金剛丸對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型大鼠NF-κB p65表達及IL-1、IL-6、TNF-α的影響*

陳 杰，沈琳玲，戎 寬，朱亮亮，葉子豐，匡浩銘，匡建軍

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208；2.湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410006；3.湖南省中醫(yī)藥研究院，湖南 長沙 410006)

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松(postmenopausal osteoporosis，PMOP)是生活中十分常見的一種疾病，好發(fā)于更年期后的絕經(jīng)后女子，由于女子在絕經(jīng)后卵巢功能逐步萎縮，導(dǎo)致雌激素釋放能力降低、內(nèi)分泌發(fā)生改變，可引起骨量丟失、骨強度降低、骨組織結(jié)構(gòu)損壞、骨質(zhì)易脆，骨折風(fēng)險風(fēng)險明顯增高[1]。當(dāng)婦女體內(nèi)雌激素水平下降，引起相關(guān)免疫反應(yīng)增強、T細胞增殖，炎癥因子大量分泌[2]，大量研究表明[3]IL-1、IL-6、TNF-α等炎癥因子對破骨細胞的生成與活化起著重要作用，同時亦有研究表明[4]NF-κB家族是與破骨細胞的生成與活化密切相關(guān)。由于PMOP西藥治療有一定的不良反應(yīng)，開展PMOP的中醫(yī)藥治療有著深遠意義。在中醫(yī)理論中PMOP癥屬“骨痿”，病機以腎虛為主，當(dāng)治以補腎壯骨。金剛丸在臨床應(yīng)用中，治療PMOP療效較好。本研究通過去卵巢法建立絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型，觀察金剛丸對其血清中IL-1、IL-6、TNF-α含量及NF-κB p65表達的影響，以探索金剛丸治療PMOP的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選用56只6月齡SPF級Sprague-Dawley(SD)未經(jīng)產(chǎn)雌性大鼠，體重(300±20)g，動物來源：湖南省中醫(yī)藥研究院實驗動物中心，動物許可證號批號：43602500000352。

1.2 實驗藥物 金剛丸：具有補腎生津、溫陽益髓之功。將酒浸肉蓯蓉、酒浸菟絲子、鹽炒杜仲、萆薢各120 g等分為細末，隨后通過與酒煮豬腰子蜜制成丸。(藥物來源：陜西天洋制藥有限公司生產(chǎn)；藥品批準文號：Z61020726，丸劑，成人劑量：每日2次，每次1丸，每丸3.5 g)。戊酸雌二醇片(法國 DELPHARM Lille S.A.S.生產(chǎn)；藥品批號：219A；成人劑量：每日1次，每次1粒，每粒1mg)。

1.3 實驗試劑 10%水合氯醛(上海山浦 批號：20191016)、IL-1試劑盒(酶聯(lián)生物 批號：ml037373)、IL-6試劑盒(酶聯(lián)生物 批號：ml102828)、TNF-α試劑盒(酶聯(lián)生物 批號：ml002859)、P65抗體(英國abcam 批號：ab16502)、石蠟(Sigma)、中性樹膠(Sigma)、蘇木素(Wellbio)、PBS(7.2-7.6)(Wellbio)、伊紅(Wellbio)。

1.4 實驗儀器

名稱廠家全稱貨號臺式高速冷凍離心機湖南湘儀H1650R搖床中國江蘇其林貝爾TS-1電泳儀中國北京六一DYY-6C轉(zhuǎn)膜儀中國北京六一DYCZ-40D磁力攪拌器中國雷磁JB-13普通冰箱中國奧克斯BCD-196A電磁爐荷蘭飛利浦HD4925精密PH計中國雷磁PHS-3C電子天平美國雙杰JJ224BC化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)廣州勤翔Chemiscope6100

1.5 方法

1.5.1 造模方法 模型組：用百分之十水合氯醛(0.3 mL/100 g)，針對40只雌性SD大鼠采用腹腔內(nèi)麻醉的方式來展開實驗。在手術(shù)臺上用剃毛器備皮后進行消毒。在大鼠最下的肋骨水平、腹中線左/右側(cè)旁開2～3 cm做一豎行切口，在進入腹腔后可以發(fā)現(xiàn)一乳白色脂肪團，鈍性剝離后找到卵巢。在子宮及卵巢之間，用手術(shù)線結(jié)扎后摘除卵巢。假手術(shù)組：8只大鼠做同樣的手術(shù)切口，切除同等重量脂肪組織后立即縫合切口。術(shù)后連續(xù)3天，予以每只手術(shù)大鼠8萬單位青霉素(1次/天)防止感染。

1.5.2 分組方法 進行1周適應(yīng)性喂養(yǎng)后，把56只SD大鼠劃分為空白組(NtCn=8)、假手術(shù)組(SHAMn=8)、去勢大鼠組(OVXn=40)。模型驗證完成后，采用隨機數(shù)字表法把40只去勢大鼠均等的劃分為模型組、戊酸雌二醇組、金剛丸低劑量組、金剛丸中劑量組、金剛丸高劑量組共5組大鼠。

