生駝乳中金黃色葡萄球菌的熒光PCR檢測

文│韓涌（新疆維吾爾自治區(qū)烏魯木齊市動物疾病控制與診斷中心）

蔡擴(kuò)軍（新疆維吾爾自治區(qū)烏魯木齊市動物疾病控制與診斷中心、新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院）

徐敏（新疆維吾爾自治區(qū)烏魯木齊市動物疾病控制與診斷中心、烏魯木齊市奶業(yè)協(xié)會）

駝乳具有較高的營養(yǎng)價值和醫(yī)學(xué)保健功能，近年來，駝乳需求量呈現(xiàn)“爆發(fā)式”增長，供不應(yīng)求，價格一路攀升。與此同時，駝乳質(zhì)量安全受到廣大消費(fèi)者的關(guān)注。金黃色葡萄球菌是一種常見的食源性致病微生物，可造成嚴(yán)重的食物中毒，嚴(yán)重危害消費(fèi)者的身體健康。生鮮牛乳中金黃色葡萄球菌污染報(bào)道較多，但駝乳中有關(guān)金黃色葡萄球菌的報(bào)道較少。為了解生鮮駝乳中金黃色葡萄球菌的污染狀況，本研究使用熒光PCR方法快速檢測生駝乳中的金黃色葡萄球菌，為預(yù)防和控制生駝乳中金黃色葡萄球菌引起的突發(fā)公共衛(wèi)生事件提供技術(shù)支持。

一、材料與方法

1.主要試劑。7.5%氯化鈉肉湯購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；金黃色葡萄球菌熒光PCR檢測試劑盒購自深圳澳東檢驗(yàn)檢測科技有限公司。

2.主要儀器。熒光PCR（7500）儀器購自美國ABI；細(xì)菌培養(yǎng)箱，生物安全柜。

3.金黃色葡萄球菌的分離、檢測。

（1）樣品采集。采集生鮮駝奶90份，樣品放入含有冰袋的運(yùn)輸箱內(nèi)，低溫運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室。

（2）檢驗(yàn)程序。

（3）操作步驟。增菌：按國家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 4789.10-2016）對生鮮駝乳進(jìn)行前處理與增菌培養(yǎng)。無菌條件取25毫升駝奶樣品放入三角瓶，再加入225毫升7.5%氯化鈉肉湯，36±1℃培養(yǎng)18～24小時。

提取細(xì)菌基因組DNA：取增菌液1毫升加入EP管，10000轉(zhuǎn)/分鐘條件離心1分鐘，棄上清，根據(jù)細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取增菌液中細(xì)菌基因組DNA。

反應(yīng)組份配制：按照金黃色葡萄球菌熒光PCR檢測試劑盒的說明書將樣品DNA、核酸擴(kuò)增反應(yīng)液、金黃色葡萄球菌反應(yīng)液、S-Taq酶加至反應(yīng)管，反應(yīng)總體積為25微升，同時設(shè)置陰性和陽性對照。

PCR擴(kuò)增：將配置好反應(yīng)液的反應(yīng)管置于熒光PCR儀器中，擴(kuò)增程序?yàn)轭A(yù)變性95℃ 3分鐘、變性95℃ 5秒、退火/延伸60℃ 40秒，40個循環(huán)。

（4）結(jié)果描述及判定。陰性：無Ct值且無擴(kuò)增曲線，表示樣本陰性或被檢測樣本核酸濃度含量低于1×102副本/毫升。

陽性：Ct值≤30，且出現(xiàn)明顯的指數(shù)增長期，表示樣本陽性。

可疑：檢測樣本30＜Ct＜35時，重復(fù)一次。如果Ct值仍小于35，且曲線有明顯的指數(shù)增長期，可報(bào)告樣本陽性，否則報(bào)告樣本陰性或者被檢測樣本核酸濃度含量低于1×102副本/毫升。

對照：陰陽性對照必須成立，否則此次實(shí)驗(yàn)視為無效。

二、結(jié)果

該試驗(yàn)陰陽性對照成立，本批次一共檢測樣品90份，其中11份陽性，陽性率11.1%。

三、討論

金黃色葡萄球菌的檢測方法包括傳統(tǒng)的分離生化鑒定、免疫學(xué)檢測、分子生物學(xué)檢測方法等，本研究采用PCR方法結(jié)合熒光探針的擴(kuò)增檢測技術(shù)，操作簡單，有效防止污染，能對樣品中的金黃色葡萄球菌進(jìn)行快速檢測。由于直接從奶中提取細(xì)菌基因組DNA技術(shù)不成熟，提取出來的基因組DNA質(zhì)量不高，常常影響后續(xù)的PCR擴(kuò)增結(jié)果，因此在本研究中，首先對駝乳中的金黃色葡萄球菌進(jìn)行增菌，再提取菌液中細(xì)菌基因組DNA，保證細(xì)菌DNA模板的質(zhì)量，同時避免駝乳中金黃色葡萄球菌含量極低而出現(xiàn)假陰性。

本研究結(jié)果顯示，生駝乳中金黃色葡萄球菌的污染率為11.1%，低于我國生牛乳中金黃色葡萄球菌的污染率，這可能與駱駝乳房炎患病率低于奶牛乳房炎有關(guān)。值得注意的是，本地人喜愛直接飲用發(fā)酵后的駝奶，而不像牛奶一樣煮沸后飲用，因此，加強(qiáng)對駝乳中金黃色葡萄球菌的監(jiān)測及快速檢測具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。