青藏高原鹽湖土壤菌株分離及其抗菌活性初步評價

＊郭歡歡 胡運琪 聞穎 馬曉莉 南澤東 江志波

（北方民族大學 化學與化學工程學院 寧夏 750021）

隨著生物化學、微生物學和有機化學基礎理論發(fā)展以及生物技術的進步，20世紀40年代起，人們開啟科學抗生素的黃金時代，抗生素的發(fā)展歷史揭開了嶄新的一頁[1]。從青霉素、鏈霉素作為臨床使用，到后來金霉素、氯霉素、土霉素、制霉菌素、紅霉素、卡那霉素、頭孢菌素等的問世及臨床，使當時的細菌性疾病與立克次氏體病感染治愈率升高。然而20世紀80年代以來，獲準上市的新抗生素數(shù)量在持續(xù)的下降[2]。簡單途徑獲得的微生物資源，在過去的半個世紀里，已經(jīng)被大量發(fā)掘和多次重復分析，新活性抗生素發(fā)掘困難，導致許多大型藥企紛紛放棄微生物來源的抗生素研發(fā)[3-5]。

近年來人們將研究目標轉(zhuǎn)向從未被開采的特殊生境微生物資源[6-11]。我國有較多沙漠、洞穴、海洋、鹽堿地等特殊環(huán)境，蘊含微生物資源豐富，從特殊生境微生物的次級代謝產(chǎn)物中尋找結(jié)構新穎的活性化合物成為抗耐藥菌藥物研發(fā)的重要途徑之一。例如，從特殊生境中發(fā)現(xiàn)的微生物枯草芽孢桿菌中分離得到的和田霉素系列化合物具有很強的抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MASA）活性[12]；從西藏芽孢桿菌分離得到的Amicoumacin類化合物，對表皮葡萄球菌和金黃色葡萄球菌具有較強的抑制活性[13]；從塔克拉瑪干沙漠沙生植物中分離到的菌株中產(chǎn)生的薔薇霉素具有廣譜抗菌活性[14]。

青海省柴達木盆地是一個被昆侖山、阿爾金山、祁連山等山脈環(huán)抱的封閉式盆地，盆地整體形狀大概呈三角形，面積約24萬平方千米，是中國三大內(nèi)陸盆地之一。柴達木盆地屬于高原大陸型氣候，干旱是主要特點。年降水量由盆地東南部至西北部遞減，年相對濕度為30%～40%，最小可低于5%。干旱荒漠是整個盆地的主要自然景觀，主要土類有鹽化荒漠土和石膏荒漠土和鹽湖。高鹽環(huán)境下微生物為了適應環(huán)境會分泌一些鹽轉(zhuǎn)運物質(zhì)以保持胞內(nèi)電解質(zhì)平衡。因此，柴達木盆地微生物結(jié)構和種類與中性溫和環(huán)境中可能不相同。

本文以采集于大柴旦木湖四份鹽湖土壤為研究對象，借助于微生物分離和培養(yǎng)方法，獲得了38株微生物，包括25株真菌和13株放線菌。利用乙酸乙酯萃取或者固相色譜萃取法，提取上述菌株的發(fā)酵產(chǎn)物，并在金黃色葡萄球菌模型上評價抗菌活性，發(fā)現(xiàn)7株菌株代謝產(chǎn)物對金黃色葡萄球菌具有不同程度的生長抑制作用。

1.實驗材料與方法

(1)材料

①儀器、藥品與試劑

A.儀器

SHKTYQ電熱恒溫培養(yǎng)箱（5～60℃）：山東濰坊生物儀器有限公司；HZQ-F恒溫振蕩培養(yǎng)箱（5～60℃），DL-CJ-1ND超凈工作臺（100級@≥0.5μm）：哈爾濱東聯(lián)儀器廠；低溫冰箱（-50～-86℃）：SANYO，MDF-382E(N)（日本）；高壓滅菌鍋（105～136℃）：SANYO，Antoclave MLS-3250（日本）。

