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      非洲豬瘟病毒拮抗宿主抗病毒免疫分子機(jī)制研究進(jìn)展

      2022-12-09 10:07:16時(shí)夢晗胡永新張友明吳曉東曹晶晶
      中國動(dòng)物檢疫 2022年12期
      關(guān)鍵詞:宿主編碼通路

      時(shí)夢晗,胡永新,張友明,吳曉東,曹晶晶

      (1.山東大學(xué)微生物技術(shù)研究院,微生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東青島 266237;2.中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心,山東青島 266032)

      非洲豬瘟(African swine fever,ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的一種高度接觸性傳染病,急性ASF 致死率可高達(dá)100%。1921 年ASF 首次被發(fā)現(xiàn)于肯尼亞,到目前為止,已有68 個(gè)國家發(fā)生該病[1]。其中,我國作為世界上最大的豬肉生產(chǎn)國和消費(fèi)國受其影響尤為嚴(yán)重[2]。充分了解ASFV 的致病機(jī)制有助于設(shè)計(jì)有效的疫苗進(jìn)行疾病防控[3]。

      ASFV 是一種核質(zhì)巨D(zhuǎn)NA 病毒,也是目前唯一的蟲媒DNA 病毒[4],其宿主包括家豬、野豬和軟蜱[5]。ASFV 顆粒是一個(gè)多層的二十面體結(jié)構(gòu),直徑為260~300 nm,病毒基因組為雙股線狀DNA,其中央保守區(qū)長約125 kb,兩端為可變區(qū)[6]。ASFV 基因組編碼的蛋白復(fù)雜多樣,目前已知的有150 多種編碼蛋白且部分蛋白的功能已被鑒定,這些蛋白參與病毒粒子結(jié)構(gòu)組成、基因組轉(zhuǎn)錄復(fù)制和翻譯、病毒入侵和細(xì)胞免疫功能調(diào)控等[7]。由此可見ASFV 基因組十分龐大且編碼蛋白復(fù)雜多樣。ASFV 主要感染單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng),通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用或巨胞飲作用完成入侵過程[8],進(jìn)一步完成復(fù)制、組裝和子代病毒顆粒的釋放。

      在感染過程中,為抵御病毒攻擊,細(xì)胞的免疫系統(tǒng)被激活,同時(shí),為促進(jìn)自身的存活和復(fù)制,病毒進(jìn)化出逃避或抑制宿主免疫反應(yīng)的機(jī)制[9]。ASFV 編碼多種免疫逃逸蛋白以拮抗宿主免疫反應(yīng),按參與的細(xì)胞反應(yīng)事件可分為4 類,包括調(diào)控宿主細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)及細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄的蛋白(pA238L)、抑制I 型干擾素(IFN-I)信號(hào)通路的蛋白(pMGF360,pMGF505,pI329L)、調(diào)控細(xì)胞程序性死亡的蛋白(p54、pA179L、pA224L和pEP153R)以及其他免疫抑制蛋白(CD2v、pL83L)[4],以上蛋白拮抗宿主抗病毒免疫反應(yīng)事件既相互獨(dú)立又協(xié)同合作,共同構(gòu)建拮抗宿主免疫反應(yīng)的分子網(wǎng)絡(luò)。本文對ASFV 的結(jié)構(gòu)和生命周期進(jìn)行簡要介紹,并對病毒編碼蛋白逃避宿主免疫應(yīng)答反應(yīng)的分子機(jī)制進(jìn)行詳細(xì)歸納,為未來ASFV致病機(jī)制研究和疫苗研發(fā)提供參考。

      1 ASFV 基因組和粒子結(jié)構(gòu)

      ASFV 粒子呈二十面體,基因組長為170~190 kb,包含150~167 個(gè)緊密排列的開放閱讀框,基因組包括中央保守區(qū)域和兩側(cè)的5 個(gè)多基因家族(multigene families,MGF),多基因家族的缺失或重復(fù)則導(dǎo)致了不同分離株基因組長度不同[10]。ASFV 呈多層結(jié)構(gòu),從外到內(nèi)依次是外包膜、衣殼、內(nèi)膜、核殼和類核[4,11]。

      病毒粒子的最外層為外包膜,是病毒出芽時(shí)從宿主細(xì)胞膜上獲得的結(jié)構(gòu)[12]。在病毒外包膜上能檢測到pEP402R(CD2v)蛋白存在。病毒外包膜的存在一方面能保護(hù)病毒粒子,另一方面使病毒入侵細(xì)胞和出芽過程復(fù)雜化,但外包膜的存在并不影響病毒的感染性[10]。

      病毒衣殼的功能主要是保護(hù)病毒核酸并參與病毒感染過程。ASFV 衣殼最大直徑為250 nm,呈一個(gè)六邊形的對稱立體結(jié)構(gòu)[13]。P72 是主要的病毒衣殼蛋白。有研究[10]表明,病毒二十面體衣殼主要由8 280 拷貝的p72 蛋白和其余少量衣殼蛋白(如pE120R 和pB438L 蛋白)組成,其中p72 約占病毒顆??傊亓康?2%。

