呼吸系統(tǒng)疾病中醫(yī)證候本質(zhì)組學(xué)研究應(yīng)用與思考

何轉(zhuǎn)為，唐志宇，王德群，潘媛媛，曹文富

（1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川中醫(yī)院2019級碩士研究生，重慶 402160；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川中醫(yī)院，重慶 402160；3.重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，重慶 401331）

隨著高通量測序技術(shù)、高分辨質(zhì)譜技術(shù)以及計算機技術(shù)的綜合運用，組學(xué)技術(shù)正在生命科學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮越來越重要的作用［1］。呼吸系統(tǒng)疾病是臨床常見病、多發(fā)病，具有反復(fù)發(fā)作和根治難度大的特點，據(jù)2015年中國死因監(jiān)測數(shù)據(jù)，呼吸系統(tǒng)疾病已經(jīng)成為中國第4位死亡原因的疾?。?］。研究表明，中醫(yī)藥治療呼吸系統(tǒng)疾病在抗病毒、控制肺纖維化、改善肺功能、抗肺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等方面均具有優(yōu)勢［3］。近年來組學(xué)技術(shù)被廣泛運用到呼吸系統(tǒng)疾病的證候本質(zhì)研究中，現(xiàn)綜述組學(xué)技術(shù)對呼吸疾病證候本質(zhì)的研究應(yīng)用。

1 組學(xué)技術(shù)

組學(xué)技術(shù)分為基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)及代謝組學(xué)。基因組學(xué)通過全轉(zhuǎn)錄組測序、表達(dá)譜芯片等技術(shù)揭示疾病不同階段的基因表達(dá)水平及調(diào)控機制［4］；轉(zhuǎn)錄組學(xué)通過基因表達(dá)的信息推斷相應(yīng)未知基因的功能，從而揭示某類調(diào)節(jié)基因的作用機制；蛋白質(zhì)組學(xué)常用高分辨質(zhì)譜的標(biāo)記和非標(biāo)記定量定性技術(shù)，從整體層面研究生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)組成與調(diào)控活動規(guī)律［5］；代謝組學(xué)分為靶向代謝組學(xué)和非靶向代謝組學(xué)，用于描述生物內(nèi)源性代謝物的整體及其對內(nèi)外因素的應(yīng)答規(guī)律。通過組學(xué)技術(shù)不僅可以提示生命進程的物質(zhì)基礎(chǔ)，還可以揭示生物進程中已經(jīng)發(fā)生的物質(zhì)改變［6］。

2 組學(xué)技術(shù)與中醫(yī)證候

證候是中醫(yī)學(xué)獨有的概念，是古代醫(yī)家經(jīng)過長期臨床實踐總結(jié)歸納而成的對疾病某一特定階段病理生理變化的概括。證候是中醫(yī)學(xué)整體觀念和辨證論治的精髓所在，因此準(zhǔn)確的辨證才是確保臨床療效的前提。但在實際臨床工作中，因缺乏統(tǒng)一的證候判定標(biāo)準(zhǔn)，不同的臨床工作者對同一疾病體所辨別出的證候類型有所差異；另一方面，針對中醫(yī)藥的整體性，目前常采用對照關(guān)聯(lián)、類比分析、經(jīng)驗集理論等多種數(shù)據(jù)挖掘方法研究中醫(yī)證候，但其高維度、高階性和非線性的復(fù)雜性使得數(shù)據(jù)挖掘并不能全面概括中醫(yī)證候［7］。而組學(xué)技術(shù)可動態(tài)捕捉疾病狀態(tài)下體內(nèi)生物分子的動態(tài)變化，具有不同維度、不同層次、不同靶點的研究特點以及動態(tài)性、復(fù)雜性和整體性，其研究方法和中醫(yī)學(xué)的整體觀念理論契合，是研究證候微觀標(biāo)準(zhǔn)的先進技術(shù)。