B.藥品和溶劑

乙酸乙酯（AR）、甲醇（AR）等化學試劑由國藥集團提供；葡萄糖（BR）、瓊脂（BR）、硫酸鎂（AR）、磷酸氫二鉀（AR）、重鉻酸鉀（AR）、青霉素（BR）、鏈霉素（BR）、結(jié)晶紫溶液（BR）（0.05%）等購置于Sigma公司。TRYPONE（BR）、酵母浸膏（BR）等購自于上海恒遠生物科技廠。上述藥品及試劑無特殊說明均為AR級。

②土壤樣本采集

A.土壤樣本，2019年08月采集于青海省海西蒙古藏族自治州大柴旦鎮(zhèn)大柴旦木湖湖邊（東經(jīng)96°23′22.2″；北緯37°35′34.9″，海拔3387.3m），采集地表下40～60cm深土壤。

③培養(yǎng)基

本實驗使用的培養(yǎng)基包括：高氏l號培養(yǎng)基[9]，馬鈴薯培養(yǎng)基[9]，馬丁培養(yǎng)基[10]，MH肉湯培養(yǎng)基[9]，Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基[9]。

(2)實驗方法

①樣品采集地點和采集方法

采用5點采集法，取地面下40～60cm深度的土壤。將土壤樣品上下均勻混合后裝入無菌信封，標注采樣信息，所有樣品低溫保存。

②樣品處理

A.土壤樣品處理超凈臺中，取四份土壤樣品各10g，加入90mL無菌LB液體培養(yǎng)基，混合均勻。依次稀釋至0.01g/mL和0.001g/mL。

B.菌株生長取兩種質(zhì)量濃度懸濁液200μL涂布在固體平板上。靜置半小時后，倒置于恒溫培養(yǎng)箱中，28℃進行培養(yǎng)。馬鈴薯培養(yǎng)基15～20天，高氏一號培養(yǎng)基5～7天，期間觀察菌落生長情況。

③菌株分離

用無菌竹簽挑取單菌落，固體培養(yǎng)基“Z”劃線培養(yǎng)。放線菌使用高氏一號培養(yǎng)基；真菌使用馬丁培養(yǎng)基，重復3次，直至菌落在顯微鏡下觀察無異性菌。

④菌株保存

確定為單一菌落的菌株利用無菌竹簽接種至斜面培養(yǎng)基，正常生長至生長期，4℃冰箱保存；對于產(chǎn)孢放線菌使用20%甘油洗滌孢子，低溫冰箱中保存；產(chǎn)孢真菌使用50%甘油洗滌孢子，保存于低溫冰箱中。

A.光學顯微鏡鏡檢

超凈臺中，將滅菌的蓋玻片45°斜插入各個培養(yǎng)基中，每個培養(yǎng)基插入3～5片，放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2天，根據(jù)菌株生長情況取蓋玻片進行顯微鏡觀察，保存菌絲體清晰的圖片，并記錄。

B.電子顯微鏡成像

將導電膠于超凈臺中紫外燈照射滅菌，用無菌牙簽挑取單菌落，將單菌落均勻涂抹在導電膠上。蔡司掃描電子顯微鏡（EVO MA 10/LS 10型）觀察視野中完整菌株，分別獲取×50，×200和×2000倍圖像。以圖片編輯工具給出菌株的直徑（或長、寬），記錄菌株的形態(tài)。

⑤活性評價方法

A.樣品制備

固體發(fā)酵瓊脂塊搗碎，乙酸乙酯超聲萃取三次，每次20mL。合并有機溶劑，減壓蒸餾回收有機溶劑。殘留物以2mL甲醇溶解，作為待測液。

液體搖瓶發(fā)酵液10mL，上樣至固相萃取色譜柱中，以10mL蒸餾水洗滌后，依次使用2mL的50%和95%甲醇水溶液洗滌，減壓干燥，樣品存放于玻璃瓶中，于4℃下保存。

