滇烏堿通過線粒體凋亡途徑致大鼠心肌損傷的研究 Δ

司徒瑩 ，程婉秋 ，沈志濱 ，陳艷芬 ，唐春萍 ，陳聰 ，江濤 （.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣州 50006；2.廣東藥科大學(xué)實驗動物中心，廣州 50006；.廣東省局部精準藥物遞藥制劑工程技術(shù)研究中心，廣州50006）

黃草烏為毛茛科植物黃烏頭Aconitum vilmorini‐anum Kom.的干燥塊根[1]，有劇毒，收載于2005年版《云南省中藥材標準》中。黃草烏具有祛風(fēng)散寒、除濕止痛的功效，臨床用于治療跌打損傷、風(fēng)濕痛、手足厥冷等[2]。烏頭屬植物對心臟有明顯毒性，能誘發(fā)不同類型的心律失常。其含有的烏頭屬類生物堿是主要的毒性成分，其中以烏頭堿最具代表性[3]。黃草烏同屬烏頭屬植物，其生品中所含的雙酯型二萜生物堿（如滇烏堿）與烏頭堿的結(jié)構(gòu)相似[4]。滇烏堿是黃草烏的主要活性成分之一，但同時也是其主要毒性成分之一[5]。本課題組前期研究結(jié)果顯示，黃草烏經(jīng)炮制后對心臟的毒性明顯降低，這與黃草烏炮制后滇烏堿含量顯著降低有關(guān)[5―6]。相關(guān)研究表明，滇烏堿引起大鼠心律失常的毒性作用可能與其降低了心肌細胞線粒體能量代謝和引起了鈣超載有關(guān)[7]；并且，滇烏堿還可抑制H9c2心肌細胞活性，破壞心肌細胞膜的穩(wěn)定性，誘導(dǎo)心肌細胞凋亡[8]。但關(guān)于滇烏堿致大鼠心肌損傷與線粒體凋亡途徑的相關(guān)性尚未明確。

細胞凋亡又名細胞程序性死亡，是維持機體正常新陳代謝的一種正常的生理過程。心肌細胞為高度分化的終末細胞，不具有再生能力，而過度凋亡可造成心肌細胞持續(xù)喪失，使心肌發(fā)生結(jié)構(gòu)性病變[9]?，F(xiàn)有研究表明，細胞凋亡的線粒體途徑是指由于線粒體受到氧化應(yīng)激、鈣超載、DNA損傷等多種刺激啟動凋亡程序，激活多種轉(zhuǎn)錄因子而引起的細胞凋亡[10]。本文基于現(xiàn)有研究，通過線粒體途徑探究滇烏堿導(dǎo)致大鼠心肌細胞凋亡的機制，從而揭示滇烏堿引起大鼠心肌損傷的可能毒性機制，以期為黃草烏及其活性成分的臨床安全使用提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器有：VARIOSKAN型多功能微孔板讀數(shù)儀[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]，Bio-Rad型電泳儀、電轉(zhuǎn)系統(tǒng)（Mini型蛋白電泳系統(tǒng)）、UV1300/1500型紫外-可見分光光度計[美析（中國）儀器有限公司]，URIT-8021A型全自動生化分析儀（桂林優(yōu)利特醫(yī)療電子有限公司），LG2000型數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)（杭州朗基科學(xué)儀器有限公司），Infinite 200 PRO型多功能熒光酶標儀（奧地利Tecan Austria GmbH公司），BX51型熒光顯微鏡（日本Olympus公司），JEM400 PLUS型電子透射顯微鏡（日本電子株式會社）。