      內(nèi)膜是由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分離出來的厚約70? 的脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)[14]。在ASFV 內(nèi)膜上存在p17、pE183L、p12、pE248R、pH108R 和pE199L 蛋白,其中p17 和pE183L 主要作用是幫助組裝病毒衣殼,p12、pE248R 和pE199L 則參與病毒入侵宿主細(xì)胞[4]。

      核殼是病毒的一個(gè)獨(dú)立結(jié)構(gòu)域,直徑為180 nm,主要由多聚蛋白前體pp220 和pp62組成[15]。pp220和pp62均含有多個(gè)蛋白酶水解位點(diǎn),其中,Gly-Gly-Xaa 位點(diǎn)可以被特異性的SUMO-1半胱氨酸蛋白酶pS273R 識(shí)別并切割,pp220 被水解成p5、p14、p34、p37 和p150,pp62 則被水解成p8、p15 和p35,水解后的蛋白為成熟蛋白,這一過程對于ASFV 粒子成熟和感染性具有重要意義[10]。pp220 與pp62 之間存在密切的交互應(yīng)答作用,pp62 的加工依賴于pp220 的表達(dá),而pp62 對pp220 的亞細(xì)胞定位有重要影響,pp62 和pp220缺失會(huì)影響病毒粒子類核發(fā)育狀態(tài),產(chǎn)生空核粒子[15-16]。

      ASFV 粒子核心部位是核殼包裹著的類核,其包含ASFV 基因組,編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白和與病毒復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和免疫抑制相關(guān)的非結(jié)構(gòu)蛋白。pA104R是存在于類核處的一種重要DNA 結(jié)合蛋白,對ASFV 基因的包裝和復(fù)制至關(guān)重要。pA104R 以14~16 nt/bp 的速率與單鏈DNA(ssDNA)和雙鏈DNA(dsDNA)結(jié)合,與ASFV 拓?fù)洚悩?gòu)酶II pP1192R 共存時(shí)顯現(xiàn)出DNA 超卷曲活性。由于pA104R 在ASFV 復(fù)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用,因此它是目前對抗ASFV 感染的一個(gè)重要靶點(diǎn)[10]。

      2 ASFV 的生命周期

      2.1 吸附和入侵

      內(nèi)吞作用是許多病毒用來通過細(xì)胞膜物理屏障進(jìn)入細(xì)胞的一種方式。病毒內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞依賴于特定的細(xì)胞信號(hào)通路激活,并由病毒和細(xì)胞相互作用所驅(qū)動(dòng)[17]。早期研究表明,ASFV 入侵宿主細(xì)胞依賴于低pH、溫度、能量和膽固醇[18],并且由于ASFV 對細(xì)胞具有趨向性,因此認(rèn)為巨噬細(xì)胞的某些受體(CD163、CD45、MHC-II 等)可能介導(dǎo)了病毒入侵這一過程。然而,基因敲除豬的感染試驗(yàn)結(jié)果[19]表明,CD163 對于ASFV 感染并非是必需的,還有其他未明確的特異性受體蛋白參與這一過程。

      近些年的研究[20]主要認(rèn)為,ASFV 通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用(clathrin-dependent endocytosis,CME)和巨胞飲作用進(jìn)行內(nèi)化。在CME 過程中,病毒顆粒首先與細(xì)胞膜表面的特定受體結(jié)合,受體接受信號(hào)后,膜上相應(yīng)部位會(huì)形成網(wǎng)格蛋白包被小窩,隨后形成直徑85~120 nm 的包被囊泡,而病毒粒子就被包裹在包被囊泡中[17]。囊泡形成后,會(huì)在GTPase 動(dòng)力驅(qū)動(dòng)下從細(xì)胞膜脫落并進(jìn)入細(xì)胞質(zhì),此時(shí)囊泡失去網(wǎng)格蛋白,形成早期內(nèi)體并進(jìn)一步成熟[21]。而在巨胞飲過程中,無需受體介導(dǎo),主要由多種激酶,如RTK、PI3K1、PAK1 等和Rho GTPases 激活而在質(zhì)膜上產(chǎn)生褶皺或泡狀結(jié)構(gòu)來完成。通過巨胞飲作用入侵細(xì)胞的病毒粒子被包裹在0.5~10 mm 的無包被的囊泡中,形成巨胞飲體[22]。在形成早期內(nèi)體或巨胞飲體后,ASFV 粒子會(huì)被進(jìn)一步運(yùn)輸?shù)酵砥诤藘?nèi)體,進(jìn)行病毒脫殼。隨后ASFV 內(nèi)膜與晚期內(nèi)體膜之間發(fā)生融合,將病毒類核釋放到細(xì)胞質(zhì)中,并在細(xì)胞質(zhì)中形成病毒工廠(virus factory,VF)進(jìn)行復(fù)制[2]。

