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    我國(guó)部分地區(qū)Sicinivirus 流行病學(xué)調(diào)查

    2022-12-12 01:05:58王楷宬姜利建陳海燕王素春莊青葉肖志宇趙成龍黃禹豐李金積崔成都孫福亮徐太輝
    中國(guó)動(dòng)物檢疫 2022年2期
    關(guān)鍵詞:活禽屠宰場(chǎng)宿主

    王楷宬,姜利建,陳海燕,王素春,莊青葉,5,姜 楠,肖志宇,趙成龍,黃禹豐,李金積,崔成都,孫福亮,徐太輝

    (1.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病中心,山東青島 266032;2.青島易邦生物工程有限公司,動(dòng)物基因工程疫苗國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東青島 266114;3.延邊大學(xué),吉林延吉 133003;4.河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,河南洛陽(yáng) 471023;5.山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,山東濰坊 261061)

    Sicinivirus 是一種禽類新發(fā)病毒,為單股正向RNA 病毒[1]。在國(guó)際病毒學(xué)分類委員會(huì)第十次病毒分類報(bào)告(2017 年)中,Sicinivirus 被分類為微RNA 病毒科的一個(gè)新屬,目前僅有1 個(gè)“種”(species),即Sicinivirus A。根據(jù)基因序列將其分為5 個(gè)基因型,Sicinivirus A1—A5,縮寫為siv-A1—A5。

    目前Sicinivirus 的致病性和致病機(jī)理尚不清楚。有研究認(rèn)為其可能是腸道中一種常在病毒,也有研究推測(cè)該病毒可能和其他腸道病毒共感染導(dǎo)致并發(fā)癥,可能與雞的發(fā)育遲緩綜合征(RSS)、腹瀉和吸收不良綜合征(MAS)有關(guān)。肉雞傳染性發(fā)育遲緩綜合征(infectious stunting syndrome,ISS)早在1949 年就有報(bào)道,20 世紀(jì)70 年代后期呈全球性發(fā)生,波及許多國(guó)家和地區(qū),臨床研究以及人工感染試驗(yàn)均證實(shí)該病具有傳染性[2]。

    2014 年,Sicinivirus 在愛(ài)爾蘭首次被發(fā)現(xiàn),現(xiàn)世界各地都有檢出該病毒的報(bào)道,如愛(ài)爾蘭、中國(guó)、英國(guó)、匈牙利、巴西都檢測(cè)到了該病毒。Bullman等[1]對(duì)愛(ài)爾蘭一家商品雞肉加工場(chǎng)采集的30 份雞泄殖腔樣品進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)Sicinivirus 陽(yáng)性率為73%。Zhou 等[3]對(duì)江蘇省鹽城市的商品雞場(chǎng)進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)3 個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)的17 份雞糞便樣品均為Sicinivirus 陽(yáng)性,雖然樣品量較少,但如此高的陽(yáng)性率表明該地區(qū)商品雞場(chǎng)中可能存在廣泛的感染。此外,利用高通量測(cè)序技術(shù),在中國(guó)香港、英國(guó)、匈牙利和巴西的雞中也檢到了該病毒[4-7]。

    目前,Sicinivirus 的研究還處于初級(jí)階段,僅部分國(guó)家進(jìn)行了該病毒檢測(cè),研究數(shù)據(jù)極為有限。該病毒在我國(guó)的流行情況尚不明晰。本研究對(duì)我國(guó)部分地區(qū)進(jìn)行了Sicinivirus 流行病學(xué)調(diào)查,并分析了其感染率與地域、宿主、場(chǎng)戶類型之間的關(guān)系。

    1 材料與方法

    1.1 樣品采集

    2019年下半年,分別在江蘇、廣西、河北、安徽、廣東、上海、湖北和江西等8 個(gè)?。ㄗ灾螀^(qū)、直轄市),隨機(jī)選擇25 個(gè)場(chǎng)點(diǎn),采集240 份家禽咽喉/泄殖腔雙拭子樣品,將同一只家禽的泄殖腔拭子和咽喉拭子合并作為1 份樣品保存。共采集1 920 份樣品,其中雞、鴨、鵝、鴿、鷓鴣的咽喉/泄殖腔雙拭子樣品分別為1 221、419、40、235 和5 份。采樣場(chǎng)點(diǎn)涉及15 個(gè)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)、7 個(gè)批發(fā)市場(chǎng)、1 個(gè)屠宰場(chǎng)和2 個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)。