3 組學(xué)技術(shù)在呼吸系統(tǒng)疾病中醫(yī)證候本質(zhì)研究

3.1 哮喘

支氣管哮喘簡稱哮喘，是一種氣道慢性炎癥性疾病［8］，以突然發(fā)生喘息、咳嗽、胸悶、氣促等為主要臨床表現(xiàn)，是常見的呼吸系統(tǒng)疾病。支氣管哮喘屬中醫(yī)“哮病”、“喘證” 范疇，中醫(yī)臨床分型較多，其中腎氣虛型所占比重較大。余鵬飛等［9］通過代謝組學(xué)分析腎氣虛證哮喘與健康人的尿液差異代謝物，發(fā)現(xiàn)26種物質(zhì)差異明顯。宋紅等［10］采用卵蛋白聯(lián)合游泳力竭法、恐傷腎雙因素復(fù)合法建立動物模型，利用核磁共振技術(shù)共鑒定出20種差異具有統(tǒng)計學(xué)意義的血清代謝物，其中異亮氨酸、谷氨酰胺、乳酸變化較為顯著，可作為哮喘腎氣虛證的潛在生物標(biāo)記物?？ㄒ郎碃柕龋?1］利用NMR和HPLC開展腎虛痰瘀型哮喘患者尿液代謝組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)中醫(yī)不同證型哮喘患者尿液代謝物有一定的差異。劉世剛等［12］發(fā)現(xiàn)哮喘虛寒證與虛熱證患者小分子代謝物有顯著差異，其中4—氨基丁酸最有可能是鑒別兩種證型的生物標(biāo)記物。此外還有研究［13-14］發(fā)現(xiàn)小兒支氣管哮喘發(fā)作期與健康兒童代謝物具有差異性，支氣管哮喘發(fā)作期不同證型間存在代謝標(biāo)記物與代謝通路基礎(chǔ)。這些研究選擇不同的樣本研究了哮喘不同的證型，發(fā)現(xiàn)患者與健康人之間的代謝物、不同證型之間的代謝物都有顯著的差異，從側(cè)面驗證了中醫(yī)的復(fù)雜性與整體性，也為中醫(yī)理論的現(xiàn)代化研究提供了理論依據(jù)。

3.2 肺癌

肺癌是我國發(fā)病率及病死率非常高的惡性腫瘤。管艷［15］采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，比較非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）脾虛痰濕證和其他證型血清蛋白質(zhì)組學(xué)的差異，分析出ITIH4、A1AT等6個差異蛋白可作為物質(zhì)基礎(chǔ)促進NSCLC脾虛痰濕證的辨證標(biāo)準(zhǔn)化。唐瑩等［16］研究肺癌中脾虛痰濕型與健康人的血清蛋白表達(dá)差異，通過2D-DIGE和MALDI-TOF-MS方法找到了HP、WDR5等7個蛋白可能作為肺癌脾虛痰濕型潛在的血清生物標(biāo)志物。周賢梅等［17］利用代謝組學(xué)技術(shù)分析痰濕蘊肺證和氣陰兩虛證的肺癌患者代謝物，發(fā)現(xiàn)了潛在的證候標(biāo)志物，其中7—四氫苯并噻吩等與肺癌痰濕蘊肺證具有高度相關(guān)性，1—（苯基磺?；?吡咯與肺癌氣陰兩虛證的聯(lián)系比較密切，這些都可能是證候生物標(biāo)記物為肺部腫瘤的臨床辨證提供數(shù)據(jù)，說明只要是不同的證型，即使是肺癌的同一病理類型，也會存在分子水平差異的情況。組學(xué)研究方法可以用于肺部腫瘤診斷，同時也可以探索肺部腫瘤不同中醫(yī)證型的臨床客觀化指標(biāo)。

3.3 肺結(jié)核

結(jié)核?。═B）是由結(jié)核分枝桿菌引起的一種慢性傳染病，是影響發(fā)展中國家公共衛(wèi)生的重大傳染疾病。生物標(biāo)志物對于肺結(jié)核的篩查、診斷、預(yù)后、療效判斷以及檢測十分重要。汪婷婷［18］通過蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果表明，共有39個差異蛋白質(zhì)在肺結(jié)核證候之間表現(xiàn)出顯著差異。提出GGH、JGHG3和HPT分別是肺結(jié)核肺陰虛證、陰虛火旺證、氣陰兩虛證的血清特異性蛋白質(zhì)。為肺結(jié)核病中醫(yī)證候提供了新生物學(xué)研究基礎(chǔ)及實驗依據(jù)。劉姬艷［19］釆用中醫(yī)“望聞問切”聯(lián)合舌脈儀機器對TB患者進行辨證分型，通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)建立血清蛋白指紋圖譜，通過代謝組學(xué)技術(shù)分離及純化潛在的生物標(biāo)志物蛋白，發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核不同證候具有獨特的差異蛋白峰，鑒定和驗證了載脂蛋白在肺結(jié)核證候中差異表達(dá)，可能為肺結(jié)核中醫(yī)證候分型的血清潛在標(biāo)志物之一。