1.5.3 干預(yù)方法 各組每天上午灌胃給藥1次，根據(jù)《藥理實驗方法學(xué)》[5]中的方法，依據(jù)人類和大鼠表面體積存在差異來進行有效核算。具體方案如下：

組別生藥含量水溶液含量戊酸雌二醇組0.09mg·kg-1·d-10.009mg·mL-1金剛丸低劑量組1.8 g·kg-1·d-10.18 g·mL-1金剛丸中劑量組3.6 g·kg-1·d-10.36 g·mL-1金剛丸高劑量組7.2 g·kg-1·d-10.72 g·mL-1

對假手術(shù)組、空白組、模型組大鼠采用1 mL/100 g的蒸餾水灌胃。各組一共灌胃治療12周，每周6天，密切監(jiān)測體重變化，及時調(diào)節(jié)給藥劑量。

1.5.4 標本制作方法 給藥后12周取材。用水合氯醛實施麻醉后，開腹找到腹主動脈，使用真空采血管收集血液標本。把收集的全血標本放置于室溫中靜置，離心后收集血清以用于檢測。隨后剪斷大鼠腹主動脈，再取雙側(cè)脛骨，以4%中性多聚甲醛固定，封口袋密封后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 實驗指標測定 用HE染色法觀察骨組織形態(tài)，ELISA法檢測血清IL-1、IL-6、TNF-α含量，Western Blot法檢測大鼠股骨NF-κB p65的表達。

2 結(jié)果

2.1 金剛丸對大鼠骨組織形態(tài)的影響 HE染色結(jié)果顯示：正常組和假手術(shù)組骨小梁形態(tài)完整、無明顯斷裂，骨髓腔正常，骨細胞排列均勻；模型組骨小梁形態(tài)模糊、廣泛斷裂，骨髓腔增寬，骨細胞排列散亂；戊酸雌二醇組、金剛丸高、中、低劑量組可見骨小梁形態(tài)較模型組改善、結(jié)構(gòu)較為緊密，骨髓腔減小，骨外膜排列較為齊整。見圖1。

圖1 金剛丸對大鼠骨組織形態(tài)的影響(HE，×100)

2.2 金剛丸對大鼠血清TNF-α的影響 相較于空白組和假手術(shù)組對比分析而言，模型組及各給藥組血清IL-1、IL-6、TNF-α含量均上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；相較于模型組相對比分析而言，各給藥組血清IL-1、IL-6、TNF-α含量均下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；相較于戊酸雌二醇組、金剛丸中、低劑量組比較分析而言，金剛丸高劑量組血清IL-1、IL-6、TNF-α含量顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；金剛丸高劑量組與其余各給藥組相比較而言，對血清IL-1、IL-6、TNF-α的抑制作用更為突出。見表1。

表1 金剛丸對大鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α的影響

2.3 金剛丸對大鼠股骨NF-κB p65表達的影響 相較于空白組和假手術(shù)組對比分析而言，模型組股骨p65含量明顯上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；相較模型組對比分析而言，各給藥組股骨p65含量均有所下降，其中戊酸雌二醇組、金剛丸高劑量組下降明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。金剛丸高、中、低劑量組組間比較，高劑量組股骨p65含量比中劑量組低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，中劑量組股骨p65含量比低劑量組低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。隨著金剛丸藥物濃度的升高，股骨p65含量呈下降趨勢。見表2、圖2。

表2 金剛丸對大鼠股骨NF-κB p65表達的影響

圖2 金剛丸對大鼠股骨組織中蛋白電泳的影響

3 討論

PMOP隨著中國老齡化加劇發(fā)病率也隨之快速升高，越來越多的中老年絕經(jīng)后女性遭此病困擾。當(dāng)女性絕經(jīng)后機體內(nèi)雌激素分泌量會迅速降低，進而引起骨代謝紊亂、骨量減少、骨脆性增加，其臨床表現(xiàn)多樣，以全身關(guān)節(jié)疼痛、骨骼退化變形、脆性骨折最為常見[6]。由骨形成和骨吸收構(gòu)成的骨重建，發(fā)生于人體生命的每個階段，當(dāng)破骨細胞超過成骨細胞主導(dǎo)的骨形成后OP隨即發(fā)生。在正常人體代謝過程中，成骨與破骨所需時間完全不同，相較于破骨細胞而言成骨細胞需要消耗更多的時間才能有效的實現(xiàn)同等量的骨形成[7]。因此抑制破骨細胞活性、降低破骨細胞功能、減少骨吸收在抗骨質(zhì)疏松治療過程中占重要地位。依據(jù)大量研究得到結(jié)果顯示[8-9]，IL-1、IL-6、TNF-α等炎癥因子和NF-κB信號通路對于調(diào)節(jié)骨細胞功能以及促進機體機能具有重要的現(xiàn)實意義。

