共載阿霉素與小干擾RNA的脂質(zhì)介孔硅納米粒的制備表征及抗多藥耐藥腫瘤細(xì)胞研究 Δ

張夢瑋 ，楊碩曄 ，楊亞南 ，王振威 ，屈凌波 （1.河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，鄭州 450001；.鄭州市生物醫(yī)藥功能分子重點實驗室，鄭州 450001；.鄭州大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，鄭州 450001）

對于乳腺癌等惡性腫瘤，以阿霉素（doxorubicin，DOX）為代表的化學(xué)藥治療仍是目前臨床上常用的治療手段，但隨著藥物的反復(fù)使用，多藥耐藥（multiple drug resistance，MDR）已成為化療失敗的一個重要誘因。MDR1基因過表達(dá)是引發(fā) MDR 的主要原因，其編碼的P-糖蛋白（P-glycolprotein，P-gp）介導(dǎo)的藥物外排是經(jīng)典的耐藥機(jī)制[1―2]。納米載體可通過高滲透長滯留效應(yīng)積聚于腫瘤部位，且具有功能化程度高、生物相容性好等優(yōu)點[3]。根據(jù)腫瘤微環(huán)境特性開發(fā)出的刺激響應(yīng)型納米載藥系統(tǒng)，當(dāng)其受到如微酸性、高水平谷胱甘肽（gluta‐thione，GSH）等微環(huán)境刺激時會迅速進(jìn)入活化狀態(tài)，載體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，可在抑制MDR型腫瘤P-gp表達(dá)的同時，實現(xiàn)化療藥物的持續(xù)控釋，從而協(xié)同增強(qiáng)對MDR型腫瘤的治療效果[4—5]。

腫瘤細(xì)胞內(nèi)通常呈現(xiàn)微酸性，且GSH水平為正常組織細(xì)胞的3倍以上[6]，故可利用還原性差異設(shè)計出對高水平GSH敏感的還原響應(yīng)型納米載體。氧化還原反應(yīng)會促進(jìn)納米載體的降解，有效降低材料對細(xì)胞的毒性，常見的還原敏感鍵主要有二硫鍵（－SS－）、二硒鍵等，其中－SS－和GSH會發(fā)生氧化還原反應(yīng)，從而導(dǎo)致自身被還原為巰基，使載體降解而釋放化療藥物，進(jìn)而實現(xiàn)在腫瘤組織部位的靶向控釋[7―8]。基于此，本文以介孔硅納米粒（mesoporous silica nanoparticles，MSNs）為基礎(chǔ)制備MSNs-SS-NH2@DOX，并以陽離子脂質(zhì)體（cationic liposomes，CLs）對其包覆制得 CLMSNs-SSNH2@DOX，進(jìn)一步負(fù)載小干擾RNA（siRNA，可下調(diào)耐藥細(xì)胞中P-gp的表達(dá)，有效逆轉(zhuǎn)腫瘤MDR，提高抗腫瘤效果[9]）得到CLMSNs-SS-NH2@DOX/siRNA復(fù)合載藥系統(tǒng)；再以耐DOX型乳腺癌細(xì)胞MCF-7/ADR為研究對象，考察該制劑抗MDR型腫瘤細(xì)胞的作用，以期為其開發(fā)及后續(xù)臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有JEM-2100F型透射電子顯微鏡（日本Hitachi公司），Nano ZS90s型納米粒度儀（英國Malvern公司），ASAP 2460型物理吸附儀（美國麥克公司），Nicolet IS10型傅里葉紅外光譜儀、Attune NxT型流式細(xì)胞儀（美國Thermo Fisher Scientific公司），2695型高效液相色譜儀（美國Waters公司），Axio observer3型熒光顯微鏡（德國Zeiss公司），DSC214型差示掃描量熱儀（德國耐馳公司），D8型X射線衍射儀（德國布魯克公司）。

1.2 主要藥品與試劑

DOX原料藥 （批號N1111A，含量＞98%）、DOX對照品 （批號 N1111AS，含量＞99%）購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；十六烷基三甲基溴化銨、3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）、乙二酸酐、二乙醇胺、硅酸四乙酯、異硫氰酸熒光素（FITC）均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；二油?；装繁榧谆蛩猁}（DOTAP）、二硬脂酰基磷脂酰膽堿（DSPC）、二棕櫚酰磷脂酰甘油（DPPG）均購自美國Avanti公司；Annexin Ⅴ-FITC 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、細(xì)胞周期檢測試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)公司；兔源P-gp一抗購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白G二抗購自美國LI-COR公司；siRNA由寧波康貝生化有限公司合成。