3.4 其他呼吸系統(tǒng)疾病

除此之外，研究者也對其他呼吸系統(tǒng)疾病的證候進行了組學(xué)研究。

慢性阻塞性肺疾?。–OPD）是一種以氣流阻塞為特征，可進一步發(fā)展為肺心病和呼吸衰竭的常見慢性疾病?！秶H中醫(yī)臨床實踐指南 慢性阻塞性肺疾病》［20］將痰濁阻肺、痰熱雍肺證是COPD急性發(fā)作期常見證型。張瑞等［21］采用GC—TOFMS技術(shù)分析AECOPD痰濁壅肺型患者和健康人的血清代謝差異，發(fā)現(xiàn)了乳酸、琥珀酸、牛磺酸等17種差異代謝物可作為痰濁阻肺證的潛在證候標(biāo)記物。孫瑗［22］采用超高效液相色，譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，利用主成分分析、多維分析和單維分析相結(jié)合的辦法，發(fā)現(xiàn)COPD患者與健康人、痰熱壅肺證與非痰熱壅肺證之間的小分子差異代謝物各不相同，從代謝物層面反應(yīng)了“同病異治”的科學(xué)性。黃浩［23］采用液相色譜儀+質(zhì)譜儀分析社區(qū)獲得性肺炎（CAP）與健康人血漿中的內(nèi)源性差異代謝物發(fā)現(xiàn)CAP患者外周血中二氫睪酮、脫氫皮質(zhì)酮、二氫葉酸、甲基多巴、絲氨酸、組氨酸、脯氨酸上調(diào)，提示CAP在激素及蛋白質(zhì)代謝方面發(fā)生改變。鄭子安［24］運用iTRAQ標(biāo)記蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)LPS霧化吸入誘導(dǎo)小鼠胃腸積熱復(fù)合肺炎模型組與正常小鼠肺組織中有521種差異表達(dá)蛋白可作為胃腸積熱型肺炎潛在的證候標(biāo)記物，據(jù)此推測三羧酸循環(huán)功能的改變可能是胃腸積熱型肺炎的致病機制。特發(fā)性肺纖維化（IPF）是一種病因未明的特殊類型的慢性進展性纖維化型疾病，組織病理學(xué)及影像學(xué)表現(xiàn)為普通型間質(zhì)性肺炎。該病起病隱匿，主要臨床表現(xiàn)為逐漸加重的呼吸困難，伴刺激性干咳，最終病理轉(zhuǎn)歸致呼吸衰竭而致死［25］。古代中醫(yī)沒有相應(yīng)記載，后世醫(yī)家將其歸為“肺萎”、“肺痹”范疇。GUIOT J等［26］對IPF的血清生物標(biāo)志物在蛋白組學(xué)方面進行了研究，其中肺泡上皮標(biāo)志物包括KL-6、SP-A、SP-D，纖維發(fā)生和細(xì)胞外重塑標(biāo)志物包括基質(zhì)金屬蛋白酶1和7、賴氨酰氧化酶樣蛋白-2等，其他標(biāo)志物包括熱休克蛋白70等。但上述標(biāo)志物缺乏縱向研究，故難以運用于臨床。目前也未發(fā)現(xiàn)有關(guān)IFP在中醫(yī)證候方面的組學(xué)研究，還需要進一步的探索挖掘。

4 小結(jié)與思考

近幾年組學(xué)技術(shù)在用于研究呼吸系統(tǒng)疾病中醫(yī)證候本質(zhì)領(lǐng)域取得了一系列進展。在不同疾病不同證型方面都進行了初步的證候物質(zhì)基礎(chǔ)探索，并且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了相關(guān)證候生物標(biāo)記物，為呼吸系統(tǒng)疾病中醫(yī)證候的客觀化、指標(biāo)化以及證候本質(zhì)的研究找到了前沿的、先進的現(xiàn)代技術(shù)平臺。但組學(xué)研究也存在一些問題。首先，大部分研究采用一種組學(xué)技術(shù)，例如肺結(jié)核、肺纖維化以蛋白組學(xué)研究為主，哮喘和COPD則以代謝組學(xué)研究為主，只有肺炎與肺部腫瘤均涉及了蛋白組學(xué)與代謝組學(xué)研究，而還未發(fā)現(xiàn)有關(guān)基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)在呼吸系統(tǒng)疾病中醫(yī)證候的研究，將證候總結(jié)為單一層面的紊亂，具有一定局限性；其次，許多研究均針對同一呼吸系統(tǒng)疾病的一種中醫(yī)證候進行研究，而疾病癥狀復(fù)雜變化多樣，證候分類多，這些研究尋找到的差異性生物標(biāo)記物并不能全方位、準(zhǔn)確的表征這一證候，需收集更多樣本，對各證候間進行對比。故擴大樣本量、建立中醫(yī)證候組學(xué)數(shù)據(jù)庫及多種組學(xué)技術(shù)聯(lián)合運用將有助于揭示中醫(yī)證候的生物學(xué)本質(zhì)，推動中醫(yī)藥向精準(zhǔn)治療發(fā)展。