      2.2 基因表達(dá)和復(fù)制

      ASFV 基因表達(dá)有嚴(yán)格時(shí)間調(diào)控,可以分為早期、中期和晚期3 個(gè)階段,其中早期基因表達(dá)先于ASFV DNA 的復(fù)制[23]。早期基因表達(dá)發(fā)生在感染后4~6 h,ASFV 的RNA 聚合酶啟動(dòng)早期基因表達(dá),產(chǎn)生病毒復(fù)制所需的蛋白質(zhì)。ASFV 基因組的復(fù)制也分為兩個(gè)階段,最初發(fā)生在細(xì)胞核中,隨后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)VF 中進(jìn)行。感染后6~8 h,ASFV 通過G1211R基因編碼的自身DNA 聚合酶啟動(dòng)復(fù)制。在感染8~16 h 時(shí),開啟中晚期基因表達(dá),產(chǎn)生病毒結(jié)構(gòu)蛋白,隨后被組裝成病毒粒子[2,4]。

      2.3 組裝和出芽

      VF 定位于靠近細(xì)胞核的細(xì)胞質(zhì)中,它既是ASFV 基因組復(fù)制的主要區(qū)域,也是子代病毒組裝的場所[4]。ASFV 內(nèi)膜前體的形成啟動(dòng)了子代病毒組裝過程,跨膜結(jié)構(gòu)蛋白p54 在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上負(fù)責(zé)膜的募集和轉(zhuǎn)化。內(nèi)膜前體形成后,沉積在膜組裝中間體上的衣殼蛋白(p72 和其伴侶蛋白pB602L等)會(huì)逐個(gè)拼裝在一起,使膜前體逐漸形成二十面體結(jié)構(gòu)[24]。伴隨著衣殼形成,核殼在病毒內(nèi)膜下進(jìn)行組裝,多蛋白加工酶pS273R 在這一過程中發(fā)揮重要作用,pB602L 和p17 也通過影響pp220 和pp62 的水解來影響核殼到內(nèi)膜的組裝[25]。最后進(jìn)行基因組和相關(guān)類核蛋白包裝,主要由位于核殼的pA104R 發(fā)揮作用[26]。病毒組裝完成后,在微管和驅(qū)動(dòng)蛋白的共同作用下從被感染細(xì)胞中出芽,病毒衣殼蛋白pE120R 促進(jìn)成熟病毒顆粒從組裝位點(diǎn)運(yùn)輸?shù)劫|(zhì)膜,在質(zhì)膜中病毒獲得外包膜??傮w來說,一個(gè)完整的ASFV 感染周期,從附著細(xì)胞到出芽在24 h 內(nèi)完成[2]。

      3 ASFV 對先天性免疫反應(yīng)的逃逸

      病毒入侵機(jī)體后,先天性免疫反應(yīng)是抵御病毒的第一道防線,由上皮細(xì)胞或巨噬細(xì)胞產(chǎn)生干擾素(interferon,IFN)及其他細(xì)胞因子,進(jìn)而誘導(dǎo)自然殺傷細(xì)胞、粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞激發(fā)出顯著的主要的先天性免疫反應(yīng),并刺激啟動(dòng)獲得性免疫反應(yīng),包括B 細(xì)胞發(fā)揮的特異性體液免疫反應(yīng)和T細(xì)胞發(fā)揮的適應(yīng)性細(xì)胞免疫應(yīng)答,進(jìn)而對病毒進(jìn)行徹底清除并建立免疫記憶[4,27]。

      在先天性免疫反應(yīng)中,IFN 是重要組成部分,其可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)抗病毒蛋白的表達(dá)從而干擾病毒生命周期,并抑制病毒在細(xì)胞間擴(kuò)散[28]。當(dāng)病毒感染宿主細(xì)胞時(shí),各種模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors,PRRs),識(shí)別病原體相關(guān)分子模式從而激活先天性免疫信號(hào)通路,產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子和IFN-Ⅰ[29]。為保證自身的生存和復(fù)制,ASFV 進(jìn)化出多種對抗宿主細(xì)胞免疫反應(yīng)的策略,其中包括抑制感染細(xì)胞中IFN 和IFN 刺激基因(IFN-stimulated genes,ISG)表達(dá),以及抑制腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor,TNF-α)、白細(xì)胞介素(interleukin 包括IL1-β、IL-6、IL-8)等炎癥因子釋放[9]。本文將從IFN 反應(yīng)和炎癥反應(yīng)兩個(gè)方面來闡述ASFV 對先天性免疫反應(yīng)信號(hào)通路的調(diào)控,其分子作用網(wǎng)絡(luò)如圖1 所示。

      圖1 ASFV 拮抗宿主IFN 反應(yīng)及炎癥反應(yīng)的作用網(wǎng)絡(luò)