1.2 主要藥品與試劑

滇烏堿對照品（批號MUST1910，純度≥98%）、烏頭堿對照品（批號MUST1911，純度≥98%）均購自成都曼斯特生物科技有限公司；肌酸激酶（creatine kinase，CK）檢測試劑盒（批號25192028）、肌酸激酶同工酶（creatine kinase isoenzyme，CK-MB）檢測試劑盒（批號25192124）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）檢測試劑盒（批號25191925）均購自桂林優(yōu)利特醫(yī)療電子有限公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒（批號A003）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測試劑盒（批號A001-3-2）、BCA蛋白濃度檢測試劑盒（批號A045-4-2）均購自南京建成生物工程研究所；一步法TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（批號C1086）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測試劑盒（批號C1051902）購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司；兔源胱天蛋白酶3（caspase-3）多克隆抗體、兔源caspase-9多克隆抗體、兔源B淋巴細胞瘤2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）單克隆抗體、兔源3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）單克隆抗體均購自英國Abcam公司；兔源Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 as‐sociated X protein，Bax）單克隆抗體購自沈陽萬類生物科技有限公司；山羊抗兔辣根過氧化物酶標記的IgG二抗購自美國Bioworld公司；其他試劑均為分析純或?qū)嶒炇页Ｓ靡?guī)格。

1.3 動物

本研究所用的動物為SPF級SD大鼠，共40只，雌雄各半，體質(zhì)量200～220 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供，動物生產(chǎn)合格證號為SCXK（粵）2018-0002。飼養(yǎng)環(huán)境溫度為20～25 ℃，相對濕度為40%～70%。所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后進行實驗。該實驗方案經(jīng)廣東藥科大學(xué)動物實驗倫理委員會批準，批準號為gdpulacspf-2017319。

2 方法

2.1 動物分組與給藥

將40只SD大鼠按隨機數(shù)字表法隨機分為正常組、滇烏堿高劑量組（0.14 mg/kg）、滇烏堿低劑量組（0.09 mg/kg）和烏頭堿組（陽性對照，0.88 mg/kg），每組10只。正常組大鼠灌胃生理鹽水，各給藥組大鼠灌胃相應(yīng)藥液，灌胃體積均為1 mL/100 g，每天灌胃1次，連續(xù)灌胃7 d。給藥方案參照本課題組前期研究設(shè)置，滇烏堿高、低劑量分別為大鼠的1/4、1/6半數(shù)致死量（median lethal dose，LD50），烏頭堿劑量為大鼠的1/10 LD50[7]。

2.2 標本采集與處理

末次灌胃1 h后，將大鼠麻醉，腹主動脈取血5 mL，將血液靜置一段時間后，以3 500 r/min離心10 min，分離血清。取血后，立即打開大鼠胸腔，用生理鹽水灌注心臟，取一部分左心耳心肌組織于4%多聚甲醛固定液中固定保存，另一部分左心耳心肌組織于2.5%戊二醛中固定保存；其余心肌組織于－80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 大鼠血清中LDH、CK、CK-MB水平檢測

取大鼠血清，分別按各試劑盒說明書步驟操作，使用全自動生化分析儀檢測大鼠血清中心肌酶學(xué)指標LDH、CK、CK-MB的水平。

2.4 大鼠血清中MDA含量和SOD活性檢測

取大鼠血清，按相應(yīng)試劑盒說明書操作，使用紫外-可見分光光度法檢測大鼠血清中MAD含量和SOD活性。

2.5 大鼠心肌組織中ROS水平檢測

取凍存的大鼠心肌組織約50 mg，于300目尼龍網(wǎng)上研磨制成組織勻漿，以1 000 r/min離心5 min制備細胞懸液，加入2 mL DCFH-DA探針，在37 ℃孵育30 min，然后再以1 000 r/min離心5 min，收集細胞沉淀物。使用多功能微孔板讀數(shù)儀在激發(fā)波長504 nm、發(fā)射波長529 nm處檢測ROS的熒光強度，熒光強度越高表示ROS水平越高。

2.6 大鼠心肌組織病理形態(tài)學(xué)及線粒體超微結(jié)構(gòu)觀察

取4%多聚甲醛固定的心肌組織（每組隨機選3只大鼠樣本），經(jīng)過脫水浸蠟、石蠟包埋、切片（厚度4 μm）、HE染色后，用中性樹脂封片，于光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織病理學(xué)變化。另取2.5%戊二醛固定的心肌組織（約1 mm3的小塊），經(jīng)過常規(guī)的脫水、樹脂滲透、烘烤、包埋、加熱聚合固化、切片（厚度1 μm）、鈾鉛雙染色、2%乙酸雙氧鈾染色、檬酸鉛染色后，于電子透射顯微鏡下觀察心肌組織線粒體變化。

