野生二倍體草莓子葉的再生體系建立

緱一杰， 馮嘉玥， 蘇新雷， 柯 健

(1.楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物工程分院， 陜西 楊凌 712100； 2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 園藝學(xué)院， 陜西 楊凌 712100； 3.陜西東籬下現(xiàn)代生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司， 陜西 西安 710000； 4.陜西省漢中市略陽縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心， 陜西 漢中 724300)

0 引言

【研究意義】草莓(FragariaananassaDuch.)屬多年生草本果樹，薔薇科(Rosaceae)草莓屬，原產(chǎn)于南美洲，目前種植面積廣泛，在中國和歐洲等地均有種植。草莓因其果實含有極高的營養(yǎng)價值而素有“水果皇后”的美稱，已成為植物學(xué)研究領(lǐng)域中的重要模式物種。近年來，草莓作為草本果樹逐漸發(fā)展為可進(jìn)行基因功能研究的模式植物，八倍體栽培草莓的高效遺傳轉(zhuǎn)化體系被廣泛研究，然而其高度雜合的特點使再生周期和遺傳轉(zhuǎn)化周期較長[1-3]。二倍體草莓基因組較小，是更為理想的模式植物，其高效再生體系是開展草莓基因工程研究的前提[4-7]。因此，以野生二倍體草莓Yellow wonder子葉為材料，研究其子葉高效再生體系，對野生草莓的遺傳轉(zhuǎn)化研究與應(yīng)用具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】植物激素濃度配比是影響草莓葉片再生的重要因素，細(xì)胞分裂素和生長素分別促進(jìn)芽的產(chǎn)生和根的形成，2種激素的濃度及配比顯著影響芽和根再生的效果。1988年，柯善強(qiáng)等[8]選擇草莓試管苗的幼嫩葉片，在含有1.5～2.5 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)外植體，可誘導(dǎo)出不定芽，誘導(dǎo)率為20%；1989年，NEHRA等[9]發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)Redcoat草莓葉片再生不定芽的最佳激素配比為6-BA 10 μmol/L+IBA 10 μmol/L。近年來，國內(nèi)科學(xué)家對各類品種草莓的離體再生體系進(jìn)行了大量研究。張經(jīng)緯等[10]研究表明，二倍體草莓葉片不定芽分化率和分化速度均低于八倍體草莓。董莉等[11]建立了紅顏草莓葉片的高效再生體系，最終篩選出最佳脫分化培養(yǎng)基為MS+TDZ 2.0 mg/L +NAA 0.1 mg/L，最佳分化培養(yǎng)基為MS+TDZ 1.0 mg/L +NAA 0.1 mg/L。楊仕品等[12]研究發(fā)現(xiàn)，章姬草莓在激素配比為TDA 3.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L培養(yǎng)基上，葉片再生率可達(dá)95.83%。喬瑞琪等[13]研究發(fā)現(xiàn)，二倍體草莓Ruegen在激素配比為TDZ 2.0 mg/L+IBA0.2 mg/L培養(yǎng)基上，葉片再生頻率可達(dá)81%。【研究切入點】隨著基因工程技術(shù)的快速發(fā)展，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)加快草莓育種是必然趨勢。而成功的基因轉(zhuǎn)化必須依賴于高效穩(wěn)定的再生系統(tǒng)[14]。外植體的選擇是草莓再生技術(shù)的關(guān)鍵，由于葉片來源廣泛、易于處理，草莓葉片已成為離體再生的最佳材料[15]，但利用草莓子葉作為再生材料的研究鮮有報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以野生草莓Yellow Wonder的子葉為材料建立高效再生體系，為豐富草莓再生材料來源及為草莓育種研究和其他生物技術(shù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料 二倍體野生草莓Yellow Wonder種子采摘于西北農(nóng)林科技大學(xué)。

1.1.2 主要試劑 2%次氯酸鈉、75%酒精、IBA、6-BA、瓊脂和蔗糖均為市購。

1.1.3 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件 種子萌發(fā)培養(yǎng)基為1/2 MS+3%蔗糖(液體培養(yǎng)基，pH 5.8)；子葉再生培養(yǎng)基9種(表1)；不定芽繼代培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.1 mg/L；生根培養(yǎng)基分別為MS+IBA 0.1 mg/L和MS+IBA 0.2 mg/L。所有培養(yǎng)基蔗糖和瓊脂均分別為30 g/L和8 g/L，pH 5.8，光照強(qiáng)度3 000～5 000 Lx、光周期16 h /8 h、溫度(25±2)℃。

