RT-PCR技術(shù)檢測(cè)非洲豬瘟病毒的作用研究

李興旺

（山東省武城縣畜牧漁業(yè)發(fā)展中心，山東德州 253300）

非洲豬瘟（ASF）是家豬或野豬被非洲豬瘟病毒（ASFV）感染而出現(xiàn)病變現(xiàn)象的一種疾病，為出血性病毒病的一種。被ASFV感染的豬多表現(xiàn)為呼吸受到明顯限制、外部皮膚、內(nèi)部器官不同程度的出血等，可給養(yǎng)豬業(yè)帶來極大地沖擊。針對(duì)ASF暫且沒有很好的防治方法，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將該疾病列入通報(bào)名錄中。

1 非洲豬瘟病毒

早在20世紀(jì)初期非洲豬瘟就已出現(xiàn)過。2018年8月，中國沈陽也發(fā)現(xiàn)1例疑似疫情，經(jīng)檢測(cè)確診為非洲豬瘟病毒。隨之而來的是中國大面積爆發(fā)非洲豬瘟疫情。作為動(dòng)物傳染病的一種，相較于其他傳染病，非洲豬瘟的危害最大，致死率達(dá)100%?，F(xiàn)在還沒有找到更好的防治措施。

非洲豬瘟病毒是一種DNA病毒，且是雙股線性的，分子組成復(fù)雜，具有極高的變異性能且蛋白極其豐富。DNA是雙鏈單分子線狀結(jié)構(gòu)，且末端是共價(jià)閉合的，構(gòu)成了非洲豬瘟病毒的基因組，其長(zhǎng)度因毒株的不同而有所差異，范圍在170～190kb，ORE多達(dá)151個(gè)，可編碼蛋白數(shù)量達(dá)到150～200種。非洲豬瘟病毒在機(jī)體內(nèi)的傳播主要通過在巨噬細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制來躲避機(jī)體產(chǎn)生自我免疫，從而使機(jī)體受到傷害。

非洲豬瘟具有多種基因型，具有極高的頑強(qiáng)力，溫度和pH變化都不會(huì)對(duì)它產(chǎn)生影響，如果對(duì)其進(jìn)行滅活處理，則需60℃的溫度，時(shí)間為20 min。病毒的存活在不同的寄宿環(huán)境中存活時(shí)間也不相同。它可以在排泄物、尸體、新鮮肉類和其他肉類產(chǎn)品中寄生。非洲豬瘟病毒對(duì)生存溫度適應(yīng)性極高。無論是常溫、低溫、高溫都有相當(dāng)長(zhǎng)的壽命。存活時(shí)間在常溫、4℃以下、凍肉中分別為6個(gè)月、1年、數(shù)年。

非洲豬瘟在豬群的發(fā)病順序通常為公豬、母豬、育肥豬、仔豬。感染非洲豬瘟的豬的發(fā)病表現(xiàn)，初期表現(xiàn)為高熱癥狀，這時(shí)養(yǎng)殖戶會(huì)錯(cuò)誤的診斷為發(fā)燒并針對(duì)發(fā)燒進(jìn)行治療，由于和發(fā)燒癥狀產(chǎn)生混淆，結(jié)果會(huì)導(dǎo)致病豬死亡速度加快，還會(huì)使得針孔注射處長(zhǎng)時(shí)間的流血，這時(shí)就可以初步判定為非洲豬瘟。更明顯的癥狀為體態(tài)表征發(fā)生肉眼可見的變化，耳朵出現(xiàn)紫色、大片的紫斑出現(xiàn)在體表。如果對(duì)受感染的死豬進(jìn)行尸檢，會(huì)發(fā)現(xiàn)其內(nèi)臟器官均出現(xiàn)程度不一的出血癥狀，這也可作為非洲豬瘟的一大重要特點(diǎn)。此外，還可能會(huì)出現(xiàn)吐血的癥狀，呼吸受到抑制、咳嗽、便秘，臨床表現(xiàn)多樣。

