徐州市7株豬鏈球菌病原學(xué)分析及分子分型研究

吳畏畏，童 晶，杜陽光，馮歡歡，許艷平，畢 俊，周 強(qiáng)，祝雯雯

豬鏈球菌(Streptococcussuis)是一種人獸共患病病原體，根據(jù)其莢膜多糖的抗原性，豬鏈球菌可分為29個(gè)血清型，其中許多血清型如1、2、5、9、14、16、28和31型可以感染人類；其中豬鏈球菌2型是國內(nèi)外最常見的致病血清型，感染人可引起嚴(yán)重的中毒性休克綜合征等疾病[1]。研究發(fā)現(xiàn)豬鏈球菌的致病性與莢膜多糖(cps)、溶菌酶釋放蛋白(mrp)、細(xì)胞外蛋白因子(ef)、溶血素(sly)、纖連蛋白(fbps)和谷氨酸脫氫酶(gdh)等多種毒力基因相關(guān)[2-3]。豬鏈球菌感染的傳染源多為發(fā)病豬和健康帶菌豬，豬鏈球菌可定殖在豬的上呼吸道(尤其是鼻腔和扁桃體)、生殖道和消化道，研究報(bào)道健康豬帶菌率為20%～40%[4-5]。感染多發(fā)生在從事豬屠宰、養(yǎng)殖、加工和銷售的人群，發(fā)病前多有和病豬或病死豬(肉)的密切接觸[6-7]。本研究對2020年至2022年徐州市臨床病例分離豬鏈球菌進(jìn)行鑒定，并發(fā)現(xiàn)3例病人發(fā)病前均在手部皮膚有破損的情況下進(jìn)行屠宰或者處理豬(肉)的操作，采集了相關(guān)環(huán)境(售賣攤、養(yǎng)豬場和宰殺場所)及可能傳染源(豬咽拭子)等標(biāo)本進(jìn)行豬鏈球菌分離，對分離到的菌株進(jìn)行毒力基因檢測，并采用MLST和PFGE等分子分型方法進(jìn)行溯源分析，為豬鏈球菌感染的診斷、治療和科學(xué)防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 VITEK-2 Compact全自動微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)(法國生物梅里埃)，飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(鄭州安圖生物)，CO2培養(yǎng)箱(德國Binder公司)，PCR擴(kuò)增儀(美國ABI公司)，脈沖場凝膠電泳儀(美國Bio-Rad公司)，普通電泳儀及凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。細(xì)菌DNA提取試劑盒(天根DP302)，PCR試劑和PFGE酶SmaI(TAKARA)，豬鏈球菌2型/14型診斷單克隆抗體(萬泰生物)，毒力基因及管家基因引物由擎科生物工程有限公司合成。

1.2 病例信息 患者1：女，40歲；2020年4月10日左右在手部有傷情況下處理過豬肉；5月4日出現(xiàn)頭暈、頭痛、惡心、頸部疼痛，雙下肢乏力等癥狀；5日癥狀加重入院，發(fā)熱39.5 ℃，伴有寒戰(zhàn)、右側(cè)眼瞼下垂、雙耳聽力下降等癥狀；8日出現(xiàn)昏迷轉(zhuǎn)院。

患者2：男，54歲；2021年2月8日在手部有傷情況下加工生態(tài)黑豬，且過程中手被豬骨刺破；9日出現(xiàn)頭疼、惡心、牙齦和頸部疼痛、雙下肢乏力等癥狀；13日發(fā)熱38.5 ℃入院；16日出現(xiàn)昏迷轉(zhuǎn)院。

患者3：男，51歲；2021年11月28日，分割生態(tài)黑豬肉時(shí)手部被刺傷；12月15日出現(xiàn)發(fā)熱、頭痛等癥狀；24日病情加重入院；2022年1月1日發(fā)熱38.7 ℃，出現(xiàn)昏迷轉(zhuǎn)院。

