消食顆?；瘜W成分鑒定及其治療功能性消化不良的潛在作用機制研究Δ

余秋香，李思雨，常安，馮佳鑫，張慧 （遼寧中醫(yī)藥大學藥學院，遼寧 大連 116600）

功能性消化不良（functional dyspepsia，F(xiàn)D）指被認為起源于胃十二指腸區(qū)域的餐后飽脹不適、早飽感、上腹痛和上腹燒灼感中的1種或多種消化不良癥狀，是一種異質(zhì)性疾病，臨床較為常見。中醫(yī)根據(jù)臨床辨證將FD歸屬于“痞滿”“胃脘痛”“積滯”范疇[1]。中醫(yī)治則以健脾和胃、消積導滯為主[2]。消食顆粒是由山楂、烏梅、神曲3味中藥精制而成的復方顆粒，臨床上用于脾胃氣滯、食積內(nèi)停所致的脘腹脹滿、腹瀉便溏。本方中山楂、烏梅、神曲3味中藥聯(lián)合使用，具有健脾消食之功，但目前消食顆粒發(fā)揮藥理作用的物質(zhì)基礎尚不清楚。鑒于此，本研究采用超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF-MS）技術(shù)對消食顆粒進行化學成分分析，然后利用網(wǎng)絡藥理學及分子對接技術(shù)探究其治療FD的作用靶點，以期為消食顆粒的質(zhì)量控制及合理利用提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器有：Agilent 1290型UPLC儀、Agilent 6550型三重四極桿高分辨質(zhì)譜儀（配置Dual AJS ESI離子源）[安捷倫科技（中國）有限公司]、JA 21002型精密電子天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

本研究所用的主要藥品與試劑有：消食顆粒（吉林吉春制藥股份有限公司，批號210110，規(guī)格15 g/袋），對照品琥珀酸、檸檬酸、α-亞油酸、L-纈氨酸、蘋果酸（成都埃法生物科技有限公司，批號分別為AF20081654、AF200710101、AF20092333、20050253、20051251，純度均不低于98%），對照品槲皮素、異鼠李素、牡荊素、表兒茶素（中國食品藥品檢定研究院，批號分別為100081-200907、110860-201109、111687-200602、110878-200102，純度均不低于98%），對照品兒茶素、山柰酚、熊果酸、木犀草素（上海源葉生物科技有限公司，批號分別為20111218、B21126、B21403、20120521，純度均不低于98%）。

2 方法

2.1 基于UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)的消食顆?；瘜W成分鑒定

2.1.1 混合對照品溶液的制備 分別稱取槲皮素、牡荊素、蘋果酸、檸檬酸、表兒茶素、山柰酚、異鼠李素、熊果酸、琥珀酸、L-纈氨酸、木犀草素、α-亞油酸、兒茶素對照品適量，加甲醇制成各對照品質(zhì)量濃度均為20.0 μg/mL的混合對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取消食顆粒粉末5.0 g，加60%乙醇制成質(zhì)量濃度為1.0 g/mL的溶液，超聲（頻率40 kHz，功率100 W）10 min，過0.22 μm微孔濾膜，收集濾液，即得。

2.1.3 色譜條件 采用Agilent C18色譜柱（50 mm×2.1 mm），以0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）為流動相進行梯度洗脫（0～3 min，95% A；3～5 min，95%A→90% A；5～15 min，90%A→80%A；15～25 min，80%A→55%A；25～35 min，55%A→20%A；35～35.5 min，20%A→95%A；35.5～40 min，95%A）；柱溫為30 ℃；流速為0.4 mL/min；檢測波長為325 nm；進樣量為3 μL；分析時間為40 min，柱色譜洗脫液不經(jīng)分流直接導入質(zhì)譜系統(tǒng)檢測。

2.1.4 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源（ESI），在正、負離子模式下檢測，二級質(zhì)譜采集采用Auto MS/MS模式；干燥氣體流速為6 L/min，干燥氣體溫度為250 ℃；毛細管電壓為3 500 V，霧化器壓力為35 psi，碎裂電壓為175 V，二級質(zhì)譜碰撞電壓為15 eV；質(zhì)譜采集范圍為質(zhì)荷比（m/z）100～3 000。

