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    基于JNK通路研究改良型富血小板纖維蛋白與β-三磷酸鈣復(fù)合物誘導(dǎo)成骨的機制

    2022-12-07 07:40:12付冬梅李素蘭
    當代醫(yī)藥論叢 2022年22期
    關(guān)鍵詞:骨組織成骨復(fù)合物

    付冬梅,王 浪,周 婧,王 勁,楊 昕,李素蘭,蘭 紅

    (資陽市雁江區(qū)人民醫(yī)院口腔科,四川 資陽 641300)

    骨缺損的傳統(tǒng)治療方法有骨水泥+ 螺釘技術(shù)、自體骨移植、同種異體骨移植等,但均存在愈合速度慢、療效差等缺點,因此近年來發(fā)展迅速的骨組織工程開始應(yīng)用于骨缺損的修復(fù)治療中[1]。雖然在骨缺損處植入骨組織材料對骨缺損的修復(fù)具有促進作用,但大部分骨代替材料只有引導(dǎo)成骨作用,材料成本昂貴,且存在免疫反應(yīng)和疾病傳播的風(fēng)險[2]。本團隊前期研究發(fā)現(xiàn),利用血液濃聚物中提取的生物材料進行改良富血小板纖維蛋(A-PRF)被證實可促進軟硬組織的愈合及再生,與β- 三磷酸鈣(β-TCP)結(jié)合為復(fù)合物后能有效應(yīng)用于口腔頜面外科、整形外科、運動醫(yī)學(xué)、牙周病學(xué)等多個領(lǐng)域[3]。作為改良型復(fù)合物,A-PRF 與β-TCP 復(fù)合物在誘導(dǎo)成骨方面已被證實效果比普通PRF 更佳,但詳細機制尚未明確。有研究發(fā)現(xiàn),c-Jun 氨基末端蛋白激酶(JNK)通路對骨分化與骨形成有促進作用,也能誘導(dǎo)骨形成蛋白(BMPs)的合成,促進成骨。目前發(fā)現(xiàn)骨形成蛋白2(BMP-2)可通過干預(yù)JNKs 而增加調(diào)控成骨的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Osx 的表達,而骨形成蛋白9(BMP-9)是目前已知的BMPs 誘導(dǎo)成骨中最強的因子,BMP-9 具有促進干細胞體內(nèi)外成骨的作用[4-5]。因此我們猜測A-PRF 與β-TCP 復(fù)合物可能通過調(diào)節(jié)JNK 通路產(chǎn)生誘導(dǎo)成骨的作用。為此,本研究基于JNK 通路研究A-PRF 與β-TCP 復(fù)合物對兔股骨缺損區(qū)域的誘導(dǎo)成骨效果,為臨床治療骨缺損提供實驗基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物

    雄性新西蘭大白兔24 只,5 ~6 月齡,體重(3±0.5)kg,購自成都達碩實驗動物有限公司,生產(chǎn)許可證號:SCXK(川)2020-030,使用許可證號:SYXK(川)2019-189。

    1.2 試劑

    A-PRF 由資陽市雁江區(qū)人民醫(yī)院提供;β-TCP購自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司;兔堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素(OCN)Elisa 試劑盒均購自上海茁彩生物科技有限公司;BMP-9、JNK、p-JNK抗體均購自艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司。

    1.3 儀器

    Multiskan Sky 酶 標 儀、CX33 顯 微 鏡( 日 本Olympus 公司)、電泳儀、凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)。

    1.4 主要實驗方法

    1.4.1 構(gòu)建兔股骨缺損模型與給藥處理[6]將動物分為模型組、1:1 復(fù)合物組(A-PRF:β-TCP=1:1)、2:1 復(fù)合物組(A-PRF:β-TCP=2:1)與4:1 復(fù)合物組(A-PRF:β-TCP=4:1)四組,每組各6 只。各組動物均靜脈注射3% 戊巴比妥鈉溶液(1 mL/kg)進行麻醉,在后肢膝關(guān)節(jié)外側(cè)距前緣1.0cm 處做一弧形切口,長度約為5cm。暴露股骨外側(cè)髁后,用骨鉆制備直徑為6 mm、深約8 mm 的圓柱形骨缺損區(qū)域,同時在距離骨缺損中央約6 mm 處,左右對稱旋入1 枚直徑為2 mm的鈦釘進行定位。復(fù)合物組在骨缺損區(qū)域填充0.5 mL復(fù)合物,模型組不進行填充。各組動物均使用醫(yī)用膠原修復(fù)膜覆蓋切口處,之后每天肌內(nèi)注射80 萬U 青霉素鈉進行抗感染治療,持續(xù)3d。8 周后處死動物采集指標進行后續(xù)檢測。