1.3 分離和鑒定 2020-2022年傳染病報(bào)告信息管理系統(tǒng)共報(bào)告3起豬鏈球菌感染疫情，患者分離菌株均由徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院在血培養(yǎng)瓶報(bào)陽性后，接種至血平板后送徐州市疾控中心。市疾控中心進(jìn)行復(fù)核并開展流行病學(xué)調(diào)查和現(xiàn)場采樣工作，主要采集未食用的豬肉、砧板殘留的血液和碎肉、養(yǎng)殖場內(nèi)豬的鼻拭子等標(biāo)本，現(xiàn)場直接劃線接種哥倫比亞血平板，同時(shí)接種增菌液培養(yǎng)。豬鼻拭子和外環(huán)境涂抹拭子接種選擇性增菌液(含15 mg/mL多粘菌素B，30 mg/mL萘啶酮酸的腦心浸液肉湯)，增菌15 h后接種哥倫比亞血平板，與現(xiàn)場接種的血平板共同置于5% CO2培養(yǎng)箱，37 ℃培養(yǎng)24～48 h。挑取平板上可疑菌落革蘭氏染色鏡檢。對典型菌落進(jìn)行生化鑒定飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒定及Vitek-compact2系統(tǒng)生化鑒定，陽性菌株進(jìn)行血清凝集試驗(yàn)。

1.4 毒力基因檢測 按照試劑盒說明書提取豬鏈球菌DNA作為模板，參照現(xiàn)場細(xì)菌學(xué)[8]設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增豬鏈球菌經(jīng)典的4種毒力基因cps2J、mrp、ef和sly。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，60 ℃(cps2J、mrp)/56 ℃(ef)/51 ℃(sly)退火30 s，72 ℃延伸 1 min，35個(gè)循環(huán)，產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，引物序列見表1。

1.5 MLST分型 參考PubMLST(https://pubmlst.org/organisms/streptococcus-suis)給出的MLST分子分型方案[9-10]合成aroA、cpn、dpr、gki、mutS、recA和thrA7個(gè)管家基因引物，使用菌株DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件：95 ℃變性1 min，55 ℃(aroA、gki)/52 ℃(cpn、thrA)/50 ℃(dpr、mutS、recA)退火1 min，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)，產(chǎn)物送青島擎科梓熙生物公司測序，所得序列上傳PubMLST豬鏈球菌數(shù)據(jù)庫，引物序列見表1。

表1 豬鏈球菌毒力基因和MLST分型引物序列Tab.1 Virulence genes and MLST primers for S. suis

1.6 脈沖場凝膠電泳 參照中國疾病預(yù)防控制中心PulseNet China實(shí)驗(yàn)手冊制定的常見細(xì)菌脈沖場凝膠電泳實(shí)驗(yàn)操作規(guī)程，使用SmaI酶切，電泳參數(shù)：1～50 s電泳8 h，5 s電泳10 h。經(jīng)Gelred染色，清水漂洗后凝膠成像儀上拍攝圖像。采用BioNumerisc V7.6軟件對圖像處理，UPGMA進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié) 果

2.1 分離培養(yǎng)結(jié)果 對豬鼻拭子和外環(huán)境等標(biāo)本進(jìn)行分離培養(yǎng)24～48 h，血平板上可見灰白色、半透明、直徑1～2 mm的光滑菌落，菌落周圈有草綠色α溶血環(huán)，疑似豬鏈球菌；挑取典型單個(gè)菌落質(zhì)譜分析，在飛行時(shí)間質(zhì)譜結(jié)果給出可疑/可信的豬鏈球菌時(shí)，使用該菌落重新接種血平板分純；分純后的菌株及臨床送檢復(fù)核菌株進(jìn)行革蘭染色、生化鑒定和血清凝集試驗(yàn)，共分離鑒定出7株豬鏈球菌，包括3株臨床患者血樣本分離株、3株豬鼻拭子和1株外環(huán)境分離菌株。革蘭染色鏡下為典型的革蘭氏陽性鏈球菌，多為短鏈或不成鏈的球桿菌；其中2020年與2022年病人、2021年病人和豬鼻拭子分離株均為血清2型；通過2型/14型診斷單克隆抗體，2022年采集屠宰場環(huán)境(屠宰車間掛鉤血樣本)分離菌株未能確定血清型，詳見表2。