表1 草莓子葉再生培養(yǎng)基的激素配比

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體制備 將草莓種子在堿性洗衣粉水中浸泡15 min，沖洗干凈后于無菌水中浸泡過夜，用旋渦振蕩儀破除種皮，無菌濾紙吸干種子表面水分，75%酒精浸泡30 s，無菌水沖洗2～3次，在超凈工作臺上用2%次氯酸鈉溶液消毒10 min，無菌水沖洗2～3次，清洗時劇烈搖晃。在無菌條件下，用不加瓊脂的液體萌發(fā)培養(yǎng)基將無菌濾紙浸濕，種子接種于濾紙上， 4℃暗培養(yǎng)2周后轉(zhuǎn)移到組培間[光照強(qiáng)度3 000～5 000 Lx，光周期16 h /8 h，溫度(25±2)℃]進(jìn)行萌發(fā)培養(yǎng)，計算發(fā)芽率。

發(fā)芽率=(發(fā)芽種子數(shù)/種子總數(shù))×100%

1.2.2 不同激素配比下子葉誘導(dǎo)不定芽試驗 子葉充分展開后，用手術(shù)刀和鑷子取子葉前端部分(1～2 mm)，正面朝上接種于不同激素配比的9種子葉再生培養(yǎng)基中培養(yǎng)。暗培養(yǎng)7 d后轉(zhuǎn)入長日照環(huán)境中培養(yǎng)40 d，統(tǒng)計外植體的脫分化數(shù)量和再分化數(shù)量，計算出愈率和分化率。每個處理3次重復(fù)。

出愈率=(產(chǎn)生愈傷子葉數(shù)/接種子葉總數(shù))×100%

分化率=(產(chǎn)生再生芽子葉數(shù)/接種子葉總數(shù))×100%

1.2.3 不同暗培養(yǎng)時間下子葉誘導(dǎo)不定芽試驗 培養(yǎng)基為子葉誘導(dǎo)不定芽試驗的最佳分化培養(yǎng)基，暗培養(yǎng)時間設(shè)置為0 d(CK)、3 d、7 d和14 d，子葉暗培養(yǎng)結(jié)束后改為光暗交替培養(yǎng)40 d。統(tǒng)計外植體的脫分化和再分化數(shù)量，計算出愈率和分化率。每個處理3次重復(fù)。

1.2.4 不同IBA濃度下不定根誘導(dǎo)試驗 將不定芽轉(zhuǎn)接到繼代培養(yǎng)基上持續(xù)生長，待芽莖伸長至1～2 cm時，將其自基部切下轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基上，比較IBA濃度分別為0.1 mg/L和0.2 mg/L不定根的生長情況，14 d后統(tǒng)計平均根數(shù)，計算生根率。每個處理3次重復(fù)。

生根率=(長出不定根再生芽數(shù)/總芽數(shù))×100%

1.2.5 不同子葉部位誘導(dǎo)不定芽比較試驗 用鑷子和解剖刀切取子葉前端、子葉中部和帶柄子葉3個部位，分別接種于子葉誘導(dǎo)不定芽試驗的最佳分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)40 d，篩選出最適宜誘導(dǎo)不定芽的子葉部位。每個處理3次重復(fù)。

1.2.6 煉苗與移栽 選擇健壯、根系發(fā)達(dá)的再生苗20株，噴少量純水，打開瓶蓋在室外煉苗。3日后洗去根部的培養(yǎng)基假植于裝有基質(zhì)的營養(yǎng)缽中，覆蓋透明塑料蓋保濕，14 d后統(tǒng)計移栽存活率。揭開塑料蓋繼續(xù)培養(yǎng)20 d移栽至大田。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Microsoft Excel 2007和IBM SPSS Statistics Version 19進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 草莓種子的萌發(fā)情況

草莓種子進(jìn)行無菌萌發(fā)培養(yǎng)，種子經(jīng)2周黑暗4℃處理后，在組培間培養(yǎng)第4天開始發(fā)芽(圖1 a、b)，出芽率為20%，第10天時發(fā)芽率達(dá)90%(圖1 c)。

2.2 不同濃度激素草莓子葉不定芽的再生效果

從表2看出，培養(yǎng)Yellow Wonder子葉不定芽再生效果最好的激素配比是處理6(6-BA 3.4 mg/L+IBA 0.3 mg/L)，出愈率為93.33%，分化率為83.33%，明顯高于其他激素處理組合；當(dāng)6-BA濃度增高到4.4 mg/L時，不定芽分化率呈明顯下降趨勢，且有明顯玻璃化現(xiàn)象的產(chǎn)生，長勢變?nèi)酢?/p>

表2 不同激素配比下草莓子葉不定芽的再生效果

2.3 不同暗培養(yǎng)時間草莓子葉不定芽的再生效果

從表3看出，經(jīng)不同暗培養(yǎng)時間后，暗培養(yǎng)7 d的出愈率和分化率均最高，分別達(dá)90.74%和85.93%，均顯著高于CK；暗培養(yǎng)14 d時子葉邊緣和傷口處有輕微褐化現(xiàn)象。表明，誘導(dǎo)Yellow Wonder草莓子葉不定芽的暗處理最佳時間為7 d。

