山西老陳醋沉淀物中川芎嗪檢測方法分析研究

王濤

（山西省食品研究所（有限公司），山西太原 030024）

山西老陳醋是中國四大名醋之一，其生產(chǎn)至今已有3 000 余年的歷史，素有“天下第一醋”的盛譽。山西老陳醋是以谷物為原料，經(jīng)過液化、糖化、發(fā)酵、陳釀等工藝制得。以色、香、醇、濃、酸五大特征著稱于世，富含氨基酸、糖類、有機酸、維生素等功效成分，具有軟化血管、降低膽固醇、降低甘油三酯、抗菌、美容養(yǎng)顏等功效。山西老陳醋在陳釀過程中產(chǎn)生的沉淀物，受到消費者和企業(yè)的普遍關注，而關注的重點是老陳醋沉淀物帶來的問題，嚴重影響著老陳醋的外觀和食用。業(yè)界較少關注老陳醋沉淀物的功能成分及開發(fā)和利用價值。川芎嗪（四甲基吡嗪）是山西老陳醋的特征指標，本文通過對山西老陳醋沉淀物中川芎嗪（四甲基吡嗪）檢測方法進行研究，為其開發(fā)和利用提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 試劑和材料

樣品為某品牌1 年期、2 年期、3 年期山西老陳醋沉淀物。

鹽酸川芎嗪標準品，中國食品藥品檢定研究院（其中含C8H12N2·HCl 以83.5℅計）；甲醇，色譜純；磷酸二氫銨，優(yōu)級純；三氯甲烷、氫氧化鈉、鹽酸，均為分析純。

微孔濾膜，孔徑0.45μm；pH試紙。

鹽酸川芎嗪標準儲備液：精密稱取30 mg 鹽酸川芎嗪標準品，用重蒸水定容至25 mL，配制成1.002 0 mg/mL 的標準儲備液。

1.2 儀器和設備

1260高效液相色譜儀，美國安捷倫儀器有限公司；TP-214 電子分析天平，美國丹佛儀器有限公司；AXTGL16M 高速離心機，山海趙迪生物科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品制備條件優(yōu)化

采用單因素試驗，分別考察樣品pH 值、三氯甲烷提取次數(shù)、離心轉速、離心時間對川芎嗪提取效果的影響，并在單因素試驗的基礎上進行正交試驗，優(yōu)選出樣品制備的最佳條件。

1.3.1.1 pH單因素試驗

準確稱取待測樣品2.00 g，將樣品的pH 值分別調整為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，將調整后的樣品置于分液漏斗中，加5.0 mL 氯仿，混勻萃取，以4 000 r/min 離心15 min，轉移氯仿層；重復上述加入氯仿以后的操作3 次，合并氯仿層。以0.2 mol/L鹽酸溶液分2次萃取氯仿相，每次4.50 mL，合并水相，用重蒸水定容至10.0 mL，經(jīng)孔徑0.45μm 濾膜過濾備用。

1.3.1.2 提取次數(shù)單因素試驗

準確稱取待測樣品2.00 g，用氫氧化鈉溶液調pH 值＞8.0，移入分液漏斗中加5.0 mL 氯仿，混勻萃取，以4 000 r/min 離心15 min，轉移氯仿層；重復上述加入氯仿以后的操作，分別萃取2 次、3 次、4 次、5 次，合并氯仿層。以0.2 mol/L 鹽酸溶液分2次萃取氯仿相，每次4.50 mL，合并水相，用重蒸水定容至10.0 mL，經(jīng)孔徑0.45μm濾膜過濾備用。

1.3.1.3 離心轉速單因素試驗

準確稱取待測樣品2.00 g，用氫氧化鈉溶液調pH 值＞8.0，移入分液漏斗中加5.0 mL 氯仿，混勻萃取，分別以3 000 r/min、4 000 r/min、5 000 r/min、6 000 r/min、7 000 r/min、8 000 r/min 離心15 min，轉移氯仿層；重復上述加入氯仿以后的操作3 次，合并氯仿層。以0.2 mol/L 鹽酸溶液分2 次萃取氯仿相，每次4.50 mL，合并水相，用重蒸水定容至10.0 mL，經(jīng)孔徑0.45μm濾膜過濾備用。