2.7 大鼠心肌細胞凋亡檢測

取“2.6”項下的心肌組織石蠟切片（厚度4 μm），脫蠟水合后，使用磷酸鹽緩沖液（PBS）、蛋白酶K及封閉液預(yù)處理切片。用TdT酶反應(yīng)液覆蓋切片，在避光條件下以37 ℃培養(yǎng)60 min，再將熒光素抗體（稀釋比例1∶200）覆蓋切片，避光培養(yǎng)30 min；PBS沖洗切片后，在熒光顯微鏡下觀察心肌細胞凋亡情況并拍照記錄，每個樣本選取3個視野，使用Image J V 1.8.0軟件對視野內(nèi)凋亡細胞進行計數(shù)，取平均值。

2.8 大鼠心肌組織中線粒體途徑凋亡相關(guān)蛋白表達檢測

每組隨機選取3只大鼠的組織樣本進行實驗。稱取凍存的大鼠心肌組織約1 000 mg，剪碎后加入適量裂解液提取總蛋白，并使用BCA蛋白濃度檢測試劑盒測定總蛋白濃度。將提取的總蛋白配制成上樣緩沖液后煮沸，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（濃縮膠電壓60～100 V，時間為30 min；分離膠電壓100～200 V，時間為60 min ）分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜（Bax、Bcl-2的電轉(zhuǎn)條件為300 mA、30 min，caspase-3、caspase-9的電轉(zhuǎn)條件為300 mA、45 min）；用5%脫脂奶粉封閉過夜，次日加入Bax一抗（稀釋比例為1∶2 000）、Bcl-2一抗（稀釋比例為1∶500）、caspase-3一抗（稀釋比例為1∶500）、caspase-9一抗（稀釋比例為1∶1 000）、GAPDH一抗（稀釋比例為1∶10 000），4 ℃孵育過夜；洗膜后，加入相應(yīng)二抗（稀釋比例為1∶40 000），室溫孵育2 h；用ECL顯色試劑盒顯色，化學(xué)發(fā)光成像儀下顯影并拍照，使用Image JV 1.8.0軟件分析條帶灰度值。以目標蛋白條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH蛋白條帶灰度值的比值表示各目標蛋白的相對表達水平。

2.9 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 滇烏堿對大鼠血清中心肌酶學(xué)指標的影響

與正常組比較，滇烏堿高、低劑量組和烏頭堿組大鼠血清中LDH、CK、CK-MB水平均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），詳見表1。

表1 各組大鼠血清中LDH、CK、CK-MB水平檢測結(jié)果（±s，n＝10，U/L）

表1 各組大鼠血清中LDH、CK、CK-MB水平檢測結(jié)果（±s，n＝10，U/L）

a：與正常組比較，P＜0.01；b：與正常組比較，P＜0.05

組別正常組滇烏堿高劑量組滇烏堿低劑量組烏頭堿組CK-MB 139.50±73.12 226.04±76.29a 212.50±64.67b 222.00±60.20b LDH 568.80±141.75 781.70±158.26a 739.80±182.25b 782.30±151.09a CK 636.30±135.30 1 149.00±228.51a 1 118.40±286.17a 1 063.40±173.07a

3.2 滇烏堿對大鼠血清中MDA含量和SOD活性的影響

與正常組比較，滇烏堿高、低劑量組和烏頭堿組大鼠血清中MDA含量均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），SOD活性均顯著降低（P＜0.01），詳見表2。

表2 各組大鼠血清中MDA含量和SOD活性檢測結(jié)果（±s，n＝10）

表2 各組大鼠血清中MDA含量和SOD活性檢測結(jié)果（±s，n＝10）

a：與正常組比較，P＜0.01；b：與正常組比較，P＜0.05

組別正常組滇烏堿高劑量組滇烏堿低劑量組烏頭堿組SOD活性/（U/mL）11.05±0.40 10.32±0.24a 10.43±0.31a 10.41±0.30a MDA含量/（nmol/mL）0.40±0.05 0.49±0.04a 0.46±0.04b 0.50±0.09a