      3.1 ASFV 對IFN 反應(yīng)的調(diào)節(jié)

      ASFV 基因組為DNA,因此細(xì)胞質(zhì)DNA 傳感器在病毒識(shí)別和IFN 激活中發(fā)揮重要作用。具體而言,環(huán)二核苷酸合成酶(cyclic GMP-AMP synthase,cGAS)可識(shí)別病毒DNA,發(fā)生去谷氨?;皖惙核氐鞍仔揎椷M(jìn)而活化,活化的cGAS會(huì)催化第二信使分子環(huán)二核苷酸(cyclic GMPAMP,cGAMP)合成,進(jìn)而cGAMP與干擾素刺激因子編碼蛋白(stimulator of interferon,STING)結(jié)合。cGAMP 與STING 的相互作用誘導(dǎo)STING 形成二聚體,進(jìn)而與iRhom2 蛋白結(jié)合并易位至ER-golgi 中間區(qū)室(ERGIC),與TANK 結(jié)合激酶1(TANK binding kinase 1,TBK1)結(jié)合,TBK1 對干擾素調(diào)節(jié)因子3(interferon regulatory factors 3,IRF3)進(jìn)行磷酸化,磷酸化的IRF3 入核并介導(dǎo)IFN-Ⅰ表達(dá)[8,30],此外,STING 與TBK1的激活還會(huì)激活I(lǐng)KK 復(fù)合體(inhibitor of NF-κB,IκB,包含IKKβ、IKKα 和NEMO)從而將NF-κB的抑制因子(inhibitor of NF-κB,IκB)磷酸化以及蛋白泛素化和降解,釋放轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 入核并介導(dǎo)IFN-Ⅰ和前炎性因子表達(dá)[31-33]。除了cGASSTING 信號(hào)軸以外,在III 型RNA 聚合酶(RNA polymerase III,RNA PolyIII)作用下,兩種PRRs包 括Toll 樣受體(Toll-like receptors,TLRs)和RIG-I 樣受體(RIG-I-like receptors,RLRs)也發(fā)揮了病原體識(shí)別和IFN 激活功能[34]。細(xì)胞分泌的IFN 可被IFN 受體復(fù)合物IFNAR1/ IFNAR2 二聚體識(shí)別,并招募胞內(nèi)的酪氨酸激酶TYK2 和JAK1 到細(xì)胞膜并進(jìn)行相互磷酸化,進(jìn)而STAT1 和STAT2被分別招募和磷酸化,并與IRF9 形成三元復(fù)合物IFN 刺激基因因子3(ISGF3),ISGF3 入核與IFN 刺激反應(yīng)元件(ISREs)結(jié)合,啟動(dòng)ISGs 轉(zhuǎn)錄,產(chǎn)生的ISGs 可直接阻遏病毒復(fù)制和擴(kuò)散,清除病毒[9,35]。

      ASFV 編碼多種蛋白質(zhì)來抑制IFN-Ⅰ的生成,主要分為兩大類:一類是多基因家族蛋白(MGF360、MGF505),另一類是其他蛋白(pI329L、pDP96R、pE120R、pI215L、pF334L、pI267L)。ASFV 編碼蛋白對IFN 產(chǎn)生的分子調(diào)控機(jī)制研究總結(jié)如表1 所示。

      表1 ASFV 編碼的干擾素抑制相關(guān)蛋白及具體作用機(jī)制

      在ASFV 的多基因家族中,含有11~15 個(gè)成員的MGF360 和含有9~10 個(gè)成員的MGF505 被證明可以抑制IFN-I 反應(yīng)[36-37]。研究表明,在MGF360家族中,pMGF360-12L 以核定位信號(hào)依賴的方式與KPNA2、KPNA3 和KPNA4 競爭結(jié)合NF-κB,從而阻斷NF-κB 的核易位,抑制IFN-β 表達(dá)[38],還能通過降低IRF9 總蛋白水平抑制IFN-β 介導(dǎo)的免疫效應(yīng)[39];pMGF360-15R 能夠以NF-κB 非依賴性的方式靶向IRF3,調(diào)節(jié)IFN-β 表達(dá),但不影響I 型或II 型IFN 對Janus 激酶信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因 子(Janus-activated kinase Singal transducers and activators of transcriprion,JAK-STAT)通路的激活[40];pMGF360-13L 能抑制cGAS-STING 通路介導(dǎo)的IFN-β 活化,拮抗TBK1 和IRF3 向STING 募集,還能抑制TBK1 和IRF3 磷酸化,以及IRF3二聚化和入核,從而調(diào)控宿主的IFN 反應(yīng)[41];pMGF360-9L 與STAT1 和STAT2 存在相互作用,并通過泛素-蛋白酶體對二者進(jìn)行降解,抑制IFN抗病毒效應(yīng)通路激活[42]。pMGF360-11L 能抑制cGAS、STING、TBK1、IKKε、IRF7 和IRF3-5D介導(dǎo)的IFN-β 和ISRE 啟動(dòng)子的激活,與TBK1 和IRF7 相互作用,通過半胱氨酸、泛素-蛋白酶體和自噬途徑降解TBK1 和IRF7,還能抑制TBK1和IRF3 磷酸化,通過負(fù)向調(diào)控cGAS 信號(hào)通路參與IFN-I 表達(dá)[43];pMGF360-14L,可能通過競爭結(jié)合MAVS,抑制TRIM21 對MAVS 的泛素化,抑制IFN-I 產(chǎn)生[44]。而在MGF505 家族中,有研究表明MGF505-3R 與cGAS/TBK1/IRF3 相互作用,靶向TBK1 從而破壞了cGAS-STING 介導(dǎo)的IFN-β產(chǎn)生信號(hào)通路[45];pMGF505-7R 通過與STING 和自噬啟動(dòng)因子絲氨酸蘇氨酸激酶Unc-51 樣自噬激活激酶1(ULK1)相互作用,導(dǎo)致STING S366 被ULK1 磷酸化,并通過自噬途徑降解STING,從而抑制cGAS-STING 途徑介導(dǎo)的IFN-I 表達(dá)[8];除了抑制IFN-I 之外,pMGF505-7R 還能抑制IFN-γ 介導(dǎo)的下游基因轉(zhuǎn)錄,并與JAK1 和JAK2 相互作用,破壞IFN-γ 信號(hào)通路[8,46]。