B.活性測試方法

直徑6mm的加厚濾紙上滴加200μL樣品，自然風干（2h），并平鋪于檢定菌（金黃色葡萄球菌）的平板上。金黃色葡萄球菌檢定板于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～24h。觀察樣品的抑菌情況。

2.結(jié)果

(1)菌株分離與培養(yǎng)

大柴旦木鹽湖位于柴達木盆地北部，含有豐富的無機礦石，屬硫酸鹽型鹽湖，富含鉀、鋰，尤以蘊藏固體硼礦資源聞名于世，該地區(qū)土壤微生物分離工作還未見報道。本文利用放線菌和真菌培養(yǎng)方法，從四份鹽湖土壤樣品中共發(fā)現(xiàn)了38株菌株，其中真菌25株，放線菌13株（圖1）。

圖1 代表性菌株生長圖片

真菌菌落寬大，直徑普遍大于20mm，最大菌落達90mm。通常三個菌落成簇出現(xiàn)，菌落突起，有些菌落表面有水珠，邊緣清晰或不規(guī)則。有氣生菌絲，顏色各不相同，淡黃色居多。其中菌株1有明顯的同心環(huán)，基底有灰色分泌物，而菌株22中心具有黑色素分泌，邊緣菌絲體顯淡粉色。放線菌菌落直徑明顯小于真菌，2～15mm，多數(shù)小于10mm。放線菌菌落表面平坦，較集中，采用劃線法接種時菌落沿劃線分布，通常有黃色水溶性分泌物產(chǎn)生。

(2)抑菌活性評價

利用平板牛津杯法檢測抗菌活性。結(jié)果顯示2株真菌和4株放線菌發(fā)酵產(chǎn)物具有不同程度抑制金黃色葡萄球菌生長作用。提示這些菌株可能具有發(fā)掘新抗生素的潛力。

3.討論

柴達木盆地屬于干旱的內(nèi)陸型高原盆地，位于我國西北部，是中國四大盆地中地勢最高的盆地，海拔在2600～3000m之間，屬于高原大陸型氣候，以極其豐富多樣的礦產(chǎn)資源而聞名于世，因為其特殊的地理位置、地質(zhì)原因和氣候原因,鹽漬化是柴達木盆地的主要特征。高原地帶由于常年高蒸發(fā)量和低降雨量，產(chǎn)生了大量的鹽湖。其中大柴旦木湖荒漠干旱、極干旱氣候，年均氣溫1.6℃，年降水量80.8mm，年蒸發(fā)量2031.8mm。據(jù)調(diào)查，湖水礦化度343.89g/L，陽離子Na+、K+、Mg2+含量分別為98216mg/L、6243.7mg/L、17873mg/L，陰離子Cl-、SO42-含量分別為183018mg/L、35869mg/L；Li、B2O3、Br含量分別為275mg/L、71.7mg/L、71.7mg/L，屬于典型的礦物質(zhì)鹽湖。長期以來人們對大柴旦木湖礦物質(zhì)的研究進行了大量的工作，但是對其中微生物多樣性研究尚未見報道。本文對大柴旦木湖四份鹽湖土壤樣品中的放線菌菌株和真菌進行了分離并對其抑菌活性進行的測定和評價，這種極端的環(huán)境下生存的微生物是發(fā)現(xiàn)新結(jié)構天然產(chǎn)物的潛在資源。

4.結(jié)論

本文通過設定真菌和放線菌分離和培養(yǎng)方法，對采集于青海省大柴旦木湖鹽湖土壤微生物進行了系統(tǒng)分離，從中獲得了38株菌株，其中真菌25株，放線菌13株。利用牛津杯法對菌株進行了抑菌活性評價，發(fā)現(xiàn)2株真菌和5株放線菌的代謝產(chǎn)物具有明顯的抑制金黃色葡萄球菌生長的活性。本文的工作對研究高原鹽湖生物多樣性和發(fā)掘新型抗生素奠定了基礎。

5.致謝

本文致謝寧夏醫(yī)科大學藥學院吳秀麗教授及其課題組在樣品采集方面提供的幫助。