超聲波輔助酶法提取香蕉皮多酚*

黃敏 張帥* 林詩堃 張?zhí)鞓?朱麗萍

（肇慶學院食品與制藥工程學院，廣東肇慶 526000）

香蕉皮是香蕉加工產(chǎn)業(yè)中的主要副產(chǎn)物，約占香蕉總質量的30%。目前，香蕉皮除少數(shù)被用于動物飼料生產(chǎn)外，大多被廢棄。香蕉皮中除含有大量果膠、低聚糖、纖維素、半纖維素、木質素等膳食纖維外，還富含多酚物質。多酚是廣泛存在于植物體內的多元酚類化合物，具有抗癌、抗菌、抗氧化和預防心腦血管疾病等多種生理活性。隨著香蕉深加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，對香蕉皮開展綜合利用研究，不僅能減輕環(huán)境污染，還可以創(chuàng)造經(jīng)濟效益，帶動產(chǎn)業(yè)鏈發(fā)展。

利用超聲波產(chǎn)生的機械效應和空化效應能有效破壞植物細胞壁、加速胞內成分溶出，而且超聲波可使介質溫度瞬間升高，避免有效成分被破壞。目前將超聲波和纖維素酶聯(lián)合用于黃酮提取的研究較多，而用于香蕉皮多酚的提取研究則未見報道。本研究先采用超聲波輔助纖維素酶法提取香蕉皮多酚，然后設計均勻試驗優(yōu)化提取工藝，并對香蕉皮多酚的抑菌作用進行了測定。本研究可為進一步挖掘香蕉皮利用價值以及開發(fā)香蕉皮多酚類產(chǎn)品提供技術依據(jù)和數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 原料試劑

香蕉，購于本地超市，新鮮無腐爛，取皮備用；纖維素酶，食品級，酶活力3 萬IU/g，北京鴻潤寶順科技有限公司；沒食子酸、福林酚試劑、乙醇、碳酸鈉、檸檬酸、磷酸氫二鈉等藥品試劑，均為國產(chǎn)分析純。

大腸桿菌（E.Coli）、金黃色葡萄球菌（S.a）、枯草芽孢桿菌（B.s），本院食品微生物實驗室4 °C保存。

檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液：檸檬酸4.80 g，溶解后定容至250 mL（A 液，0.1 mol/L）；磷酸氫二鈉7.10 g，溶解后定容至250 mL（B液，0.1 mol/L）。

纖維素酶緩沖液：吸取25 mL 0.1 mol/L檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶于50 mL 容量瓶，用蒸餾水將1.000 g纖維素酶溶解后移至50 mL容量瓶，定容。

1.2 儀器設備

UV/VIS 916 紫外可見分光光度計，GBC 科學儀器公司；PHS-3C 精密酸度計，上海大譜儀器有限公司；YXJ-2高速離心機、HH-6恒溫水浴鍋，金壇市環(huán)宇科學儀器廠；RE-2000 旋轉蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；S-450D超聲波細胞破碎儀（350 W，20 kHz），必能信超聲有限公司；TDZ5-WS離心機，湖南省湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 香蕉皮多酚提取

香蕉皮切片，沸水熱燙5 min 以鈍化多酚氧化酶活性。冷卻后移至打漿機破碎，均質勻漿1 min后移至100 mL 燒杯中，加入乙醇，調pH 值，加入纖維素酶于水浴鍋中浸提多酚，將其置于超聲波細胞破碎儀中繼續(xù)提取多酚，提取溫度45 °C，提取液4 500 r/min 離心15 min，上清液即為香蕉皮多酚溶液。

1.3.2 香蕉皮多酚含量測定

采用福林酚法測定香蕉皮多酚含量。吸取3 mL香蕉皮多酚提取液，加入3 mL 福林酚試劑，混勻，3 min 內加入3 mL10%碳酸鈉溶液，充分混勻，40 ℃水浴鍋中避光放置1 h，在波長760 nm 處測吸光度。以試劑溶液作空白對照，分別將測得的吸光度值代入標準曲線方程得到樣品液中多酚質量濃度，按下列公式計算香蕉皮（樣品液）多酚得率（以干質量計）：M=C×（V×k）/m×103。式中：M為多酚得率，mg/g；C為提取液中多酚質量濃度（以沒食子酸計），mg/mL；V為提取液體積，mL；m為香蕉皮質量，g；k為樣液稀釋倍數(shù)。