3.3 滇烏堿對大鼠心肌組織中ROS水平的影響

與正常組[ROS熒光強度為5.61±0.34（n＝10）]比較，滇烏堿高、低劑量組和烏頭堿組大鼠心肌組織中ROS水平[ROS熒光強度依次為7.57±0.81、7.38±0.97、8.71±1.17（n＝10）]均顯著升高（P＜0.01）。

3.4 滇烏堿對大鼠心肌組織病理形態(tài)學(xué)及線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響

3.4.1 心肌組織病理形態(tài)學(xué) 光鏡下，正常組大鼠心肌組織細胞排列緊湊、規(guī)整，心肌細胞形態(tài)及細胞核無異常變化。與正常組比較，各給藥組大鼠心肌細胞排列不緊湊，胞間空隙增大，心肌細胞的胞質(zhì)出現(xiàn)明顯空泡，部分細胞核固縮，少量心肌纖維出現(xiàn)斷裂，其中以滇烏堿高劑量組大鼠的病變程度最高。結(jié)果見圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織病理形態(tài)學(xué)顯微圖（HE染色，×400）

3.4.2 心肌組織線粒體超微結(jié)構(gòu) 電鏡下，正常組大鼠心肌組織線粒體超微結(jié)構(gòu)無明顯變化，線粒體嵴豐富，未見明顯腫脹。滇烏堿高、低劑量組大鼠心肌組織線粒體大小不等、分布紊亂，少數(shù)線粒體明顯腫脹、空泡化、嵴斷裂、嵴減少，可見圓盤狀嵴線粒體，少數(shù)線粒體體積縮小、內(nèi)嵴擴張，偶見線粒體自噬。烏頭堿組大鼠心肌組織線粒體大小不等、分布明顯紊亂，少數(shù)線粒體明顯腫脹、空泡化、嵴斷裂、嵴減少，偶見線粒體自噬。結(jié)果見圖2。

圖2 各組大鼠心肌組織線粒體超微結(jié)構(gòu)顯微圖（×25 000）

3.5 滇烏堿對大鼠心肌細胞凋亡的影響

與正常組[每個視野中凋亡細胞數(shù)為（10.00±7.90）個（n＝3）]比較，滇烏堿高、低劑量組和烏頭堿組大鼠心肌凋亡細胞數(shù)[每個視野中凋亡細胞數(shù)依次為（213.20±50.61）、（74.60±12.05）、（140.80±31.14）個（n＝3）]顯著增加（P＜0.01）。結(jié)果見圖3。

圖3 各組大鼠心肌細胞凋亡熒光顯微圖（×200）

3.6 滇烏堿對大鼠心肌組織中線粒體途徑凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

與正常組比較，滇烏堿高劑量組和烏頭堿組大鼠心肌組織中Bcl-2/Bax比值顯著降低（P＜0.01），caspase-9、cleaved-caspase-9、caspase-3、cleaved-caspase-3蛋白相對表達水平均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）；滇烏堿低劑量組大鼠心肌組織中Bcl-2/Bax比值顯著降低（P＜0.01），caspase-3蛋白相對表達水平顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見圖4、表3。

圖4 各組大鼠心肌組織中線粒體途徑凋亡相關(guān)蛋白表達的電泳圖

表3 各組大鼠心肌組織中線粒體途徑凋亡相關(guān)蛋白相對表達水平檢測結(jié)果（±s，n＝3）

表3 各組大鼠心肌組織中線粒體途徑凋亡相關(guān)蛋白相對表達水平檢測結(jié)果（±s，n＝3）

a：與正常組比較，P＜0.01；b：與正常組比較，P＜0.05

組別正常組滇烏堿高劑量組滇烏堿低劑量組烏頭堿組Bcl-2/Bax 0.74±0.10 0.32±0.04a 0.56±0.05a 0.46±0.03a caspase-9/GADPH 0.11±0.03 0.32±0.06b 0.21±0.04 0.30±0.14b cleaved-caspase-9/GADPH 0.06±0.01 0.21±0.12b 0.08±0.03 0.28±0.04b caspase-3/GADPH 0.13±0.03 0.26±0.05b 0.26±0.10b 0.35±0.05a cleaved-caspase-3/GADPH 0.40±0.06 0.57±0.09b 0.47±0.05 0.68±0.07a

