作人員的疏忽[5]、擠奶時(shí)沒有清洗牛乳房并棄去頭三把奶[6]等，這些都是不容忽視的關(guān)鍵。

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)原料乳儲(chǔ)存罐中的奶樣進(jìn)行一系列檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)原料乳中存在許多微生物，菌種繁多，非常豐富，不單單只是有害菌，還有一些有益菌。中國作為一個(gè)人口大國，對(duì)牛乳的需求也越來越多，乳品企業(yè)不能為了效益，而盲目的忽略食品安全。甚至一些黑心企業(yè)為了追求銷量，在牛乳中摻水，摻食鹽，摻一些非法添加劑，這不僅嚴(yán)重?fù)p害了人體健康，還欺騙了廣大消費(fèi)者。乳品安全問題一直存在，可能存在原料乳中，也可能存在生產(chǎn)加工環(huán)節(jié)。只有加大宣傳力度，重視乳品質(zhì)量，從最開始的源頭抓起，在擠奶時(shí)，在貯存運(yùn)輸時(shí)，在飼養(yǎng)管理中，在收乳、生產(chǎn)和檢驗(yàn)全過程中，重視每一個(gè)過程，嚴(yán)把質(zhì)量關(guān)，嚴(yán)格做到?jīng)]有檢測(cè)合格的乳樣禁止進(jìn)入市場(chǎng)。寧肯銷量少，也不質(zhì)量差。只有這樣，才能讓廣大消費(fèi)者喝到健康、安全的牛乳。