      除了多基因家族以外,ASFV 還編碼一些其他蛋白質(zhì)來抑制IFN 反應(yīng)。pI329L 是TLR3 的同源物,通過靶向TLR3 通路中的TRIF,競爭性地結(jié)合到TLRs 的下游信號(hào)分子上,從而影響IFN 產(chǎn)生[47-48];pDP96R 是ASFV 的一個(gè)毒力因子,通過cGAS-STING 信號(hào)通路負(fù)調(diào)控IFN-I 產(chǎn)生,并通過阻斷TBK1 和IKK-β 的激活影響NF-κB 信號(hào)傳導(dǎo)[49];pD345L 對于cGAS-STING 誘導(dǎo)的IFN-β 和NF-κB 激活有抑制作用,與IKKα 以及IKKβ 互作,破壞激酶活性,抑制IκBα 磷酸化[50]。pE120R 是一種與病毒轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的蛋白,它與IRF3 羧基末端結(jié)構(gòu)域相互作用,干擾IRF3 向TBK1 募集,進(jìn)而抑制IRF3 的磷酸化,通過cGAS-STING 通路抑制IFN-β 生成[51];pI215L 是病毒的一種E2 泛素結(jié)合酶,能抑制TBK1 K63 泛素化,從而抑制IFN-β 產(chǎn)生[52]。pF334L 通過與IRF9 相互作用,誘導(dǎo)IRF9通過泛素-蛋白酶體途徑發(fā)生降解,阻礙ISGF3的部分入核,抑制ISGs 分子表達(dá)[53]。pI267L 通過與E3 泛素連接酶RIPLET 相互作用中斷其與RIG-I 的聯(lián)系,從而損害RIPLET 介導(dǎo)的泛素化和RIG-I 的激活,抑制IFN-β 生成[35];pA528R 能與p65 蛋白相互作用,抑制TLR8-NF-κB 通路及其介導(dǎo)的抗病毒反應(yīng)[54];pE248R 能招募ATG101 降解STING,通過負(fù)調(diào)控cGAS-STING 信號(hào)通路抑制IFN-I 產(chǎn)生[55]??傊?,為逃避宿主細(xì)胞的免疫反應(yīng),ASFV 編碼多種蛋白質(zhì)以不同策略抑制IFN 產(chǎn)生,從而保證自身存活和復(fù)制,提高感染效率。

      3.2 ASFV 對炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)

      炎癥反應(yīng)在ASFV 的發(fā)病機(jī)制中也發(fā)揮著重要作用。ASFV 感染豬后,會(huì)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌多種炎性細(xì)胞因子,如TNF-α、白細(xì)胞介素(IL-1β、IL-6、IL-8)、CCL4、CXCL10 等,引起強(qiáng)烈炎癥反應(yīng),導(dǎo)致受感染豬發(fā)生嚴(yán)重的炎癥病變甚至死亡[9]。有研究[5]發(fā)現(xiàn),與高毒力ASFV 毒株相比,低毒力毒株能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生更高水平的炎性細(xì)胞因子,說明炎癥反應(yīng)與ASFV 感染致病力密切相關(guān)。ASFV 編碼蛋白對炎性因子產(chǎn)生的分子調(diào)控機(jī)制研究總結(jié)如表2 所示。

      表2 ASFV 編碼的抑制炎癥反應(yīng)相關(guān)蛋白及功能

      NF-κB 信號(hào)通路是機(jī)體通過炎癥反應(yīng)進(jìn)行抗病毒的重要途徑。細(xì)胞中的PRR 可識(shí)別病毒DNA或dsRNA 激活NF-κB通路,使NF-κB二聚體入核,在細(xì)胞核中積累并調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄[56]。炎癥反應(yīng)的發(fā)生,除了通過對NF-κB 通路的激活,還能通過激活NLRP3 炎癥小體途徑,促進(jìn)炎癥因子分泌[57]。

      ASFV pA238L、pF317L、pL83L 和pMGF505-7R 蛋白參與細(xì)胞炎癥反應(yīng)調(diào)控。pA238L 蛋白對炎癥因子轉(zhuǎn)錄活動(dòng)的調(diào)控有多種途徑:首先它是IκB的同源物,可以與NF-κB 結(jié)合抑制NF-κB 激活,從而抑制細(xì)胞的炎癥反應(yīng);其次它能與鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(calcium/calmodulin-regulated phosphatase calcinerurin,CaN)相互作用,影響其磷酸酶活性,抑制活化T 細(xì)胞核內(nèi)因子(nuclear factor of activated T cell cytoplasmic,NFAT)激 活,抑制IL-2、IL-4 等細(xì)胞因子產(chǎn)生;最后pA238L 能與細(xì)胞核中CBP/p300 相互作用,破壞p300 向轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的募集,阻止p300 磷酸化,進(jìn)而抑制TNF-α產(chǎn)生[9,58]。研究[59]發(fā)現(xiàn),在ASFV 感染的細(xì)胞中,pF317L 與IKKβ 相互作用,抑制IKKβ 磷酸化,導(dǎo)致IκBα 磷酸化和泛素化降低,IκBα 表達(dá)上調(diào),從而抑制NF-κB 激活,抑制細(xì)胞炎癥反應(yīng)。