表3 不同暗培養(yǎng)時間下子葉不定芽的再生效果

2.4 IBA不同濃度誘導(dǎo)草莓不定根的效果

從表4看出，較高濃度IBA對草莓不定根的誘導(dǎo)較好，IBA濃度為 0.2 mg /L時，生根率可達(dá)100%，平均根數(shù)11.8條。

表4 IBA不同濃度誘導(dǎo)草莓不定根的效果

2.5 草莓子葉不同部位不定芽的再生效果

從表5看出，草莓子葉前端、子葉中部、帶柄子葉3個部位接種于6-BA 3.4 mg/L+IBA 0.3 mg/L的再生培養(yǎng)基上誘導(dǎo)40 d后，不定芽出愈率最高的是子葉中部，為94%；其次是帶柄子葉，為90%；子葉前端最低，為85%。接種3個部位不定芽的分化率也以子葉中部最高，為85%；其次是帶柄子葉，為79%；子葉前端最低，為60%。表明，最適宜誘導(dǎo)草莓子葉不定芽的部位為子葉中部，其次是帶柄子葉。

表5 草莓子葉不同部位不定芽的再生效果

2.6 再生苗移栽成活率

20株再生苗經(jīng)煉苗、假植、移栽后存活率達(dá)100%，均可正常開花結(jié)果，無病害發(fā)生。

3 討論

在自然條件下，草莓種子很難正常發(fā)芽[10]，需對種子進(jìn)行特殊處理才會提高發(fā)芽率[16-17]。研究通過消毒前對種子進(jìn)行過夜浸泡，用旋渦振蕩儀破除種皮，并在消毒完成后對種子進(jìn)行2周低溫春化處理，種子發(fā)芽率達(dá)90%。除基因調(diào)控外，激素的種類和濃度是影響草莓葉片再生的主要因素。細(xì)胞分裂素利于不定芽的形成，生長素可促進(jìn)生根，將二者進(jìn)行不同濃度搭配后可調(diào)節(jié)不定芽的形成[18]。NYMAN等[19]研究得出，Redcoat草莓葉片再生的最佳激素配比為6-BA 10 μmol/L+IBA 10 μmol/L；周鶴瑩等[20]研究表明，二倍體草莓Hawaii4在6-BA 3.0 mg/L+IBA 0.1 mg/L的培養(yǎng)基上再生頻率達(dá)80%。研究結(jié)果表明，Yellow Wonder草莓子葉在6-BA 3.4 mg/L+IBA 0.3 mg/L的再生培養(yǎng)基上培養(yǎng)，不定芽出愈率為93.33%，分化率為83.33%，適合用于遺傳轉(zhuǎn)化研究。

暗培養(yǎng)時間是影響草莓葉片再生的重要因素[13]，暗培養(yǎng)有利于加快愈傷組織的形成并減少酚類物質(zhì)的產(chǎn)生，減輕褐變[7]。不同品種和基因型草莓適合的暗培養(yǎng)時間有所不同，二倍體草莓Hawaii4的暗培養(yǎng)時間是3 d[20]，豐香草莓是28 d[21]，紅顏草莓是10 d[8]；試驗中Yellow Wonder草莓暗培養(yǎng)的最佳時間為7 d，出愈率和分化率均最高，分別達(dá)90.74%和85.93%。不同子葉部位的再生能力有所不同，如辣椒子葉再生培養(yǎng)中，以較嫩的子葉和子葉中部容易誘導(dǎo)愈傷組織和植株再生[22]，這與本研究草莓子葉最適宜部位為子葉中部的結(jié)論相一致。

4 結(jié)論

研究建立了野生草莓Yellow Wonder子葉的高效再生體系，即將Yellow Wonder草莓種子在萌發(fā)培養(yǎng)基(1/2 MS+3%蔗糖)中培養(yǎng)至發(fā)芽；將子葉中部切下，正面朝上置于子葉再生培養(yǎng)基(6-BA 3.4 mg/L+IBA 0.3 mg/L)上；在室溫條件下暗處理7 d后，轉(zhuǎn)入(25±2)℃長日照條件下培養(yǎng)40 d誘導(dǎo)出不定芽；不定芽轉(zhuǎn)接到繼代培養(yǎng)基(MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.1 mg/L)上持續(xù)生長，待芽苗伸長至1～2 cm后，再轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基(MS+IBA 0.2 mg/L)中進(jìn)行生根培養(yǎng)。再生苗經(jīng)煉苗、假植、移栽后，存活率達(dá)100%，且可正常開花結(jié)果，無病害發(fā)生。