RP-HPLC法測定大果山楂果實中四種氨基酸的含量

祁佳佳，楊嘉怡，范亞夢，李典鵬，王先友*

(1.河南大學(xué) 藥學(xué)院,河南 開封 475004； 2.廣西植物功能物質(zhì)研究與利用重點實驗室，廣西 桂林 541006)

大果山楂為薔薇科蘋果亞科蘋果屬植物臺灣林檎[Malusdoumeri(Bois)Chev.]和光萼林檎(MalusleiocalycaS.Z.Huang)的成熟果實[1],主要來源于臺灣林檎,它又名烏嬋子(廣西苗語)、麻缺頓、撒多、廣山楂(商品名)等。主要分布于云南富寧、西疇和廣西德保、靖西、那坡，廣西東蘭及天峨也有少量引種[2]。大果山楂性味甘、酸、澀、味溫，與我國傳統(tǒng)中藥山楂(北山楂)有相似的成分和功效[3]，富含營養(yǎng)，包括豐富的氨基酸、維生素、鞣質(zhì)、多酚、微量元素、黃酮類、熊果酸和單寧等[4]。具有理氣健脾、消食導(dǎo)滯、預(yù)防腫瘤、降壓、抑菌、抑制自由基、抗氧化和提高免疫力等保健功效。其果皮青黃色，果肉白色，肉質(zhì)細嫩，果實大且肉厚，氣味清香。鮮食酸澀，現(xiàn)主要被加工成山楂粉、干片、果脯、醋、山楂酒、茶等系列食品[3]。氨基酸是蛋白質(zhì)的基本組成單位，是人體不可缺少的物質(zhì)。由蛋白質(zhì)水解所得到的α-氨基酸共有20多種[5]，α-氨基酸一般能溶于酸性或堿性水溶液中，但難溶于極性小的有機溶劑。因此采用合適的方法完全提取氨基酸，對后續(xù)含量測定很重要。

大果山楂富含氨基酸、黃酮類和三萜類等藥物成分，具有降壓和顯著擴張血管的作用，能增加心肌收縮力、抗心律不齊、降低甘油三酯和膽固醇[6-7]。目前對大果山楂的活性成分和藥理作用、工藝研究等方向研究較多[8-9]，對大果山楂氨基酸含量測定較少。因此，本實驗對大果山楂中苯丙氨酸、酪氨酸、組氨酸和亮氨酸的含量進行分析研究，為大果山楂的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器、試劑及材料

1.1 儀器

HPLC色譜儀(日本島津，LC-20A)；紫外檢測器(日本島津，SPD-20A)；色譜柱(Agilent公司，Eclipse XDB-C18，4.6 mm×250 mm，5 μm)；電子分析天平(ESJ200-4B，沈陽龍騰電子有限公司)。

1.2 試劑

苯丙氨酸，組氨酸，酪氨酸，亮氨酸(含量98%，供含量測定用，阿拉丁)。甲醇(色譜純，科密歐)，其余試劑均為分析純。

1.3 材料

大果山楂果實采自廣西靖西,經(jīng)廣西植物所李典鵬研究員鑒定為蘋果屬大果山楂[Malusdoumeri(Bois)Chev.]的果實，干燥后粉碎，過40目篩。

2 方法與結(jié)果2.1 溶液的配制2.1.1 對照品儲備溶液

精密稱取苯丙氨酸、組氨酸、酪氨酸對照品各約0.01 g，亮氨酸0.02 g分別置于4個10 mL量瓶中，均用蒸餾水定容，搖勻，得對照品儲備液。

2.1.2 供試品溶液

在確定氨基酸的提取條件時，參考了多篇關(guān)于氨基酸含量測定條件篩選的文獻[10-16]。最終確定條件為：精密稱取大果山楂干燥粉末約1 g，置于250 mL燒瓶內(nèi)，加7 mol/L鹽酸溶液50 mL，回流提取6 h，冷卻至室溫，抽濾，濾液減壓濃縮至干燥，揮去HCl[16]，使溶液pH>3。用蒸餾水定容至10 mL，搖勻，即得生藥為100 g /L的樣品溶液。微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2 色譜條件