      作為一種重要的促炎細(xì)胞因子,IL-1β 由單核-巨噬細(xì)胞分泌后可引起炎癥反應(yīng)并促進(jìn)B 細(xì)胞增殖分化[4]。然而研究[60]表明,ASFV pL83L 蛋白可特異性結(jié)合IL-1β,從而阻斷IL-1β 與受體結(jié)合,抑制IL-1β 引起的炎癥反應(yīng)。pMGF505-7R 是一個(gè)多功能蛋白質(zhì),與IKKα 相互作用,抑制IκBα磷酸化和NF-κB 核易位,從而抑制IL-1β 前體轉(zhuǎn)錄。另外,pMGF505-7R 還與NLRP3 相互作用,阻斷NLRP3 炎癥小體組裝,抑制成熟IL-1β 分泌[57,61]。除此之外,還有研究[62]發(fā)現(xiàn)pI226L、pA151R、pNP419、pQP383R 蛋白能抑制AIM2 炎癥小體組裝,從而抑制IL1-β 成熟和分泌。

      4 ASFV 對適應(yīng)性免疫反應(yīng)的逃逸

      近些年來,研究[9]表明,用ASFV 弱毒株感染豬可以產(chǎn)生保護(hù)性抗體,且弱毒株免疫血清能夠提高健康豬對同源毒株的抵抗力,說明宿主細(xì)胞的適應(yīng)性免疫在抵抗ASFV 感染中也發(fā)揮著重要作用。在抗原遞呈和T 細(xì)胞免疫反應(yīng)中,巨噬細(xì)胞的MHC-I 類和MHC-II 類分子發(fā)揮關(guān)鍵作用。在ASFV 感染過程中,其編碼的pEP402R、pEP153R蛋白能通過不同的分子機(jī)制來逃避適應(yīng)性免疫反應(yīng)。

      pEP402R 蛋白也稱為CD2v 蛋白,是ASFV感染晚期編碼的一種蛋白質(zhì),存在于ASFV 粒子外包膜上,其結(jié)構(gòu)和功能與T 淋巴細(xì)胞表面抗原CD2 相似,它能介導(dǎo)病毒與紅細(xì)胞粘附,促進(jìn)病毒在宿主體內(nèi)傳播[63-64]。除此之外,CD2v 可以通過與淋巴細(xì)胞表面受體結(jié)合,或者通過與細(xì)胞質(zhì)蛋白之間相互作用抑制淋巴細(xì)胞增殖,從而抑制適應(yīng)性免疫[48]。研究[63]表明,CD2v 缺失的BA71 減毒活疫苗對不同基因型毒株可產(chǎn)生一定保護(hù)效果。

      pEP153R 蛋白則與一些細(xì)胞蛋白同源,如CD94、CD69、Ly94A 和CD44 等,因此pEP153R能與這些細(xì)胞蛋白競爭結(jié)合MHC 類分子,從而抑制T 細(xì)胞激活[65];pEP153R 與MHC 類分子的結(jié)合也會(huì)抑制MHC-I 從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到細(xì)胞膜的運(yùn)輸,抑制NK 細(xì)胞激活,由此可見pEP153R 蛋白也在抑制適應(yīng)性免疫方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。

      5 ASFV 對程序性細(xì)胞死亡進(jìn)行調(diào)節(jié)

      病毒入侵時(shí),機(jī)體會(huì)啟動(dòng)應(yīng)激性細(xì)胞行為以控制病毒感染,例如細(xì)胞程序性死亡(細(xì)胞凋亡和細(xì)胞自噬等),這是宿主抗病毒免疫應(yīng)答的重要部分。然而,ASFV 在感染過程中會(huì)通過病毒蛋白來調(diào)控細(xì)胞程序性死亡的發(fā)生,達(dá)到逃避宿主免疫反應(yīng)并維持自身復(fù)制的目的。