表2 7株豬鏈球菌分離鑒定情況Tab.2 Isolation and identification of seven S. suis strains

2.2 毒力基因和MLST分型結(jié)果 對分離到的7株豬鏈球菌進(jìn)行毒力基因檢測， 2021年分離的4株細(xì)菌均攜帶莢膜多糖基因(cps2J)、溶菌酶釋放蛋白基因(mrp)、細(xì)胞外蛋白因子基因(ef)和溶血素基因(sly)；2020年和2022年人源分離菌株僅攜帶部分毒力基因，為cps2J+、mrp-、ef+、sly+。管家基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序后通過上傳PubMLST豬鏈球菌數(shù)據(jù)庫比對，獲得3種豬鏈球菌ST型別，均為數(shù)據(jù)庫中已有型別，其中2021年4株(人源SS-2021001、豬源SS-2021002、SS-2021003、SS-2021004)豬鏈球菌均為ST7型；2020年和2022年病例菌株(SS-2020001、SS-2022001)為ST1型；2022年外環(huán)境菌株(SS-2022002)ST型別數(shù)據(jù)庫中不存在，未上傳7個(gè)管家基因等位基因號，因而未獲得新的ST型別。具體7株豬鏈球菌體毒力基因和MLST分型結(jié)果見表3。

表3 7株豬鏈球菌毒力基因和MLST檢測結(jié)果Tab.3 Virulence genes and MLST results of seven S. suis strains

2.3 PFGE結(jié)果 7株豬鏈球菌經(jīng)SmaI酶切后脈沖場凝膠電泳，PFGE聚類分析顯示有4種PFGE帶型，其中2021年分離到的人源菌株(SS-2021001)和3株豬源(SS-2021002～004)豬鏈球菌帶型相同，一致性為100%；4種帶型之間一致性小于80%，其中2022年屠宰場外環(huán)境分離株SS2022002與其它3種帶型之間一致性小于60%，PFGE聚類分析結(jié)果，見圖1。

圖1 7株豬鏈球菌PFGE分型結(jié)果Fig.1 PFGE results for seven S. suis strains

3 討 論

目前報(bào)道人感染豬鏈球菌的病例多數(shù)是由于直接接觸攜帶豬鏈球菌的豬所致，從事豬的養(yǎng)殖或者參與豬的屠宰、清洗、銷售及加工等人員均屬高危人群，尤其是宰殺病(死)豬者危險(xiǎn)性更大[11]；此外，食用生或者半熟豬肉產(chǎn)品也被認(rèn)為是引起豬鏈球菌腦膜炎的重要危險(xiǎn)因素[12]。根據(jù)患者描述，患者在發(fā)病前均在手部皮膚有破損的情況下處理過豬肉，其中患者2和患者3處理時(shí)被豬骨刺傷，表明豬鏈球菌感染主要通過手部破損傷口或豬骨刺傷傳播?；颊?處理豬品種不詳，患者2和患者3處理均為黑豬肉，采集樣本時(shí)患者2相關(guān)養(yǎng)殖場黑豬均表現(xiàn)為正常健康狀態(tài)，分離菌株毒力基因分布mrp+、ef+、sly+；患者3相關(guān)屠宰場采樣時(shí)由于采樣時(shí)間滯后，未采集到黑豬的樣本，分離到外環(huán)境菌株毒力基因分布mrp-、ef-、sly-；生態(tài)黑豬是否高攜帶豬鏈球菌強(qiáng)毒株值得進(jìn)一步的調(diào)查分析。