1.3.1.4 離心時間單因素試驗

準確稱取待測樣品2.00 g，用氫氧化鈉溶液調pH 值＞8.0，移入分液漏斗加5.0 mL 氯仿，混勻萃取，以4 000 r/min 分別離心5 min、10 min、15 min、20 min，轉移氯仿層；重復上述加入氯仿以后的操作3 次，合并氯仿層。以0.2 mol/L 鹽酸溶液分2 次萃取氯仿相，每次4.50 mL，合并水相，用重蒸水定容至10.0 mL，經(jīng)孔徑0.45μm濾膜過濾備用。

1.3.2 標準曲線的繪制

精密吸取鹽酸川芎嗪標準溶液0.05 mL、0.10 mL、0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL，用重蒸水定容至10 mL（相當于每毫升含鹽酸川芎嗪5.0μg、10.0μg、25.0μg、50.0μg、100.0μg）；分別進樣10μL，于279 nm 處測量峰面積，每個稀釋度重復進樣3 次，取平均值，以質量濃度為橫坐標，峰面積平均值為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3.3 儀器條件

色譜柱：C18柱，4.6 mm×150 mm×5μm；流動相：0.2 mmol/L 磷酸二氫銨∶甲醇=6∶4；流速∶0.8 mL/min；柱溫：25 ℃；進樣量：10μL；檢測波長：279 nm。

1.3.4 川芎嗪含量計算公式

式中：X—樣品中川芎嗪的含量，mg/mL；

c—曲線得到樣品中川芎嗪的質量濃度，μg/mL；

m—樣品質量，g；

V2—試樣定容體積，mL。

2 結果與分析

2.1 標準曲線

按上述1.3.2 繪制標準曲線（圖略），不同質量濃度的標準溶液對應的峰面積測定結果見下頁表1。

由表1 結果表明，在質量濃度為5.0μg/mL～100.0μg/mL 的范圍內，呈良好的線性關系，線性方程為：y=33.835 7x+8.290 34，相關系數(shù)為0.999 7。

表1 系列標準溶液測定結果

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 pH值對川芎嗪提取的影響

pH 值對川芎嗪提取的影響結果見下頁圖1。由圖1可以看出，當pH值增大時，川芎嗪含量也隨之增大。但是調節(jié)pH 值＞8 時，川芎嗪含量趨于平穩(wěn)。因此，選擇pH 值＞8。由曲線變化趨勢可知，樣品pH值對川芎嗪提取效果的影響較大。

2.2.2 提取次數(shù)對川芎嗪提取的影響

三氯甲烷提取次數(shù)對川芎嗪提取效果的影響結果見圖2。從圖2 可以看出，提取次數(shù)從1 次到2 次時，川芎嗪含量變化顯著，說明單次提取不充分，但是2 次提取之后，提取含量增加不明顯且較為平穩(wěn)，為節(jié)約成本，選擇提取次數(shù)2次較合適。

2.2.3 離心轉速對川芎嗪提取的影響

離心轉速對川芎嗪提取效果的影響結果見圖3。從圖3 可以看出，當離心轉速提高時，有利于提取液的分離，可提高川芎嗪提取的有效性，但是離心轉速超過4 000 r/min 時，提取含量趨于平穩(wěn)，故離心轉速選擇4 000 r/min較合適。

2.2.4 離心時間對川芎嗪提取的影響

離心時間對川芎嗪提取效果的影響見圖4。從圖4 可以看出，當離心時間增加時，有利于川芎嗪的充分提取，但是離心15 min 以后，川芎嗪含量趨于穩(wěn)定。因此，離心時間選擇15 min較合適。

2.3 正交試驗結果

根據(jù)單因素試驗，設計正交試驗，正交試驗因素水平設計見表2，試驗結果見下頁表3，方差分析見表4。

表2 正交試驗因素水平設計

表3 正交試驗結果

表4 方差分析表

3 結論

根據(jù)直觀分析表和方差分析表，得出影響川芎嗪提取的主要因素由大到小是：pH 值＞提取次數(shù)＞離心時間＞離心轉速，且pH 值影響因素顯著。山西老陳醋沉淀物川芎嗪測定的最佳條件為A3B2C1D3，即pH 值＞8，提取次數(shù)2 次，離心時間15 min，離心轉速4 000 r/min。