      細(xì)胞凋亡主要有3 種途徑,分別為外源性凋亡途徑(extrinsic apoptotic pathway,EAP)、內(nèi)源性凋亡途徑(intrinsic apoptotic pathway,IAP)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)途徑。EAP 由胞外的凋亡受體介導(dǎo)與相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域以及procaspase-8 形成誘導(dǎo)死亡信號(hào)復(fù)合體,從而依次激活caspase 8 和caspase 3 進(jìn)行細(xì)胞凋亡。IAP又稱為線粒體/細(xì)胞色素C(cytochrome C,Cyt-c)介導(dǎo)的通路,在其介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中,細(xì)胞內(nèi)刺激因子與線粒體上的Bcl-2 家族成員相互作用,將Cyt-c 從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中,Cyt-c、APAF-1 和caspase 9 形成凋亡小體,激活caspases9/3/6/7,從而引起凋亡[4]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)途徑則能通過持續(xù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激啟動(dòng)未折疊蛋白反應(yīng),導(dǎo)致caspase-12 活化,從而導(dǎo)致凋亡[66]。此外,細(xì)胞自噬也是細(xì)胞的一種防御保護(hù)措施[67],病毒入侵宿主細(xì)胞后,會(huì)通過病毒蛋白誘導(dǎo)、病毒配體與受體互作、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激3 種機(jī)制來誘導(dǎo)宿主細(xì)胞發(fā)生自噬,將病毒顆粒運(yùn)送到溶酶體中進(jìn)行降解,并進(jìn)一步通過與PRRs 結(jié)合,誘導(dǎo)IFN 反應(yīng)[68-69]。宿主細(xì)胞通過凋亡或自噬,能夠使病毒暴露在免疫系統(tǒng)中,從而抑制病毒復(fù)制進(jìn)而將病毒清除。因此為確保感染早期細(xì)胞的存活狀態(tài),產(chǎn)生足夠的子代病毒,病毒進(jìn)化出了延遲或者抑制細(xì)胞程序性死亡的策略,進(jìn)一步為確保感染晚期子代病毒的成功出芽,病毒還進(jìn)化出了促進(jìn)細(xì)胞程序性死亡的策略[9]。

      在ASFV 編碼蛋白中,pA224L、pA179L、EP153R 和pDP71L 發(fā)揮抑制凋亡功能,P54/pE199L 發(fā)揮誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡功能。其中,pA179L 還參與細(xì)胞自噬調(diào)控。

      pA224L 是在ASFV 感染晚期表達(dá)的一種保守蛋白質(zhì),它是一種凋亡抑制因子(inhibitor of apoptosis proteins,IAPs)同源蛋白,能夠與激活的caspase-3 相互作用并抑制其蛋白酶功能,從而抑制多種凋亡誘發(fā)因子誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[9,70]。另有研究表明,pA224L 可通過IKK 激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 從而抑制細(xì)胞凋亡[71],然而,A224L 的缺失對ASFV 毒力以及感染細(xì)胞的細(xì)胞凋亡程度并無顯著影響[72]。

      pA179L 定位于線粒體或內(nèi)質(zhì)網(wǎng),是Bcl-2 家族的同源物,它含有BH1、BH2、BH3 和BH4 的保守結(jié)構(gòu)域,但缺乏相應(yīng)跨膜結(jié)構(gòu)域。結(jié)構(gòu)生物學(xué)結(jié)果[9,73]顯示,pA179L 既能結(jié)合促凋亡蛋白Bid的活性截?cái)囿wp13 和p15 從而抑制其活性,也能結(jié)合其他促凋亡蛋白Bak 和Bax 實(shí)現(xiàn)細(xì)胞凋亡的抑制。最近研究[74]發(fā)現(xiàn),pA179L 能夠發(fā)生異戊二烯化修飾,異戊二烯化通過指導(dǎo)pAl79L 蛋白的線粒體定位調(diào)控其抑制細(xì)胞凋亡活性。進(jìn)一步研究[75]表明,pAl79L 蛋白通過其BH3 同源結(jié)構(gòu)域與Beclin-1 在線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相互作用,在饑餓條件下抑制自噬體形成,這提示pAl79L 蛋白具有對程序性細(xì)胞死亡的多重調(diào)控功能,以保障病毒復(fù)制和子代病毒組裝。

      EP153R 是C 型凝集素類似蛋白,參與病毒感染后的血細(xì)胞吸附過程,還能抑制caspase-3,除此之外它還能降低細(xì)胞蛋白p53 的反式激活活性,從而某些凋亡抑制分子的轉(zhuǎn)錄活動(dòng)受到影響,抑制細(xì)胞凋亡[76]。

      內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激也是細(xì)胞凋亡發(fā)生的途徑之一,而在ASFV 復(fù)制過程中,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中積累過量的未折疊蛋白或錯(cuò)誤折疊蛋白,則會(huì)誘導(dǎo)未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response,UPR)。而ASFV可選擇性活化ATF6 信號(hào)通路,激活caspase-12,誘導(dǎo)分子伴侶鈣聯(lián)蛋白和鈣網(wǎng)狀蛋白表達(dá),改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài),抑制感染早期細(xì)胞凋亡活動(dòng)[77]。pDP71L 是ASFV 中高度保守的晚期蛋白,它是單純皰疹病毒ICP34.5 以及細(xì)胞蛋白GADD34 的類似物,均可與蛋白磷酸酶PP1 結(jié)合,并招募真核翻譯起始因子eIF2α 去磷酸化,阻斷ATF4 和下游促凋亡因子CHOP 生成,從而阻斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘發(fā)細(xì)胞凋亡的信號(hào)軸eIF2α-ATF4-CHOP[78],保障細(xì)胞的蛋白質(zhì)翻譯功能以及病毒增殖。然而pDP71L缺失體病毒研究結(jié)果[79]顯示,該蛋白并不是調(diào)控eIF2α 的唯一因素。