2.1.5 成分鑒定 將“2.1.1”“2.1.2”項下混合對照品溶液和供試品溶液按照“2.1.3”“2.1.4”項下條件進樣分析，獲得正、負離子模式下的總離子流圖。通過一級和二級質(zhì)譜信息分析并結(jié)合相關(guān)文獻進行成分鑒定。

2.2 基于網(wǎng)絡藥理學的消食顆粒治療FD的潛在作用機制研究

2.2.1 活性成分及其作用靶點的篩選 選取從消食顆粒中鑒定出的化學成分作為目標成分，將其分別輸入TCMID 數(shù)據(jù)庫（http：//www.megabionet.org/tcmid/）、中藥分子機制的生物信息分析工具（BATMAN-TCM，http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）及中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺數(shù)據(jù)庫（TCMSP，https：//old.tcmsp-e.com/tc‐msp.php）中，根據(jù)口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和Lipinski類藥五原則篩選活性成分[3]。然后利用UniProt數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）獲取靶點蛋白，去重后即得到消食顆?；钚猿煞值陌悬c。

2.2.2 FD相關(guān)靶點基因的篩選 以“functional dyspepsia”為關(guān)鍵詞在GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）、Drugbank 數(shù)據(jù)庫（https：//go.drugbank.com/）及在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（OMIM，https：//omim.org/）中進行檢索，獲取與FD相關(guān)的靶點基因。

2.2.3 “藥物-成分-靶點”互作網(wǎng)絡的構(gòu)建 利用生物信息學在線數(shù)據(jù)庫作圖工具（https：//www.bioinformatics.com.cn/），獲得成分靶點和疾病靶點交集圖。將交集靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫（https：//cn.string-db.org/）中，獲得靶點間相互作用關(guān)系并導入Cytoscape 3.9.0軟件，構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡，同時計算蛋白之間的度值、介度中心度和接近中心度，按大于2倍度值中位數(shù)的條件篩選核心靶點蛋白。

2.2.4 基因本體功能注釋和KEGG通路富集 基于DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）對消食顆粒與FD的交集靶點基因進行基因本體（GO）功能注釋和KEGG通路富集分析，限定物種為“Human（人類）”，保留q值（即校正后的P值）小于0.05的富集條目，并按照q值大小進行排序。GO分析選取排名前10位的富集結(jié)果進行分析，KEGG分析選取排名前20位的富集結(jié)果進行分析。采用微生信在線數(shù)據(jù)庫（https：//www.bioin‐formatics.com.cn/）實現(xiàn)富集分析結(jié)果的可視化。

2.3 基于分子對接的消食顆粒治療FD的靶點蛋白驗證

從PubChem數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中下載活性成分的2D結(jié)構(gòu)，保存為“sdf”格式文件，使用chem3D軟件將活性成分的2D結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為3D，以最小自由能對結(jié)構(gòu)進行優(yōu)化，然后保存為“Mol2”格式文件，即為小分子配體。從RCSB PDB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org/）中下載蛋白受體的3D結(jié)構(gòu)，導入pymol 2.4.0軟件進行去水、分離配體處理，保存為“pdb”格式文件，即為蛋白受體。使用AutoDock tools軟件確定小分子配體可扭轉(zhuǎn)鍵，并對蛋白受體進行加氫等處理，然后將小分子配體和蛋白受體均轉(zhuǎn)存為“pbdqt”格式文件，使用AutoDock vina軟件將小分子配體和蛋白受體進行分子對接，確定核心靶點與核心成分的結(jié)合親和力。結(jié)合能＞－5～－4.25 kcal/mol表示配體小分子與受體蛋白存在一定活性，＞－7～－5 kcal/mol表示具有較好的活性，≤－7 kcal/mol表示具有很好的活性[4]。