非洲豬瘟病毒可通過多種方式進(jìn)行傳播，如跨區(qū)域傳播、人車傳播、環(huán)境媒介傳播、品種傳播等。其感染途徑和其傳播途徑均有很多，如通過消化道、呼吸道等使得豬群感染。病毒如何在體內(nèi)進(jìn)行復(fù)制增殖呢？其過程為 ASFV運(yùn)用胞吞的方式進(jìn)入其靶細(xì)胞單核巨噬細(xì)胞體內(nèi)，從而達(dá)到復(fù)制增殖的目的。受感染的豬群在發(fā)病初期，病毒粒子存在于豬肺泡巨噬細(xì)胞中。伴隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，病毒進(jìn)行大規(guī)模的擴(kuò)散導(dǎo)致病毒血癥的形成，病毒的存在場(chǎng)所也會(huì)擴(kuò)散到腸道、腎臟等器官。ASFV入侵感染宿主機(jī)體的過程中有多種病毒結(jié)構(gòu)蛋白如P30、P12、P54等參與其中，因此可以利用上述結(jié)構(gòu)蛋白的特異性抗體，對(duì)上述病毒入侵過程進(jìn)行阻斷達(dá)到預(yù)防的目的[1]。

該病毒的DNA復(fù)制過程與在胞漿中進(jìn)行復(fù)制的痘病毒的復(fù)制過程有類似的地方，復(fù)制開始在病毒入侵細(xì)胞后，聯(lián)體的DNA中間體會(huì)被觀察到在細(xì)胞內(nèi)。從核周開始病毒形態(tài)的產(chǎn)生，隨后由波形蛋白和線粒體圍繞。在病毒粒子中，其內(nèi)脂質(zhì)膜的構(gòu)成，來源于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的脂質(zhì)膜。被ASFV強(qiáng)毒株感染的豬只，其死亡速度極快，機(jī)體免疫系統(tǒng)完全來不及反應(yīng)，以至于無法通過其豬只分離抗體。但被弱毒株感染的豬只，是可以在康復(fù)后進(jìn)行抗體檢測(cè)、分離，并得到高水平抗體的結(jié)果。這些抗體的產(chǎn)生雖然可以成為病毒粒子對(duì)巨噬細(xì)胞再次發(fā)起侵害的阻礙，降低豬只再一次發(fā)病的概率，但豬體內(nèi)仍有病毒存在，而且傳染性依然存在。由此可得弱毒株病毒會(huì)使豬只受到多次感染，從而證明ASFV可以很好的避開機(jī)體細(xì)胞免疫系統(tǒng)，其途徑主要是ASFV基因編碼一些能夠調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞免疫反應(yīng)的蛋白，利用這些蛋白干擾巨噬細(xì)胞被入侵所釋放信號(hào)的傳遞，從而抑制免疫基因的表達(dá)阻斷細(xì)胞免疫應(yīng)答。如何及時(shí)的發(fā)現(xiàn)、檢測(cè)該病毒，找到行之有效的檢測(cè)方法迫在眉睫。

當(dāng)前，聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）作為在各個(gè)行業(yè)都發(fā)揮了其成熟、有效的檢測(cè)作用的一種分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)，運(yùn)用PCR技術(shù)非洲豬瘟病毒進(jìn)行專項(xiàng)檢測(cè)對(duì)非洲豬瘟的防治和診治具有建設(shè)性意義。

越早對(duì)豬瘟進(jìn)行診斷，越有利于豬瘟的防治。診斷時(shí)，要有理有據(jù)，通過病豬的臨床表現(xiàn)，來確定診治方法、診治藥物等，早發(fā)現(xiàn)早扼制，有利于豬瘟的防治，從而使豬瘟得到有效控制。PCR 技術(shù)越來越成熟，并在檢測(cè)動(dòng)物疫病方向發(fā)揮重要作用，也可作為傳統(tǒng)血清學(xué)的替代物。將成熟檢測(cè)技術(shù)的經(jīng)驗(yàn)加以借鑒進(jìn)行檢測(cè)試驗(yàn)，可廣泛運(yùn)用于收益診斷，在縮短檢測(cè)時(shí)間的同時(shí)，大大提高了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，減少了由于非洲豬瘟疫情給養(yǎng)殖行業(yè)帶來的經(jīng)濟(jì)折損。RT-PCR 技術(shù)的應(yīng)用顯著提高了檢測(cè)效率，可有效規(guī)避樣本污染及假陽性結(jié)果的問題。借助于熒光定量 PCT 檢測(cè)的高特異性和高靈敏性，讓豬瘟病原體檢測(cè)快捷準(zhǔn)確[2]。