1.3 細(xì)胞

耐DOX型乳腺癌MCF-7/ADR細(xì)胞由河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院細(xì)胞功能調(diào)控創(chuàng)新實驗室提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 CLMSNs-SS-NH2@DOX/siRNA的制備

采用模板劑法[10]制備MSNs。取100 mg MSNs置于10 mL無水乙醇中，超聲（功率50 W，頻率40 kHz，下同）20 min后加入2 mL APTES，并于60 ℃反應(yīng)20 h，離心收集沉淀，真空干燥即得MSNs-NH2。向100 mg MSNs-NH2中加入10 mL丙酮，30 min后逐滴加入5 mL含有1.5 mol/L乙二酸酐的丙酮溶液，室溫下攪拌24 h，所得沉淀即為MSNs-COOH。向100 mg MSNs-COOH中加入20 mL磷酸鹽緩沖液（pH5.0）、75 mg 1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亞胺鹽酸鹽、75 mg N-羥基琥珀酰亞胺，攪拌活化2 h后，向其中加入1 g半胱氨酸鹽酸鹽，在氮氣保護(hù)條件下于35 ℃攪拌24 h，離心收集沉淀即得MSNs-SS-NH2。取MSNs-SS-NH2與DOX適量（兩者質(zhì)量比為2∶1），攪拌24 h后即得MSNs-SS-NH2@DOX。

取100 mg DOTAP、50 mg膽固醇、30 mg DPPG、30 mg DSPC、8 mL氯仿，超聲溶解后緩慢旋蒸成膜，即得CLs。取CLs與DOX適量（兩者質(zhì)量比為2∶1）超聲融合5 min，即得CLs@DOX。將CLs分別與上述所得MSNs-SS-NH2、MSNs-SS-NH2@DOX溶液混合并超聲后，即得CLMSNs-SS-NH2、CLMSNs-SS-NH2@DOX。將干粉狀siRNA離心10 min后溶于375 μL DEPC水中，然后與CLMSNs-SS-NH2@DOX渦旋混勻，即得CLMSNs-SSNH2@DOX/siRNA（現(xiàn)用現(xiàn)配），并以50 nmol為siRNA的最佳負(fù)載量。

2.2 CLMSNs-SS-NH2@DOX/siRNA的表征

2.2.1 粒徑及Zeta電位分析 將適量MSNs-SSNH2@DOX、CLs@DOX、CLMSNs-SS-NH2@DOX 和CLMSNs-SS-NH2@DOX/siRNA分散于去離子水中超聲均勻，測定其粒徑和Zeta電位。結(jié)果顯示，MSNs-SSNH2@DOX的粒徑為（153.73±15.6） nm，Zeta電位為（35.13±0.73） mV，多分散性指數(shù)（polydispersity index，PDI）良好。因CLs@DOX表面存在大量正電荷且粒徑[（168.77±3.84） nm]較MSNs-SS-NH2@DOX有所增大，故經(jīng)CLs包埋后CLMSNs-SS-NH2@DOX的粒徑[（160.03±7.13） nm]增大且Zeta電位增大至（104.83±1.86） mV，這說明CLs可有效包覆于MSNs-SS-NH2表面。進(jìn)一步負(fù)載siRNA后，CLMSNs-SS-NH2@DOX/siRNA的粒徑[（197.63±3.75） nm]增大，且由于核酸呈負(fù)電性，故使其Zeta電位略有降低，這提示CLMSNs-SSNH2@DOX/siRNA可與靜息狀態(tài)下呈負(fù)電性的細(xì)胞相互吸引，以提高細(xì)胞攝取效率。

2.2.2 微觀形態(tài)分析 分別取MSNs-SS-NH2@DOX、CLs@DOX、CLMSNs-SS-NH2@DOX和CLMSNs-SS-NH2@DOX/siRNA適量分散于95%乙醇中，然后分別滴于銅網(wǎng)上，經(jīng)充分干燥后，采用透射電子顯微鏡進(jìn)行觀察。結(jié)果顯示，MSNs-SS-NH2@DOX的介孔結(jié)構(gòu)清晰，粒徑均一，分散性較好；其經(jīng)CLs包覆后，所得CLMSNs-SSNH2@DOX表面出現(xiàn)一層透明脂膜；進(jìn)一步負(fù)載siRNA后，CLMSNs-SS-NH2@DOX/siRNA結(jié)構(gòu)清晰，表面脂膜層明顯，這說明該納米載體構(gòu)建成功。結(jié)果見圖1。