1.3.3 標準曲線建立

參考楊賢松等的方法，稱取50 mg 沒食子酸標準品，置于500 mL 容量瓶中溶解，振搖混勻后定容，即為0.1 mg/mL 沒食子酸標準液；稱取20 g 碳酸鈉，加適量去離子水溶解，定容至200 mL，配制成10%碳酸鈉溶液。分別吸取沒食子酸標準溶液0.0 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL、7.0 mL于100 mL容量瓶中，加入3 mL福林酚試劑，搖勻；放置3 min 后加入3 mL 10%碳酸鈉溶液，搖勻；于40 °C 恒溫槽中遮光反應1 h 后定容，各溶液沒食子酸含量分別為0.0 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L、3.0 mg/L、4.0 mg/L、5.0 mg/L、6.0 mg/L、7.0 mg/L，于波長760 nm 處測吸光度，吸光度與沒食子酸質量濃度之間的線性方程為：Y=0.114 3X+0.038 2，R2=0.991 9，該方程在1.0 mg/L～7.0 mg/L范圍內呈良好線性關系。

1.4 試驗設計

1.4.1 單因素試驗

在超聲時間20 min 條件下，分別考察乙醇體積分數(shù)、纖維素酶添加量、酶解時間、酶解pH 值、酶解時間5 個因素對多酚得率的影響，根據(jù)結果確定適宜的提取條件。

1.4.1.1 乙醇體積分數(shù)

配制不同乙醇體積分數(shù)（20%、30%、40%、50%、60%、70%）的香蕉皮勻漿液，將pH 值調至5，纖維素酶添加量0.02%，酶解溫度45 °C，酶解時間1 h，考察乙醇體積分數(shù)對香蕉皮多酚得率的影響。

1.4.1.2 pH值

配制乙醇體積分數(shù)60%的香蕉皮勻漿液，分別調為不同pH 值（3、4、5、6、7、8），纖維素酶添加量0.02%，酶解溫度45 °C，酶解時間1 h，考察pH值對香蕉皮多酚得率的影響。

1.4.1.3 酶添加量

配制乙醇體積分數(shù)60%的香蕉皮勻漿液，調pH 值為3，分別設定不同纖維素酶添加量（0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.06%、0.07%），酶解溫度45 °C，酶解時間1 h，考察酶添加量對香蕉皮多酚得率的影響。

1.4.1.4 酶解溫度

配制乙醇體積分數(shù)60%的香蕉皮勻漿液，調pH 值為3，纖維素酶添加量0.02%，分別設定不同酶解溫度（30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃），酶解時間1 h，考察酶解溫度對香蕉皮多酚得率的影響。

1.4.1.5 酶解時間

配制乙醇體積分數(shù)60%的香蕉皮勻漿液，調pH 值為3，纖維素酶添加量0.02%，酶解溫度60 °C，分別設定不同酶解時間（60 min、80 min、100 min、120 min、140 min、160 min），考察酶解時間對香蕉皮多酚得率的影響。

1.4.2 均勻試驗

以香蕉皮多酚得率為評價指標，設計均勻試驗優(yōu)化多酚提取工藝。根據(jù)單因素試驗結果，用DPS 7.5軟件設計5因素6水平U6（65）均勻試驗。

1.4.3 香蕉皮多酚提取物抑菌性測定

先將E.Coli、S.a和B.s接種于牛肉膏瓊脂培養(yǎng)基斜面上培養(yǎng)。采用濾紙片擴散法，將營養(yǎng)瓊脂固體培養(yǎng)基溶化后傾入培養(yǎng)皿（20 mL/皿），待冷卻凝固后加入0.2 mL 供試菌懸液，然后用無菌刮棒涂勻，吸取1 mL 香蕉皮多酚提取液于濾紙片（d=6 mm）上，并使其完全均勻分散，貼到涂抹適宜濃度菌懸液的培養(yǎng)基平板上，每皿2 片并以無菌水作對照，重復3 次。最后將供試菌株在37 ℃培養(yǎng)24 h后按十字交叉法測定清晰抑菌圈直徑。

1.5 數(shù)據(jù)處理

每組試驗做3次平行，用Excel 2010、Origin 8.0和DPS 7.5軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 乙醇體積分數(shù)對香蕉皮多酚得率的影響

由圖1 可知，香蕉皮多酚得率隨乙醇體積分數(shù)增加而逐漸增大。當乙醇體積分數(shù)60%時，多酚得率最大；當乙醇體積分數(shù)大于60%時，多酚得率反而呈逐漸下降趨勢。這主要是因為高濃度提取劑會引起細胞蛋白質變性，間接影響多酚溶出，最終導致得率降低。

圖1 乙醇體積分數(shù)對多酚得率的影響

2.1.2 pH值對香蕉皮多酚得率的影響

由圖2 可知，pH 值改變會影響酶活性從而影響多酚得率。當pH 值為3.0 時，多酚得率達到最大值1.924 mg/g。當pH值超過3.0時，得率反而下降，這可能與酶的最適酶解pH 值有關，當酶解pH 值偏離最適pH 值時不利于酶的催化作用，酶活性下降會減弱對細胞壁的破壞效果，不利于多酚的提取。