3 結(jié)果

3.1 消食顆?；瘜W成分的鑒定結(jié)果

從消食顆粒中共鑒定出53種化學成分，主要為黃酮類和有機酸類化合物，詳見圖1、表1。

圖1 正、負離子模式下消食顆粒UPLC-Q-TOF-MS檢測的總離子流圖

表1 消食顆?；瘜W成分鑒定結(jié)果

續(xù)表1

3.2 消食顆粒治療FD的作用機制預測結(jié)果

3.2.1 消食顆?；钚猿煞旨捌渥饔冒悬c的篩選結(jié)果采用TCMSP、TCMID及BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫，在設定的篩選條件下，從消食顆粒中鑒定出的53種主要化學成分中篩選出了23種活性成分（包括槲皮素、山柰酚、異鼠李素等），共獲得潛在核心靶點206個。

3.2.2 FD疾病靶點的篩選結(jié)果 從GeneCards、Drug‐bank、OMIM 3個數(shù)據(jù)庫中共篩選出FD疾病靶點2 711個，獲得成分-疾病交集靶點蛋白147個，將其作為消食顆粒治療FD的潛在靶點。

3.2.3 “藥物-成分-靶點”互作網(wǎng)絡的分析結(jié)果 “藥物-成分-靶點”互作網(wǎng)絡分析結(jié)果顯示，槲皮素有126條邊，山柰酚有50條邊，異鼠李素有22條邊，蘆丁有18條邊（邊數(shù)越多說明與該活性成分相互作用的靶點越多）。通過比較該網(wǎng)絡中各成分的度值，篩選出度值排名前7位的活性成分，分別為槲皮素、山柰酚、熊果酸、β-谷甾醇、豆甾醇、異鼠李素、蘆丁。成分-疾病交集靶點的PPI網(wǎng)絡可視化結(jié)果（圖2）顯示，經(jīng)Cytoscape 3.9.0軟件篩選后最終得到6個核心靶點蛋白，分別為雌激素受體（es‐trogen receptor，ESR1）、雄激素受體（androgen receptor，AR）、信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT3）、細胞腫瘤抗原（cellu‐lar tumour antigen，TP53）、乳腺癌組織中缺氧誘導因子1亞基α（hypoxia-inducible factor 1 subunit α in breast can‐cer tissue，HIF1A）、原癌基因酪氨酸蛋白激酶（protooncogene tyrosine protein kinase，SRC）。

圖2 成分-疾病交集靶點的PPI網(wǎng)絡可視化圖

3.2.4 GO功能注釋和KEGG通路富集分析結(jié)果 GO功能注釋分析結(jié)果顯示，共獲得了623個GO條目，包括330個生物學過程（bioprogress，BP）條目、141個細胞組分（cell components，CC）條目和152個分子功能（molicu‐lar function，MF）條目。BP涉及對脂多糖的反應、對細菌來源分子的反應及對缺氧的反應等；CC涉及細胞膜上的膜筏、膜性結(jié)構(gòu)域及膜區(qū)域等；MF主要涉及酶結(jié)合蛋白同質(zhì)二聚體活性、細胞核受體活性及配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性等。

KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，共獲得173個條目（q值＜0.05），排名靠前的信號通路包括乙型肝炎、流體剪切應力和動脈粥樣硬化、磷脂酰肌醇3-激酶（phospha‐tidylinositol 3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein ki‐nase，MAPK）及晚期糖基化產(chǎn)物（advanced glycosylation products，AGE）-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（receptor for advanced glycosylation end products，RAGE）等，除此之外還有一些腫瘤壞死因子及癌癥信號通路。

3.2.5 消食顆粒主要活性成分與核心靶點蛋白的分子對接結(jié)果 分子對接結(jié)果顯示，槲皮素、山柰酚、異鼠李素、蘆丁、β-谷甾醇與核心靶點ESR1、AR、STAT3、TP53、HIF1A、SRC的結(jié)合能均小于－7.0 kcal/mol，表明其結(jié)合活性較強。