    咽喉/泄殖腔雙拭子樣品放置在裝有PBS-甘油采樣液的離心管中,將存有樣品的離心管置于管架并編號(hào),保持直立狀態(tài)置于放有冰袋的泡沫保溫盒中運(yùn)輸,-80 ℃保存。

    1.2 主要試劑

    QIAxtractor 高通量核酸提取儀(cador Pathogen 96 QIA cube HT kit),購(gòu)自德國(guó)Qiagen公 司;PathAmp FluA Reagent Kit、Ion Xpress Plus Fragment Library Kit、Ion PGM Template OT2 200 Kit、Ion PGM Sequencing 200 Kit V2、E-Gel SizeSelect 2% Agarose、Ion 318 Chip Kit V2、Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Beads、Ion Xpress Batcode Aaptors、Qubit 核酸濃度測(cè)定儀配套試劑,均購(gòu)自Life technologies 公司。

    1.3 引物合成

    檢測(cè)引物參考Zhou 等[3]擴(kuò)增Sicinivirus 編碼3D 蛋白保守區(qū)cDNA 所設(shè)計(jì)的1 對(duì)引物S8F 和S8R,用于擴(kuò)增652 bp 的3D基因片段。上游引物:5′-GCTCTATTTCTCGCGTTGCAAT;下游引物:5'-GCCTCCCTTCATGATGTACCAC。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成。

    1.4 樣品PCR 檢測(cè)和測(cè)序鑒定

    取出-80 ℃保存的雙拭子,待解凍后,室溫下10 000 r/min 離心5 min。每個(gè)樣品取200 μL 上清液加入96 孔加樣槽中,使用 QIAxtractor 高通量核酸提取儀及其配套試劑盒提取病毒RNA,將提取的核酸-80 ℃保存?zhèn)溆谩@肏iScript II One Step RT-PCR Kit 試劑盒,對(duì)提取的病毒RNA 進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增程序:50 ℃ 30 min;95 ℃2 min;95 ℃ 30 s,51 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s,40 個(gè)循環(huán);72 ℃ 5 min。

    PCR 產(chǎn)物經(jīng)電泳、純化回收后,由上海生工生物工程公司測(cè)序;利用 DNAstar 軟件中的Seqman 程序?qū)λ鶞y(cè)序列拼接,然后對(duì)拼接結(jié)果進(jìn)行BLAST 比對(duì),比對(duì)結(jié)果為Sicinivirus 的判為陽(yáng)性樣品。

    1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

    對(duì)PCR 檢測(cè)及測(cè)序結(jié)果,利用IBM SPSS Statistics 22 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn),以P=0.01 作為檢驗(yàn)水準(zhǔn),分析不同地區(qū)、不同宿主、不同場(chǎng)點(diǎn)的個(gè)體陽(yáng)性率。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同地區(qū)

    PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示:在25 個(gè)場(chǎng)點(diǎn)中13 個(gè)為陽(yáng)性,1 920 份樣品中,共檢出134 份為Sicinivirus陽(yáng)性,個(gè)體陽(yáng)性率為6.97%(134/1 920),其中河北、湖北、上海、廣東、江蘇、江西、廣西和安徽的個(gè)體陽(yáng)性率分別為24.16%(58/240)、10.83%(26/240)、5.83%(14/240)、5.41%(13/240)、4.16%(10/240)、2.50%(6/240)、1.66%(4/240)和1.25%(3/240),不同地區(qū)個(gè)體陽(yáng)性率差異顯著(df=7,χ2=121.800,P<0.01)。

    2.2 不同宿主

    在1 920 份樣品中,共檢出134 份陽(yáng)性樣品,其中132 份的宿主為雞、1 份為鵝、1 份為鴿,鴨和鷓鴣中未檢測(cè)到Sicinivirus,雞、鵝和鴿的個(gè)體陽(yáng)性率分別為10.81%(132/1 221)、2.44%(1/41)和0.42%(1/235),表明雞為Sicinivirus 的主要易感宿主(P<0.01)。

    2.3 不同養(yǎng)殖類型

    不同養(yǎng)殖類型檢測(cè)結(jié)果顯示,農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)、批發(fā)市場(chǎng)和屠宰場(chǎng)的個(gè)體陽(yáng)性率分別為3.00%(18/600)、6.23%(58/930)和24.16%(58/240),在150 份養(yǎng)殖場(chǎng)采集的樣品中沒(méi)有檢出Sicinivirus。不同場(chǎng)點(diǎn)類型陽(yáng)性率之間的差異任意期望頻率均大于5,采用Pearson 卡方檢驗(yàn),顯示不同類型場(chǎng)點(diǎn)的陽(yáng)性率差異顯著(df=4,χ2=138.169,P<0.01),屠宰場(chǎng)為最易感場(chǎng)點(diǎn)。