圖2 pH值對多酚得率的影響

2.1.3 酶添加量對香蕉皮多酚得率的影響

由圖3 可知，在0.01%～0.02%添加范圍內，隨著纖維素酶添加量的增加，多酚得率明顯提高。當酶添加量為0.02% 時，多酚得率達到最大值2.201%。此后繼續(xù)提高酶添加量，多酚得率反而降低。原因是當?shù)孜餄舛纫欢〞r，增大酶量可以提高反應速度，從而提高得率；當酶濃度達到足以使反應迅速完成時，即為酶最大添加量，此時反應達到動態(tài)平衡；但當酶添加過多時，則會打破動態(tài)平衡而抑制反應使得率下降。

圖3 酶添加對多酚得率的影響

2.1.4 酶解溫度對香蕉皮多酚得率的影響

由圖4 可知，隨著酶解溫度升高，香蕉皮多酚得率先升后降。當酶解溫度為60 ℃時，多酚得率達到最大值1.9%。繼續(xù)升溫，會導致纖維素酶變性失活，酶解度下降多酚得率減小。

圖4 酶解溫度對多酚得率的影響

2.1.5 酶解時間對香蕉皮多酚得率的影響

由圖5 可知，隨著酶解時間的增加，香蕉皮多酚得率逐漸增加，當酶解時間為120 min 時，多酚得率最高為1.923%。超過120 min 后，多酚得率呈下降趨勢，原因可能是時間過長導致纖維素酶活性降低或底物量不足導致反應終止。

圖5 酶解時間對多酚得率的影響

2.2 均勻試驗結果

均勻試驗設計和結果如下頁表1 所示。用DPS 7.5 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對試驗結果進行二次多項式逐步回歸，建立回歸方程，并對模型作顯著性檢驗分析，結果見表2。

表1 均勻設計和結果

表2 二次多項式逐步回歸分析結果

由DPS 7.5 軟件分析得回歸方程：Y=6.454 7-10.743 48X1+7.451 17X1X1-0.005 617 0X1X4+0.256 836X2X3。由表2可知，回歸模型極顯著（P=0.006 3<0.01），回歸方程的決定系數(shù)R2=0.999 98，說明該方程可以解釋99.998%的得率數(shù)據(jù)變異，方程擬合度非常好，可用于對試驗結果的分析預測。由表2中的t檢驗值和P值分析可知，在試驗范圍內，各因素對得率影響最大的為乙醇體積分數(shù)（X1），達到極顯著水平，其他單因素均不顯著。各因素的交互項顯著性表現(xiàn)為：X1X1、X1X4、X2X3的P值均達極顯著水平。由各變量顯著性P值可知對提取率影響的大小順序為X1X4>X1>X1X1>X2X3。

方程求極值可得最優(yōu)工藝參數(shù)，即最佳工藝條件為：乙醇體積分數(shù)45.0%，纖維素酶添加量0.06%，酶解pH值2.51，酶解時間108.42 min，酶解溫度69.28 ℃，多酚得率最大預測值為2.893 7 mg/g?？紤]到實際操作的方便性，將酶解pH 值、酶解時間及酶解溫度3 個變量的工藝參數(shù)修飾為：2.5、108 min、70 ℃，在此工藝條件下重復試驗3次，多酚得率平均為2.989 mg/g，相對誤差為0.89%。

2.3 香蕉皮多酚提取物的抑菌性試驗結果

如表3 所示，香蕉皮多酚提取物對3 種病原菌均表現(xiàn)出抑制作用，其中對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑制效果較強，對大腸桿菌的抑菌作用較弱。由此推斷，香蕉皮多酚提取物可能對革蘭氏陽性菌有較強的抑制作用。

表3 香蕉皮提取物對不同菌種的抑菌效果

3 結論

本研究采用超聲波輔助纖維素酶法提取香蕉皮多酚，通過單因素試驗和均勻試驗優(yōu)化了提取工藝。最優(yōu)工藝條件為：乙醇體積分數(shù)45%，纖維素酶添加量0.06%，酶解pH 值2.5，酶解時間108 min，酶解溫度70 ℃。在最優(yōu)條件下提取香蕉皮多酚，多酚得率為2.989 mg/g。羅蘭等采用螯合劑輔助提取香蕉皮多酚得率為1.614%，楊賢松等采用乙醇提取，利用正交試驗優(yōu)化香蕉皮多酚提取工藝，多酚得率為1.46%，吳德智等采用乙醇提取，利用Box-Behnken 響應曲面設計優(yōu)化提取工藝，多酚得率為1.97%，可見，與單一提取方法相比，超聲波輔助酶法提取可顯著提高多酚得率。對香蕉皮多酚提取物進行了抑菌性測定，結果表明香蕉皮多酚提取物對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑菌效果較好。下一步將開展香蕉皮多酚單體成分結構和活性方面的研究。