圖1 不同修飾型納米載體的透射電子顯微圖

2.2.3 差示掃描量熱分析 分別取MSNs-SS-NH2@DOX、CLs@DOX、CLMSNs-SS-NH2@DOX/siRNA適量置于差示掃描量熱儀中，設(shè)置升溫速率為7 ℃/min，在N2保護(hù)條件下檢測各樣品在－50～300 ℃范圍內(nèi)的吸放熱峰形。結(jié)果顯示，MSNs-SS-NH2@DOX在60 ℃處有一明顯吸熱峰，表明其在該溫度下可由不定形狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榻Y(jié)晶態(tài)。CLs@DOX在90 ℃處有一明顯吸熱峰，表明其可由固態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槟z態(tài)。MSNs-SS-NH2@DOX經(jīng)CLs包埋后相變溫度約為75 ℃，相較于原始相變溫度有所提高，表明以CLs包埋可提高M(jìn)SNs-SS-NH2@DOX/siRNA的熱穩(wěn)定性。結(jié)果見圖2A。

2.2.4 X射線衍射分析 分別取MSNs-SS-NH2@DOX、CLs@DOX、CLMSNs-SS-NH2@DOX/siRNA的干燥粉末適量，置于X射線衍射光譜儀中檢測。結(jié)果顯示，MSNs-SS-NH2@DOX在22°處有一個特征吸收峰，CLs@DOX在32°處有一個特征吸收峰，CLMSNs-SSNH2@DOX/siRNA在22°和32°處均有特征吸收峰，這表明CLMSNs-SS-NH2@DOX/siRNA已成功構(gòu)建。結(jié)果見圖2B。

圖2 不同修飾型納米載體的差示掃描量熱圖、X射線衍射圖、傅里葉紅外光譜圖及物理吸附-脫附曲線

2.2.5 紅外光譜分析 分別取MSNs-SS-NH2@DOX、CLs@DOX、CLMSNs-SS-NH2@DOX/siRNA的干燥粉末適量與溴化鉀粉末混合，充分研磨均勻后，置于傅里葉紅外光譜儀上檢測。結(jié)果顯示，MSNs-SS-NH2@DOX在1 680 cm－1處出現(xiàn)－SS－特征吸收峰，這表明－SS－成功連接至MSNs表面。CLs在2 930 、2 850 cm－1處均出現(xiàn)長鏈脂肪酸C－H伸縮振動峰。經(jīng)CLs包埋后，CLMSNs-SS-NH2@DOX/siRNA在1 240 cm－1處的P＝O伸縮振動峰變寬，且位于3 500 cm－1處的硅醇基團(tuán)的伸縮峰有所減弱，這表明CLs可包覆于MSNs-SSNH2@DOX表面。結(jié)果見圖2C。

2.2.6 物理吸附分析 分別取MSNs-SS-NH2、CLMSNs-SS-NH2的干燥粉末適量，于氮氣環(huán)境中置于物理吸附儀上進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，MSNs-SS-NH2的物理吸附-脫附曲線下面積最大。經(jīng)CLs包覆后，CLMSNs-SS-NH2的物理吸附-脫附曲線下面積減小，這表明CLs已成功包裹于MSNs-SS-NH2表面。結(jié)果見圖2D。

2.3 CLMSNs-SS-NH2@DOX/siRNA的體外釋放度測定

采用高效液相色譜法[11]測定CLMSNs-SS-NH2@DOX/siRNA在不同pH條件下（pH5.0、pH7.4）及不同GSH濃度下（0、2、5、10 mmol/L）DOX的體外釋放度。結(jié)果顯示，在同一pH條件下，CLMSNs-SS-NH2@DOX/siRNA中DOX的釋放度與GSH的濃度成正比，且在pH5.0條件下DOX的釋放度均高于pH7.4條件下，這表明CLMSNs-SS-NH2@DOX/siRNA具有良好的pH/還原雙重響應(yīng)釋藥特性。結(jié)果見圖3。