4 討論

心肌酶譜包括LDH、CK、CK-MB，主要存在于心肌細胞中，是檢測心肌損傷的重要指標[11―12]。當(dāng)心肌細胞受損時，細胞膜通透性發(fā)生變化，LDH、CK、CK-MB在血清中的水平會明顯升高。本研究結(jié)果顯示，滇烏堿給藥后，大鼠心肌組織發(fā)生心肌纖維斷裂、空隙變大及細胞核固縮，心肌細胞膜的完整性遭到破壞，血清中LDH、CK、CK-MB水平顯著升高，這提示滇烏堿可致心肌細胞損傷。

氧化應(yīng)激是心肌損傷的主要病理因素，而ROS是引起細胞氧化應(yīng)激的主要因子，SOD活性及MDA含量能反映細胞脂質(zhì)過氧化損傷程度[13―14]。線粒體是心肌細胞重要的細胞器，參與細胞能量代謝等活動。正常線粒體產(chǎn)生的ROS可被SOD等抗氧化酶清除，從而將ROS維持在較低水平[15]。當(dāng)細胞蓄積過量ROS時，會破壞線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)類物質(zhì)，導(dǎo)致其功能和細胞內(nèi)氧利用率下降，細胞進行無氧呼吸產(chǎn)生乳酸，而乳酸堆積會促使心肌細胞發(fā)生氧化應(yīng)激，出現(xiàn)細胞膜結(jié)構(gòu)改變和功能障礙，引起細胞膜的通透性增大，促使LDH、CK釋放量增加[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，滇烏堿能使大鼠心肌組織中ROS和MDA水平顯著升高、SOD活性顯著降低，并使心肌細胞線粒體出現(xiàn)大小不均、腫脹、空泡等改變，這提示滇烏堿可引起心肌細胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致心肌細胞線粒體損傷。

線粒體是心肌細胞內(nèi)源性凋亡的調(diào)控中心，其功能主要受Bcl-2蛋白家族的影響，并以Bax和Bcl-2為主要影響因子。細胞受到凋亡信號刺激時，Bcl-2/Bax比值的高低決定細胞是否進入凋亡程序（Bcl-2/Bax比值異常降低時細胞進入凋亡程序）[17]。caspase-9啟動的細胞凋亡途徑為內(nèi)源性途徑（又稱為線粒體途徑），與線粒體損傷有關(guān)；caspase-3是關(guān)鍵的凋亡程序執(zhí)行分子，一旦cas‐pase-3被激活，凋亡程序便無法終止[18]。氧化應(yīng)激與細胞凋亡間存在緊密聯(lián)系，心肌細胞氧化損傷時產(chǎn)生的大量ROS與線粒體DNA直接接觸，使DNA損傷后激活Bcl-2家族促凋亡蛋白在線粒體膜上表達，促進細胞凋亡[19]。當(dāng)細胞內(nèi)Bcl-2水平降低或Bax水平升高時，線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放，線粒體的膜電位消失，線粒體膜上大量細胞色素C釋放至細胞漿中，并激活caspase-9 酶原成為cleaved-caspase-9，cleaved-caspase-9又可激活下游的caspase-3成為cleaved-caspase-3，最終導(dǎo)致細胞凋亡[20]。本研究結(jié)果顯示，滇烏堿給藥后可導(dǎo)致大鼠心肌細胞凋亡，降低其心肌組織中Bcl-2/Bax比值，并升高其心 肌 組 織 中 caspase-9、cleaved-caspase-9、caspase-3、cleaved-caspase-3蛋白相對表達水平，這提示滇烏堿可通過線粒體途徑促進大鼠心肌細胞凋亡。

綜上所述，滇烏堿可引起大鼠心肌細胞損傷，其機制可能與破壞心肌細胞膜的完整性，使心肌細胞發(fā)生氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)心肌細胞通過線粒體途徑發(fā)生凋亡有關(guān)。但其對心臟毒性的具體作用機制還有待深入研究。