4 討論

雖然FD的發(fā)病機制尚不完全明確，但現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，胃腸道運動功能障礙、內(nèi)臟超敏反應、炎癥反應及精神心理因素等均可能導致FD[10―14]。本研究結(jié)果表明，槲皮素、山柰酚、熊果酸、β-谷甾醇、豆甾醇、異鼠李素、蘆丁等化合物在FD的治療中可能發(fā)揮重要的作用。相關(guān)藥理研究表明，槲皮素具有雙向調(diào)節(jié)胃腸道平滑肌促進功能性便秘大鼠胃腸動力的作用[15]；豆甾醇可改善脂肪刺激引起內(nèi)臟高敏感；調(diào)節(jié)脂肪代謝[16]；熊果酸、β‐谷甾醇及異鼠李素可通過減少炎癥因子釋放發(fā)揮抗炎作用，調(diào)節(jié)機體免疫，進而改善機體損傷[16―18]；蘆丁可保護胃黏膜并抑制胃酸分泌，對消化系統(tǒng)疾病有一定的治療作用；山柰酚不僅具有顯著的抗炎活性，而且可顯著改善慢性應激抑郁模型大鼠的抑郁樣行為，保護神經(jīng)功能[19]。

通過PPI網(wǎng)絡結(jié)果分析，最終篩選出6個核心靶點，分別為 ESR1、AR、STAT3、TP53、HIF1A、SRC。其中ESR1為FD的主要靶點[20]，可通過抑制胃排空、改變胃動力及節(jié)律、抑制胃酸分泌發(fā)揮作用；AR在腸道固有層的間充質(zhì)細胞中表達，發(fā)揮抑制細胞增殖的作用，與腸道相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[21]。STAT3主要參與調(diào)節(jié)炎癥免疫反應和胃腸激素分泌從而增強胃腸運動[21]；TP53可使損傷的細胞凋亡，并在消化道疾病中對維持胃腸道黏膜的完整性有著重要作用[22]；SRC作為使消化道疾病發(fā)生惡化的作用靶點，常與胃癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[23]。

GO功能注釋分析結(jié)果顯示，消食顆?？赏ㄟ^多種生物過程、細胞組成及分子功能對FD進行調(diào)控。KEGG通路富集分析結(jié)果表明，消食顆粒主要通過多條信號通路發(fā)揮治療FD的作用，其中乙型肝炎、PI3K-Akt、AGERAGE、MAPK、癌癥等為主要調(diào)節(jié)信號通路。研究發(fā)現(xiàn)，肝功能異常會導致代謝紊亂，而乙型肝炎及丙型肝炎信號通路都會引起肝功能損傷[24]。MAPK信號通路與炎癥反應有關(guān)，且與很多肝臟疾病均有密切關(guān)系，降低其表達可以促進脂肪的代謝，緩解炎癥反應[25]?，F(xiàn)有研究表明，通過激活PI3K-Akt信號通路，可以抑制胃腸道平滑肌細胞的凋亡[26]。胰島素是調(diào)節(jié)代謝的重要激素，糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路對糖脂代謝起著重要的調(diào)節(jié)作用[27―28]。癌癥是一種慢性消耗性疾病，腫瘤的生長引發(fā)各種消化酶分泌異常、代謝紊亂，從而導致消化不良的癥狀。分子對接結(jié)果表明，槲皮素、山柰酚、異鼠李素、蘆丁、β-谷甾醇與靶點STAT3、HIF1A、SRC等均具有較強的結(jié)合活性，提示消食顆粒可能是通過調(diào)節(jié)這些關(guān)鍵靶點發(fā)揮其藥理作用的。

綜上所述，本文基于UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)共鑒定出53種消食顆粒的主要化學成分。通過網(wǎng)絡藥理學和分子對接預測，消食顆粒可能是通過槲皮素、異鼠李素、山柰酚等活性成分作用于STAT3、HIF1A、SRC等靶點，調(diào)節(jié)PI3K-Akt、AGE-RAGE、MAPK等信號通路，從而發(fā)揮其對FD的治療作用，但后期需進一步結(jié)合藥理學實驗進行驗證。