圖3 不同pH條件下CLMSNs-SS-NH2@DOX中DOX的體外釋放度

2.4 CLMSNs-SS-NH2@DOX/siRNA的細(xì)胞實驗考察

2.4.1 細(xì)胞攝取的考察 將對數(shù)生長期的MCF-7/ADR細(xì)胞以1×104個/孔接種于12孔板中，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，然后分為DOX組、MSNs-SS-NH2@DOX組、CLs@DOX組、CLMSNs-SSNH2@DOX組和CLMSNs-SS-NH2@DOX/siRNA組，各組DOX的含量均為5 μg/mL（濃度根據(jù)前期預(yù)實驗結(jié)果設(shè)置）。每組設(shè)3個復(fù)孔。各組加入相應(yīng)含藥培養(yǎng)基避光孵育12 h，以10 μg/mL Hochest33342染色30 min，再以磷酸鹽緩沖液洗滌2～3次后，于倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的攝取情況，并采用Image J 1.48v軟件對DOX的熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量分析。采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)均以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準(zhǔn)α＝0.05。結(jié)果顯示，與DOX組（熒光強(qiáng)度為0）比較，其余各組細(xì)胞熒光強(qiáng)度（分別為27.7±1.7、31.2±1.8、159.7±10.3、193.7±7.6）均顯著增強(qiáng)（P＜0.05），且 CLMSNs-SS-NH2@DOX/siRNA組細(xì)胞熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，這提示CLMSNs-SS-NH2@DOX/siRNA的介導(dǎo)入胞能力最強(qiáng)。結(jié)果見圖4。

圖4 各組MCF-7/ADR細(xì)胞攝取情況的熒光顯微圖

2.4.2 細(xì)胞遷移的考察 將MCF-7/ADR細(xì)胞以5×103個/孔接種于24孔板中，分為對照組、DOX組、MSNs-SSNH2@DOX組、CLs@DOX組、CLMSNs- SS-NH2@DOX組、CLMSNs-SS-NH2@DOX/siRNA組，各組DOX的含量均為5 μg/mL。每組設(shè)3個復(fù)孔。各組加入相應(yīng)含藥培養(yǎng)基后，用200 μL移液管尖劃過各孔孔底形成垂直傷口，采用顯微鏡觀察培養(yǎng)0 h和 24 h時的細(xì)胞遷移情況。結(jié)果顯示，培養(yǎng)24 h后，對照組劃痕明顯變窄，MCF-7/ADR細(xì)胞的遷移率為（35.0±0.56）%，表明MCF-7/ADR細(xì)胞具有較強(qiáng)的遷移能力，其余各組MCF-7/ADR細(xì)胞的遷移率[分別為（20.0±0.45）%、（21.30±0.72）%、（18.00±0.23）%、（15.80±0.42）%、（8.00±0.34）%]較對照組均顯著降低（P＜0.05），且CLMSNs-SS-NH2@DOX/siRNA組細(xì)胞遷移率最低，表明CLMSNs-SS-NH2@DOX/siRNA可顯著抑制MCF-7/ADR細(xì)胞遷移。結(jié)果見圖5。

2.4.3 細(xì)胞凋亡的考察 將MCF-7/ADR細(xì)胞以2×104個/孔接種于6孔板，按“2.4.2”項下方法分組與給藥，每組設(shè)3個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞沉淀，加入500 μL 結(jié)合液重懸均勻，分別加入 5 μL Annexin Ⅴ-FITC和碘化丙啶（PI）染色液，室溫孵育10 min后，采用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果顯示，培養(yǎng)24 h后，對照組MCF-7/ADR細(xì)胞的總凋亡比例為（10.19±0.56）%，其余各組MCF-7/ADR細(xì)胞的總凋亡比例[分別為（18.84±0.25）%、（18.84±0.45）%、（24.86±0.75）%、（30.55±1.08）%、（40.90±0.78）%]較對照組均顯著升高（P＜0.05），且CLMSNs-SS-NH2@DOX/siRNA組細(xì)胞總凋亡比例最高，表明CLMSNs-SS-NH2@DOX/siRNA可促進(jìn)MCF-7/ADR細(xì)胞凋亡。結(jié)果見圖6。