豬鏈球菌2型是致病性最強(qiáng)血清型別，也是我國人感染豬鏈球菌疫情的主要流行株，本研究中分離到的7株豬鏈球菌有6株為血清2型，3例臨床感染豬鏈球菌病例均為血清型2型，菌株致病力強(qiáng)，感染患者癥狀嚴(yán)重。此外豬鏈球菌致病力也取決于其毒力因子，因此對分離菌株的鑒定、血清分型以及毒力基因的檢測等在病人的診斷治療和疫情處置中十分重要。豬鏈球菌2型的毒力基因主要有cps2J、mrp、ef和sly等，目前認(rèn)為mrp和ef的表達(dá)與豬鏈球菌2型菌株的毒力有顯著關(guān)系，常被認(rèn)為是豬鏈球菌2型高致病性的標(biāo)志[13]。本研究中2021年從患者2和三株豬鼻咽分離到的2型豬鏈球菌，經(jīng)PCR鑒定為攜帶mrp、ef和sly基因的強(qiáng)毒株，與近年國內(nèi)致病性豬鏈球菌2型一致。3例病例均出現(xiàn)發(fā)熱、頭疼、昏迷等癥狀，發(fā)展為重癥病例，表現(xiàn)為腦膜炎型，特點(diǎn)是起病急、病情進(jìn)展快，且均在出現(xiàn)昏迷癥狀后轉(zhuǎn)院至徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院診治，查體共同特征：白細(xì)胞異常升高，中性粒細(xì)胞百分比均>90%；腦脊液淡黃透明，潘氏實(shí)驗(yàn)陽性。其中患者2發(fā)病潛伏期約1 d，而患者1和患者3潛伏期均較長，由于感染途徑、菌量及服藥等情況差異，潛伏期長是否與菌株缺失mrp基因有關(guān)有待研究。

多位點(diǎn)序列分型(MLST)和脈沖場凝膠電泳(PFGE)方法是常見的豬鏈球菌分子分型方法，分型顯示2021年患者2分離菌株和3株豬源菌株均為ST7型，此4株豬鏈球菌PFGE聚類分析顯示同源性為100%，提示同一養(yǎng)殖場所的豬存在相互傳染的情況，同時(shí)是患者2感染豬鏈球菌的來源。而2020年和2022年臨床病例菌株為ST1型，與目前報(bào)道主要致病型豬鏈球菌ST1和ST7型一致[14-15]。2022年屠宰車間中的分離株ST型未定型，為1株不攜帶毒力基因的無致病性豬鏈球菌。2株ST1型豬鏈球菌毒力基因分布mrp-、ef+、sly+，4株ST7型毒力基因分布mrp+、ef+、sly+，攜帶毒力基因不完全相同，患者分離株3種PFGE帶型分析顯示同源性較低，此3例病例無流行病學(xué)關(guān)聯(lián)。

本研究通過流調(diào)、菌株分離鑒定、毒力基因檢測、PFGE和MLST等方法溯源分析，表明宰殺和處理生豬是人感染豬鏈球菌的高危因素，手部皮膚破損或處理時(shí)被刺傷是造成感染主要因素。此外值得關(guān)注的是2021年分離到的3株豬源性豬鏈球菌其來源均為生態(tài)黑豬，2022年患者描述也是處理了生態(tài)黑豬肉。今后在健康教育方面重點(diǎn)要對屠場工人、洗切加工處理病/死豬肉的從業(yè)人員，加強(qiáng)健康知識的宣傳，重點(diǎn)人群一旦出現(xiàn)畏寒、發(fā)熱等應(yīng)該及時(shí)到大型綜合性醫(yī)院接受檢查和治療，以免延誤診斷和治療。

利益沖突：無

引用本文格式：吳畏畏，童晶，杜陽光，等. 徐州市7株豬鏈球菌病原學(xué)分析及分子分型研究[J]. 中國人獸共患病學(xué)報(bào)，2022，38(11)：996-1000. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.153