2 RT-PCR技術(shù)

RT- PCR的本質(zhì)為逆轉(zhuǎn)錄PCR，也就是將RNA的反轉(zhuǎn)錄(RT)和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增(PCR)相結(jié)合的技術(shù)[3]。首先通過反轉(zhuǎn)錄酶將RNA合成為cDAN；然后再以cDNA為模板，擴(kuò)增合成目的片段。RT-PCR技術(shù)由于其靈敏度高且被運(yùn)用在各個(gè)領(lǐng)域，因而在細(xì)胞領(lǐng)域也被廣泛運(yùn)用來檢測(cè)基因表達(dá)水平。RNA模板的來源有3種，分別為總RNA、mRNA、體外轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物。無論使用哪種，最重要的是保證RNA中沒有RNA酶且基因組不會(huì)受到污染。對(duì)于反轉(zhuǎn)錄引物的選擇，需根據(jù)實(shí)驗(yàn)的具體情況進(jìn)行選擇，可供選擇的引物有隨機(jī)引物、Oligo dT及基因特異性引物。3種任選哪一種都適合的情況為其真核細(xì)胞的mRNA是短的且無發(fā)卡結(jié)構(gòu)。

非洲豬瘟病毒檢測(cè)方法很多，如細(xì)胞接種、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）、實(shí)時(shí)定量PCR（realtimePCR）等。ASFV具有適合在非常規(guī)細(xì)胞中生存的特點(diǎn)，有散毒的隱藏風(fēng)險(xiǎn)。如果要檢測(cè)抗體的水平高低，最好選擇ELISA進(jìn)行檢測(cè)，但其不能判定ASFV。LAMP的特點(diǎn)易操作，靈敏度高，其缺點(diǎn)會(huì)造成氣溶膠污染現(xiàn)象，最關(guān)鍵的是多出現(xiàn)假陽性結(jié)果，導(dǎo)致檢測(cè)有較大的失誤。而real-timePCR也會(huì)出現(xiàn)一系列問題，成本高、環(huán)保效能低。相比較而言，PCR技術(shù)應(yīng)用范圍廣，也能規(guī)避上述檢測(cè)方法存在的問題，因此動(dòng)物疾病的診斷治療檢測(cè)多用PCR方法，特別對(duì)于診斷中、低毒力感染或慢性病例非常有用，是早期診斷的首選。

3 檢測(cè)步驟

3.1 采集樣品

樣品要從ASFV易產(chǎn)生復(fù)制的病變部位進(jìn)行采集，首先從病豬身上采集血液、脾臟、淋巴結(jié)等組織樣本，在其樣本上接種諸如豬肺泡巨噬細(xì)胞這樣的原代細(xì)胞。玫瑰花環(huán)指將豬紅細(xì)胞注射進(jìn)正在培養(yǎng)的細(xì)胞組織中，這時(shí)豬紅細(xì)胞周圍呈現(xiàn)出包圍狀態(tài)，此狀態(tài)由絕大多數(shù)的ASFV對(duì)紅細(xì)胞產(chǎn)生吸附所形成[4]。并不是所有的非洲豬瘟病毒株都會(huì)吸附紅細(xì)胞，也會(huì)有一部分被不會(huì)發(fā)生吸附反應(yīng)，如果在分離培養(yǎng)的組織中沒有出現(xiàn)吸附反應(yīng)而是產(chǎn)生了細(xì)胞裂變，這時(shí)就需免疫熒光和PCR技術(shù)對(duì)細(xì)胞檢測(cè)，確認(rèn)是否細(xì)胞被感染；還要注意在檢測(cè)過程中，運(yùn)用免疫熒光和 PCR 確認(rèn)為陰性需要傳代 3-5 次成陰性反應(yīng)才可以被認(rèn)可為陰性。