圖6 各組MCF-7/ADR細(xì)胞的凋亡流式細(xì)胞圖

2.4.4 細(xì)胞周期的考察 將MCF-7/ADR細(xì)胞以2×104個/孔接種于6孔板中，按“2.4.2”項下方法分組與給藥，每組設(shè)3個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞沉淀，以磷酸鹽緩沖液洗滌1～2次后，于4 ℃條件下以1 mL 75%乙醇固定過夜；離心棄上清液，以磷酸鹽緩沖液洗滌2次，加入500 μL PI染色液，于37 ℃避光培養(yǎng)30 min后，采用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞周期。結(jié)果顯示，培養(yǎng)24 h后，對照組MCF-7/ADR細(xì)胞G0/G1期所占比例為（21.00±0.65）%，其余各組MCF-7/ADR細(xì)胞G0/G1期所占 比 例[分別 為（35.40±1.12）%、（37.85±0.95）%、（42.33±1.37）%、（45.50±0.57）%、（63.90±2.37）%]較對 照 組 均 顯 著 升 高（P＜0.05），且 CLMSNs-SSNH2@DOX/siRNA組細(xì)胞G0/G1期所占比例最高，表明CLMSNs-SS-NH2@DOX/siRNA可將MCF-7/ADR細(xì)胞的生長周期明顯阻滯于G0/G1期，以增強(qiáng)逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞MDR的效果。

2.4.5 細(xì)胞中P-gp表達(dá)的考察 將MCF-7/ADR細(xì)胞以2×104個/孔接種于6孔板中，按“2.4.2”項下方法分組與給藥，每組設(shè)3個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞沉淀，置于冰上裂解15 min，提取總蛋白。蛋白經(jīng)變性后，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，室溫封閉，加入P-gp抗體（稀釋度為1∶1 000），4 ℃孵育18 h；常溫閉光孵育二抗（稀釋度為1∶15 000）1 h，洗膜；采用雙色紅外激光成像系統(tǒng)顯色，以GAPDH作為內(nèi)參，采用Image J 1.48v軟件分析目的蛋白灰度值，以目的蛋白條帶與內(nèi)參蛋白條帶的灰度值比值表示目的蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與對照組（灰度值比值為1）和DOX組（灰度值比值為0.93±0.08）比較，其余各組MCF-7/ADR細(xì)胞中P-gp表達(dá)水平（灰度值分別為0.82±0.03、0.75±0.05、0.45±0.03、0.39±0.02）均顯著降低（P＜0.05），且CLMSNs-SS-NH2@DOX/siRNA組MCF-7/ADR細(xì)胞中P-gp表達(dá)水平最低，表明該制劑遞送的外源siRNA可被有效內(nèi)化，從而下調(diào)P-gp的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)MCF-7/ADR細(xì)胞MDR。結(jié)果見圖7。

圖7 各組 MCF-7/ADR細(xì)胞中P-gp蛋白表達(dá)的電泳圖

3 討論

MSNs-SS-NH2具有中空介孔結(jié)構(gòu)及較大的比表面積，以CLs對其包覆后，制得的CLMSNs-SS-NH2復(fù)合載體具有更好的生物相容性，可提高藥物裝載量，并使藥物積聚于腫瘤部位釋放。另外，由于CLs帶正電荷可有效將呈弱負(fù)電性的siRNA以靜電吸附方式荷載[12―13]，從而制得同時負(fù)載DOX和siRNA的CLMSNs-SSNH2@DOX/siRNA，該制劑理化性質(zhì)良好，且具有良好的pH/還原雙重響應(yīng)釋藥特性。這可能是由于在酸性環(huán)境中該制劑脂膜層更容易被破壞，進(jìn)一步在腫瘤微環(huán)境中促使－SS－斷裂，進(jìn)而使DOX在腫瘤細(xì)胞內(nèi)積聚釋放[14―16]。細(xì)胞實驗結(jié)果顯示，CLMSNs-SS-NH2@DOX/siRNA可將DOX和siRNA有效遞送至MCF-7/ADR細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)而抑制細(xì)胞遷移增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，阻滯細(xì)胞于G0/G1期，并下調(diào)P-gp的表達(dá)以逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞MDR。

綜上所述，本研究成功制備同時負(fù)載DOX和siRNA的CLMSNs-SS-NH2@DOX/siRNA；該制劑理化性質(zhì)良好，具有pH/還原雙重響應(yīng)釋藥特性，且可通過下調(diào)P-gp表達(dá)逆轉(zhuǎn)MCF-7/ADR細(xì)胞MDR。