    3 討論

    本研究首次在我國(guó)開(kāi)展Sicinivirus 流行病學(xué)調(diào)查。本研究采取的方法為配額抽樣的非隨機(jī)抽樣方法,可能會(huì)出現(xiàn)選擇性偏倚和一定的局限。從1 920 份樣品中檢出陽(yáng)性樣品134 份,個(gè)體總陽(yáng)性率為6.97%(134/1 920),場(chǎng)點(diǎn)總陽(yáng)性率為52.00%(13/25),所有被調(diào)查的?。ㄗ灾螀^(qū)、直轄市)都檢測(cè)到了Sicinivirus,說(shuō)明該病毒分布較為廣泛。不同地區(qū)陽(yáng)性率差異顯著,河北、湖北的陽(yáng)性率較高,廣東、上海、江蘇其次,而安徽、廣西、江西較低。河北、湖北的所有場(chǎng)點(diǎn)均檢測(cè)到Sicinivirus,是因?yàn)楹颖本鶠橥涝讏?chǎng)采集的雞拭子,湖北均為批發(fā)市場(chǎng)采集的雞拭子和鴨拭子,所以這兩個(gè)地區(qū)的陽(yáng)性率較高可能與宿主、場(chǎng)點(diǎn)類型的不同有一定關(guān)系。

    從宿主分析結(jié)果來(lái)看,雞的陽(yáng)性樣品數(shù)占總陽(yáng)性樣品的98.50%(132/134),雞群的個(gè)體陽(yáng)性率為10.81%(134/1 221)遠(yuǎn)高于其他宿主,而鵝和鴿的陽(yáng)性率分別為2.44%(1/41)和0.42%(1/235),不同宿主陽(yáng)性率差異顯著。之前的研究還未發(fā)現(xiàn)該病毒可以感染除雞之外的其他宿主。本研究表明,雞依然是最主要的易感宿主,而鵝和鴿也是宿主之一。下一步將對(duì)能夠感染鵝和鴿的病毒株進(jìn)行基因分析。

    從場(chǎng)點(diǎn)類型來(lái)看,不同類型場(chǎng)點(diǎn)陽(yáng)性率差異顯著,表明家禽養(yǎng)殖環(huán)境與該病毒的感染有較大關(guān)系。在采集樣品的4 種場(chǎng)點(diǎn)中,屠宰場(chǎng)陽(yáng)性率最高,其次是批發(fā)市場(chǎng)和農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)(統(tǒng)稱活禽市場(chǎng)),而養(yǎng)殖場(chǎng)未檢測(cè)到Sicinivirus?;钋菔袌?chǎng)的禽流動(dòng)性高,且相對(duì)于養(yǎng)殖場(chǎng),衛(wèi)生條件較差,表明病毒在禽間的水平傳播較為嚴(yán)重,間接接觸也可導(dǎo)致病毒傳播。本研究采集樣品的養(yǎng)殖場(chǎng)均為規(guī)?;B(yǎng)殖場(chǎng),其飼養(yǎng)環(huán)境較好,食物、飲水供應(yīng)以及糞便處理流程規(guī)范,活禽一直處于與外界相對(duì)隔離的狀態(tài);活禽市場(chǎng)的禽在運(yùn)輸過(guò)程中往往會(huì)產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng),導(dǎo)致免疫力下降,更易感染病毒,活禽市場(chǎng)以及運(yùn)輸工具消毒不及時(shí),也會(huì)導(dǎo)致健康禽受到感染,活禽集中生活在狹小籠子中也會(huì)導(dǎo)致病毒交叉感染;屠宰場(chǎng)陽(yáng)性率最高,與屠宰場(chǎng)衛(wèi)生條件較差、缺乏消毒等防疫管理措施以及環(huán)境污染等因素有關(guān)。本研究未對(duì)散養(yǎng)戶進(jìn)行調(diào)查,因而散養(yǎng)戶的Sicinivirus感染情況有待進(jìn)一步研究。

    根據(jù)此次流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果,建議加強(qiáng)屠宰場(chǎng)和活禽市場(chǎng)的衛(wèi)生管理,對(duì)運(yùn)送活禽的車輛及時(shí)消毒,減少禽類的間接性接觸,屠宰場(chǎng)在進(jìn)行集中屠宰的同時(shí)也要注意不同來(lái)源養(yǎng)殖場(chǎng)禽類的相互隔離。這些措施能在一定程度上阻斷病毒的傳播。

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