絕經(jīng)后女性卵巢功能減退，體內(nèi)雌激素分泌驟然減少，相關(guān)免疫活動隨之增強，大量炎性因子被釋放到體內(nèi)，機體長期處于慢性炎癥環(huán)境之中[10]。有研究顯示[3]，炎性因子促進骨吸收的機制可能在于其作用于間質(zhì)干細胞和破骨細胞前體，加快了破骨細胞分化成熟。IL-1、TNF-α均可誘導(dǎo)核因子-κB受體活化因子配體(RANKL)分泌增加，核因子-κB受體活化因子(RANK)與RANKL結(jié)合后可激活NF-κB信號通路，促使破骨細胞成熟。IL-6對PMOP有著雙重調(diào)節(jié)作用，既能增強骨的形成，也能促進骨的吸收，總的來說，促進骨吸收作用大于骨形成[11]。NF-κB是體內(nèi)調(diào)控細胞增殖分化及炎癥的重要轉(zhuǎn)錄因子，NF-κB信號通路在沒有被激活時，NF-κB抑制因子IκBα與NF-κB緊密結(jié)合在一起，分布于胞質(zhì)中。當(dāng)RANKL與RANK相結(jié)合后在受體因子的影響作用下IκBα激酶 IKKs被活化，IKKs分解IκBα，促使其與NF-κB分離，NF-κB隨即移動到細胞核內(nèi)，能夠參與到骨細胞的生長調(diào)節(jié)中[12]。NF-κB家族有五個成員，NF-κB p65是其中之一，有研究表明[13]：NF-κB p65與骨密度(BMD)呈負相關(guān)。因此，NF-κB p65在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的病理過程中起到了重要作用，它將可能成為研究藥物對PMOP治療作用的新靶點。

PMOP是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)上的名稱，中醫(yī)典籍中尚未找到該疾病名稱的明確記錄，根據(jù)全身骨痛、乏力、肢體痿軟等臨床表現(xiàn)，“骨痹”、“骨痿”的癥狀與其十分相似。結(jié)合臟腑、八綱、氣血精液辨證，該病涉及腎、肝、脾等多個臟腑，病機總屬本虛標實，腎精虧虛、肝郁血虛在中醫(yī)中屬于常見的虛證證型，其中腎精虧虛尤為緊要[14]。腎主骨，乃先天之本，腎精充沛則髓化生有源，骨質(zhì)得養(yǎng)[15]。石敏等研究[16]指出：中醫(yī)“腎”在臨床中能夠顯著地作用于OPG/RANK/RANKL等信號通路并直接參與到調(diào)解中，骨的生長發(fā)育和代謝與其之間是密切關(guān)聯(lián)的，腎精虧虛則骨髓化生無源，導(dǎo)致PMOP發(fā)生。金剛丸是補腎經(jīng)典方，全方包含的中藥材為肉蓯蓉、菟絲子、杜仲、萆薢、酒煮豬腰。菟絲子性味辛甘，有補腎益精填髓的作用，現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)[17]：其主要活性成分菟絲子黃酮可通過下調(diào)Bax蛋白表達，上調(diào)Bcl-2、OPG蛋白表達，進而抑制成骨細胞凋亡；肉蓯蓉味甘咸、性溫，有補腎陽益精血的功效，朱剛等[18]研究發(fā)現(xiàn)：肉蓯蓉醇提物可以上調(diào)OP模型大鼠骨鈣素、鈣離子及血清堿性磷酸酶水平，進而提高大鼠股骨生物力學(xué)功能；杜仲性味甘溫，入肝腎經(jīng)，善于補肝腎、強筋骨，研究發(fā)現(xiàn)[19]：杜仲不僅能促進成骨細胞活化進而促進骨形成，且可以遏制炎癥因子活性，降低其對骨破壞的誘導(dǎo)作用；萆薢味苦，善于分清泄?jié)?，祛腎濁而留腎精，藥理研究[20]認為其可從分子水平對成骨細胞UMR106促增殖活，抑制破骨樣多核細胞形成；配豬腰子血肉有情之品，暖腎以補先天之氣，酒煮后助行藥力，加強補腎功效。諸藥聯(lián)合，共同發(fā)揮補腎健骨、填精生髓的功效。

本研究采用3個梯度的金剛丸濃度及陽性對照藥戊酸雌二醇片干預(yù)模型大鼠，在干預(yù)12周后檢測大鼠血清中IL-1、IL-6、TNF-α的含量及股骨組織中NF-κB p65的含量。研究結(jié)果顯示，戊酸雌二醇組、金剛丸高、中、低劑量組可見骨小梁形態(tài)較模型組改善、結(jié)構(gòu)較為緊密，骨髓腔減小，其中金剛丸高劑量組改善明顯，骨外膜排列整齊?？梢娊饎偼杩擅黠@改善骨組織形態(tài)。金剛丸能降低大鼠血清中IL-1、IL-6、TNF-α含量和股骨組織NF-κB p65的蛋白表達，降低骨質(zhì)疏松大鼠炎癥程度，參與調(diào)控成骨細胞與破骨細胞的增殖和分化，這可能是金剛丸能夠緩解PMOP臨床癥狀的重要因素。且其作用對于金剛丸呈現(xiàn)一定劑量依賴性?？偠灾狙芯孔C實金剛丸能降低IL-1、IL-6、TNF-α含量、下調(diào)NF-κB p65表達水平，其治療作用與藥物濃度呈正相關(guān)，初步闡釋了金剛丸抗骨質(zhì)疏松的作用機制。