3.2 檢測(cè)步驟

檢測(cè)需設(shè)置對(duì)照，對(duì)照材料從動(dòng)物疫病防控中心獲取，將因生病致死的豬只的扁桃體和淋巴結(jié)部位取樣備用。

檢測(cè)可分為5個(gè)步驟，如下：

（1）引物的合成：需要合成特異性引物，此過程需運(yùn)用RT-PCR技術(shù)，并將擴(kuò)增片段設(shè)計(jì)為682 bp。

（2）樣品的制備：首先要對(duì)因病致死的豬只尸檢；其次要取出病豬的扁桃體和淋巴結(jié)部位以供檢測(cè)，注意采集時(shí)要在無菌環(huán)境下進(jìn)行；然后對(duì)取出的部位處理，先將其研磨后加生理鹽水稀釋；最后離心，離心條件為5000 r/s、5 min，取其上清液。

（3）將病毒基因組中的總RNA提取出來：此操作要按照試劑盒說明進(jìn)行，將上層清液與SolutionR1混合，兩者量均為100 μl，混合后充分振蕩，時(shí)間30 s，在室溫中保存60 s；處理后加入SolutionR2 600 μl并搖勻，放在室溫下3～5 min；完成后，加入制備的上層清液并移至離心管內(nèi)，離心30 s；將離心后的液體與Wash Buffer混合，再離心30 s，結(jié)束后將液體洗滌2次；在10000 r/min的條件下將空柱離心1 min，再轉(zhuǎn)到新的離心管中；獲得的新離心管需加入Spin column，再將Elution Buffer添加到膜中央，含量為20～50 μl，在室溫放置60 s后離心30 s可得到RNA，該RNA耐低溫，可保存在-70℃下，也可進(jìn)行擴(kuò)增處理。

（4）將RNA進(jìn)行擴(kuò)增處理：擴(kuò)增需使用總RNA為模板進(jìn)行，在45℃的溫度下，將上下游引物反轉(zhuǎn)錄30 min后，溫度升至94℃，預(yù)變5 min，變性30 s后，將溫度降至52℃，退火；在72℃的溫度下延伸45 s，完成35次循環(huán)操作。

（5）使用熒光法進(jìn)行定量擴(kuò)增：仍采用總RNA作為擴(kuò)增模板，使用上下游引物、探針、Passive Reference Dye、RNA模板，前三者均加0.4 μl，RNA模板需加1 μl，并加入RNase-free Water，達(dá)到20 μl；將擴(kuò)增程序設(shè)置在45℃，反轉(zhuǎn)錄25 min，溫度達(dá)到95℃時(shí)，預(yù)變2 min，變性10 s，溫度在55℃時(shí)，退火；溫度在72℃時(shí)延伸30 s，進(jìn)行5個(gè)重復(fù)循環(huán)；最后在95℃的溫度下變性10 s，退火在55℃時(shí)進(jìn)行，完成40個(gè)循環(huán)操作就可以收集熒光。

3.3 檢測(cè)結(jié)果

3.3.1 判定標(biāo)準(zhǔn)

判定依據(jù)以檢測(cè)Ct值為標(biāo)準(zhǔn)。判定為陽性樣品：Ct35，其擴(kuò)增曲線呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。陰性或陽性樣品：35≤Ct≤40時(shí)要進(jìn)行多次檢驗(yàn)，若檢驗(yàn)后，Ct 值仍然處于這一范圍，擴(kuò)增曲線出現(xiàn)指數(shù)增長(zhǎng)期，可以判斷為陽性，反之樣本為陰性。

判定為陰性樣品：Ct值不出現(xiàn)；Ct40。

3.3.2 擴(kuò)增結(jié)果

提取樣本總RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增處理，使用1%瓊脂糖凝膠對(duì)產(chǎn)物電泳，對(duì)照陽性片段。在682 bp附近，樣品有帶則可以確定樣本為豬瘟病毒陽性[5]。

4 結(jié)語

RT-PCR技術(shù)是一種成熟的檢測(cè)方法，檢測(cè)非洲豬瘟病效果好。