    1.4.2 大致觀察 術(shù)后觀察各組動物切口愈合的狀況,有無感染發(fā)生及飲食、活動狀況;術(shù)后8 周肉眼觀察骨缺損處的修復(fù)效果。

    1.4.3 病理學(xué)檢測 采集各組動物股骨缺損區(qū)域組織,用4% 多聚甲醛固定24 h,脫鈣、脫水后制成石蠟切片,采用蘇木精- 伊紅(HE)染色法對切片進行染色,觀察骨缺損區(qū)域的愈合情況與新生血管的形成情況。

    1.4.4 酶聯(lián)免疫吸附(Elisa) 檢測采集各組動物血液,分離血清,按照免疫酶聯(lián)試劑盒說明書對樣本進行檢測操作,檢測兔血清中ALP 和OCN 的含量。

    1.4.5 蛋白質(zhì)免疫印跡(WesternBlot) 檢測將收集的各組動物股骨組織置于液氮中研磨,進行蛋白質(zhì)提取與定量,依次進行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、顯影處理,最后使用凝膠成像系統(tǒng)對條帶進行分析,計算蛋白質(zhì)的表達水平。

    1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

    采用SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析,計量資料以±s表示,組間比較采用單因素方差分析,進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 不同比例的APRF 與β-TCP 復(fù)合物對兔股骨缺損的修復(fù)效果

    肉眼觀察發(fā)現(xiàn),模型組股骨缺損處修復(fù)尚未完全,2:1 復(fù)合物組缺損區(qū)域基本恢復(fù),效果最佳,其次為4:1 復(fù)合物組與1:1 復(fù)合物組。HE 染色發(fā)現(xiàn),模型組骨組織損傷區(qū)域明顯,纖維組織增生情況嚴重,細胞核呈長梭形,炎性細胞浸潤數(shù)量多,新生毛細血管形成數(shù)量少;1:1 復(fù)合物組骨組織損傷區(qū)域明顯,植入材料分布明顯,組織與材料之間出現(xiàn)少量纖維組織,炎性細胞浸潤數(shù)量較多,淋巴細胞和中性粒細胞少量聚集,新生毛細血管形成數(shù)量少;2:1 復(fù)合物組骨組織之間損傷區(qū)域基本消失,可見少量植入材料分布,材料與骨組織之間出現(xiàn)較多纖維組織,炎性細胞浸潤數(shù)量較少,大多數(shù)為淋巴細胞,同時可見大量新生毛細血管形成;4:1 復(fù)合物組骨組織之間損傷區(qū)域較少,可見少量植入材料分布,材料與骨組織之間出現(xiàn)纖維組織,可見炎性細胞浸潤,新生毛細血管形成數(shù)量較多。結(jié)果見圖1。

    圖1 四組動物股骨缺損區(qū)域修復(fù)情況與病理學(xué)觀察結(jié)果(HE 染色)

    2.2 不同比例的APRF 與β-TCP 復(fù)合物對兔血清OCN 與ALP 的影響

    Elisa 檢測結(jié)果顯示,與模型組相比,復(fù)合物組血清中ALP 與OCN 的含量均顯著升高(P<0.05),復(fù)合物比例為2:1 時升高幅度最大。結(jié)果見表1。

    表1 四組動物血清中ALP 與OCN 含量的變化情況(± s)

    表1 四組動物血清中ALP 與OCN 含量的變化情況(± s)

    注:* 與模型組相比,P <0.05 ;** 與模型組相比,P <0.01。

    組別 ALP OCN模型組(n=6) 28.43±2.88 10.46±0.81 1:1 復(fù)合物組(n=6) 47.83±5.58** 14.45±1.83**2:1 復(fù)合物組(n=6) 70.25±3.04** 21.55±2.99**4:1 復(fù)合物組(n=6) 61.93±2.55** 19.58±2.11**

    2.3 不同比例的APRF 與β-TCP 復(fù)合物對兔新生骨組織中JNK 通路的影響

    WesternBlot 檢測結(jié)果顯示,與模型組相比,復(fù)合物組新生骨組織中BMP-9 與p-JNK 蛋白的表達水平均顯著升高(P<0.05),其中2:1 復(fù)合物組BMP-9、p-JNK 蛋白表達水平變化最大,JNK 蛋白表達水平則無明顯變化。結(jié)果見表2。