      除抑制細(xì)胞凋亡以外,ASFV 還可以通過相應(yīng)策略促進(jìn)細(xì)胞凋亡,有利于病毒傳播,從而增加病毒從細(xì)胞中釋放的量,避免炎癥信號(hào)的誘導(dǎo)[9]。p54(E183L)位于成熟病毒粒子內(nèi)膜,是一種結(jié)構(gòu)蛋白,在感染早期參與吸附宿主細(xì)胞,并通過自身的SQT 基序(與BCL2 家族的促凋亡蛋白BH3-only BIM 同源)與微管動(dòng)力蛋白直接結(jié)合,實(shí)現(xiàn)病毒內(nèi)化后向病毒復(fù)制工廠的轉(zhuǎn)運(yùn)。在病毒感染后期p54 高量表達(dá),激活caspase-3 并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,且將內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜轉(zhuǎn)化為子代病毒內(nèi)囊膜。研究[80]表明,SQT 基序內(nèi)結(jié)構(gòu)域的缺失可使P54 蛋白喪失與微管動(dòng)力蛋白結(jié)合的能力以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力。pE199L 是在感染晚期表達(dá)的一種內(nèi)膜蛋白,能夠激活促凋亡因子Bak 從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[81]。因此為提高感染率,ASFV 通過不同策略對宿主細(xì)胞的凋亡程序進(jìn)行調(diào)控。

      6 總結(jié)與展望

      自2018 年我國首次報(bào)告ASF 病例以來,ASF給我國乃至全世界都帶來了巨大經(jīng)濟(jì)損失。ASFV在感染宿主細(xì)胞過程中,細(xì)胞會(huì)識(shí)別病毒刺激,引起IFN、炎癥、程序性細(xì)胞死亡和機(jī)體適應(yīng)性免疫反應(yīng),以形成系統(tǒng)的抗病毒反應(yīng)。同時(shí),ASFV 進(jìn)化出一系列逃逸宿主細(xì)胞抗病毒反應(yīng)的策略,包括調(diào)節(jié)先天性免疫信號(hào)通路、抑制抗原呈遞、調(diào)控程序性細(xì)胞死亡等,從而躲避細(xì)胞的免疫攻擊,提高感染效率。以上復(fù)雜的免疫逃逸策略加大了有效疫苗設(shè)計(jì)的難度。

      基于對ASFV 編碼蛋白的鑒定和功能研究,已證實(shí)p72、p30、p54 和CD2v 等蛋白是ASFV 的重要免疫原,可誘導(dǎo)豬體產(chǎn)生中和抗體,然而免疫保護(hù)效果一般[82]。在缺失體病毒構(gòu)建工作中發(fā)現(xiàn),DP71L、DP96R、B119L 或DP148R 的缺失可減弱病毒毒力,有一定保護(hù)性效果[83]。目前,國內(nèi)外對ASFV 疫苗的設(shè)計(jì)開發(fā)以重組亞單位疫苗和減毒活疫苗為主,以上免疫原和減毒策略的嘗試并未達(dá)到理想的免疫保護(hù)效果。有研究[84-85]表明,7 基因缺失的減毒活疫苗HLJ/1-7GD(MGF505-1R、MGF360-12L、MGF360-13L、MGF360-14L、MGF505-2R、MGF505-3R和CD2v缺失)有較好的臨床免疫保護(hù)效果,但該疫苗株的生物安全性還有待于進(jìn)行全面系統(tǒng)評(píng)估,因此進(jìn)一步對ASFV 編碼產(chǎn)物的鑒定及其功能進(jìn)行充分研究,可為重組減毒活疫苗的基因缺失策略提供更多缺失基因組合,有助于構(gòu)建具有良好免疫原性和強(qiáng)保護(hù)效果的疫苗株[86]。此外,通過分子流行病學(xué)對ASFV 基因組進(jìn)化的監(jiān)測發(fā)現(xiàn),有2 株豬場分離毒株發(fā)生了缺失并導(dǎo)致病毒毒力減弱,可能導(dǎo)致豬群的慢性或無癥狀感染,鑒定結(jié)果表明缺失基因?yàn)閜EP402R和pEP153R[87],回顧二者編碼蛋白的功能研究,可發(fā)現(xiàn)它們參與宿主適應(yīng)性免疫反應(yīng)的逃避或調(diào)控細(xì)胞程序性死亡。因此,在未來科學(xué)防治和新疫苗開發(fā)中可考慮當(dāng)前ASFV 的適應(yīng)和進(jìn)化。

      已有研究[88-89]借助于生物信息學(xué)研究手段挖掘ASFV 免疫逃逸相關(guān)蛋白或基于T 細(xì)胞表位全景掃描技術(shù)開發(fā)ASFV 細(xì)胞免疫疫苗,這些工作為ASFV 疫苗研發(fā)工作帶來了新突破口。未來,除了對IFN 生成和炎癥反應(yīng)調(diào)控的分子機(jī)制鑒定外,還應(yīng)結(jié)合適應(yīng)性免疫中免疫細(xì)胞亞群偏移和病理性炎性反應(yīng)發(fā)生的機(jī)理研究,為新型疫苗設(shè)計(jì)提供理論依據(jù),加強(qiáng)免疫保護(hù)效果。

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