色譜柱：Eclipse XDB-C18(4.6 mm × 250 mm，5 μm),室溫；流動相為甲醇∶水(體積比為3∶97)，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH至4.0，流速1.0 mL/min；進樣量10 μL；檢測波長：205 nm。

2.3 方法學(xué)考察2.3.1 系統(tǒng)精密度試驗

分別用一定濃度的各氨基酸對照品溶液，按照“2.2色譜條件”重復(fù)進樣6次，測得酪氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、組氨酸峰面積的RSD分別為1.6%、1.1%、0.1%和1.6%，結(jié)果表明系統(tǒng)精密度較好。

2.3.2 重復(fù)性試驗

按照“2.1.2”項下內(nèi)容操作，平行6份。以“2.2”中的色譜條件檢測，測得酪氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、組氨酸含量的RSD分別為1.7%、1.4%、1.3%、1.7%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗

按照“2.2”色譜條件，得到實驗結(jié)果如下：供試品溶液中組氨酸、酪氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸的理論塔板數(shù)均≥2 600，分離度均>1.5，實驗結(jié)果表明系統(tǒng)適用性良好，可用于檢測。色譜圖如圖1和2所示。

圖1 大果山楂對照品的色譜圖

圖2 大果山楂供試品的色譜圖

2.3.4 線性范圍考察

將“2.1.1”中配制好的各有機酸對照品儲備液進行稀釋，得到濃度如下的各溶液：酪氨酸：0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00 g/L；亮氨酸：0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00 g/L；苯丙氨酸溶液：0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 g/L；組氨酸：0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 g/L。按照“2.2”項下色譜條件檢測，以峰面積為縱坐標(Y)，濃度為橫坐標(X)，得回歸分析方程、相關(guān)系數(shù)以及線性范圍，結(jié)果見表1。

表1 回歸方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)

2.3.5 回收率試驗

稱取6份已知各成分含量的大果山楂樣品適量，分別精密加入適量的各氨基酸對照品，按照“2.1.2”中的方法操作，按照“2.2”中的色譜條件進行檢測。各成分的加樣回收率見表2。

表2 回收率結(jié)果(n=6)

2.4 樣品含量測定

按照上述條件進行測定，以外標對照法計算，各種氨基酸的含量結(jié)果見表3。

表3 氨基酸的含量

3 討論

目前，大多數(shù)文獻報道氨基酸的提取采用超聲醇提[12]、水提[12-13]和酸提[14-15,17]。按照朱福灼等用75%乙醇溶液冷凝回流提取2 h實驗[12],結(jié)果出峰效果不好。參考許慧等對鹿茸藥材中14種氨基酸的含量測定的研究[14]及蘇雅拉圖等人對蓖麻餅粕提取氨基酸及酸水解法優(yōu)化初探的實驗結(jié)果[15]，結(jié)合本產(chǎn)品特征和儀器性能建立了大果山楂中氨基酸的提取方法。然而據(jù)目前的文獻報道，山楂中的酪氨酸含量大于亮氨酸的含量[9-10]，本實驗所得結(jié)果與之相反。是否由于提取方法不同，或是生長環(huán)境和品種不同所致，尚待進一步研究。

4 結(jié)論

本實驗建立了大果山楂中氨基酸提取方法：采用7 mol/L鹽酸冷凝回流6 h提取大果山楂中的氨基酸；采用靈敏度和準確度較好的高效液相色譜法測定了大果山楂中氨基酸的含量。研究結(jié)果表明，色譜條件簡單易行，儀器精密度和回收率高，重現(xiàn)性好，表明此實驗方法可行。