    表2 四組動物新生骨組織中BMP-9、JNK 和p-JNK 蛋白的表達情況(± s)

    表2 四組動物新生骨組織中BMP-9、JNK 和p-JNK 蛋白的表達情況(± s)

    注:* 與模型組相比,P <0.05 ;** 與模型組相比,P <0.01。

    組別 BMP-9 JNK p-JNK模型組(n=6) 1.000±0.012 1.000±0.059 1.000±0.020 1:1 復(fù)合物組(n=6) 1.375±0.068** 1.008±0.028** 1.409±0.066**2:1 復(fù)合物組(n=6) 1.934±0.106** 0.982±0.028** 2.488±0.047**4:1 復(fù)合物組(n=6) 1.563±0.044** 0.936±0.016** 1.775±0.029**

    3 討論

    生物復(fù)合材料介導(dǎo)的骨再生技術(shù)是一種很有前景的骨再生治療策略。我們的前期研究發(fā)現(xiàn),A-PRF 與β-TCP 在促成骨中可發(fā)揮重要作用,但A-PRF 與β-TCP 復(fù)合物促進骨形成的潛在機制尚不清楚。本實驗通過建立兔股骨缺損模型發(fā)現(xiàn),A-PRF 與β-TCP復(fù)合物能通過激活JNK 通路、誘導(dǎo)BMP-9 蛋白表達,產(chǎn)生骨修復(fù)作用,當A-PRF 與β-TCP 構(gòu)成比例為2:1 時誘導(dǎo)效果最明顯。ALP 是常見的成骨分化標志物[7],通過成骨細胞分泌,促進鈣、磷沉積在骨骼中,其含量的高低可反映成骨細胞的成骨能力[8]。OCN 是成骨分化過程中最敏感的指標之一,一方面可以提高ALP 的活性并加速與之結(jié)合,促進成骨細胞的增殖與骨形成;另一方面,OCN 與鈣離子結(jié)合對促進骨沉積和骨生長有積極作用[9]。有研究發(fā)現(xiàn),OCN 的活性與成骨細胞分化和破骨細胞凋亡呈正相關(guān)[10-11]。因此,OCN 的高表達可增加骨基質(zhì),增強骨質(zhì)。本研究發(fā)現(xiàn),在骨缺損區(qū)域填充A-PRF 與β-TCP 復(fù)合物8 周后,新生骨組織中的ALP 與OCN 含量均顯著上升,復(fù)合物比例為2:1 時效果最好,說明在該比例下的A-PRF 與β-TCP 復(fù)合物誘導(dǎo)骨形成的效果最佳。MAPK 家族主要有三個亞家族,即細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)、JNK 和p38。多項研究表明JNK 信號通路在調(diào)控成骨分化中發(fā)揮關(guān)鍵作用,JNK 磷酸化參與了成骨過程,大麻素受體通過激活JNK 通路可增強牙周韌帶干細胞的骨/ 牙本質(zhì)分化能力[12],褐藻多糖通過激活JNK 通路可誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細胞成骨分化[13]。在JNK 參與成骨分化的調(diào)控因素中,BMPs 的作用是至關(guān)重要的,BMP-9 被認為是最具成骨能力的BMP,比BMP-2 表現(xiàn)出更多的骨再生潛能。自BMP-9 被發(fā)現(xiàn)以來,因其比其他BMP 家族成員具有更高的促進骨形成的能力而受到廣泛關(guān)注[14-15]。有研究通過比較發(fā)現(xiàn),與其他BMP 相比,BMP-9 能更有效地增強ALP活性,誘導(dǎo)滑膜間充質(zhì)干細胞成骨分化,導(dǎo)致ALP、Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runx2)、OCN、骨橋蛋白(OPN)mRNA 和蛋白的表達水平升高[16]。本研究發(fā)現(xiàn),A-PRF與β-TCP 復(fù)合物能誘導(dǎo)新生骨組織中顯著增加JNK蛋白磷酸化水平,激活JNK 通路,從而增加BMP-9蛋白的表達,誘導(dǎo)成骨分化與骨形成。

    綜上所述,本研究證實A-PRF 與β-TCP 組成的復(fù)合物可通過激活JNK 信號通路促進股骨缺損區(qū)域成骨,這可能是該復(fù)合物促進成骨的機制之一,且構(gòu)成比例為2:1 時效果最佳。但由于JNK 通路與BMP-9蛋白刺激的骨形成涉及許多信號通路,因此A-PRF與β-TCP 復(fù)合物在骨再生技術(shù)中所起的骨形成作用機制還有待于進一步研究與發(fā)掘。

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