海分枝桿菌的研究進(jìn)展

顧安康，張 宇

(天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院 1. 病理科； 2. 皮膚科，天津 300120)

海分枝桿菌(Mycobacteriummarinum)是一種眾所周知的引起皮膚和軟組織感染的致病分枝桿菌，在非結(jié)核分枝桿菌(non-tuberculousMycobacterium，NTM)中，是人類非呼吸系統(tǒng)感染的首要病因[1]。早期對(duì)海分枝桿菌的研究主要是由于其與結(jié)核分枝桿菌的遺傳相關(guān)性[2]，以及金魚(鯽魚)中海分枝桿菌的試驗(yàn)性感染模仿了肺結(jié)核的發(fā)病機(jī)制。目前很多研究[3-4]報(bào)道了臨床領(lǐng)域出現(xiàn)的皮膚感染病例，與水族箱或海產(chǎn)品有關(guān)活動(dòng)擴(kuò)大相關(guān)。但至今對(duì)海分枝桿菌的認(rèn)識(shí)仍有不足，其感染后引起的臨床表現(xiàn)有較大差異，給臨床診斷和治療帶來(lái)巨大挑戰(zhàn)，現(xiàn)對(duì)海分枝桿菌的研究進(jìn)展作一綜述。

1 生物學(xué)特征

海分枝桿菌在顯微鏡下與結(jié)核分枝桿菌難以區(qū)分[1]，海分枝桿菌是一種多形桿菌(1.0～4.0 μm×0.2～0.6 μm)，無(wú)芽孢形成，無(wú)動(dòng)力桿菌，真分枝，抗酸染色菌體呈紅色，類脂含量高。其菌落通常光滑或介于光滑與粗糙之間，在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)不見光時(shí)為白色或米黃色，光照后變?yōu)辄S色或橙色，根據(jù)《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》及Runyon分類法，屬Ⅰ類-緩慢生長(zhǎng)型光產(chǎn)色菌[5]，光致變色是由于crtb基因介導(dǎo)的亮黃色β-胡蘿卜素的活躍產(chǎn)生，并且該變色特性可以被氯霉素所抑制[6]。

海分枝桿菌與其他分枝桿菌一樣，是一種嚴(yán)格的需氧菌，首選的碳源是甘油、丙酮酸和葡萄糖，但乙醇亦可[1]。最佳的培養(yǎng)溫度是30～33℃，在35～37℃的溫度下保持靜態(tài)，更高的溫度下則失去生存能力[5]。海分枝桿菌在所有用于分枝桿菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中，包括Middlebrook 7H10、L?wenstein-Jensen(固體培養(yǎng)基)等均可生長(zhǎng)[7]，培養(yǎng)基上方2%～5%的二氧化碳?xì)庀嗫纱倨渖L(zhǎng)[1]。在原代培養(yǎng)基中，需要幾周的時(shí)間才能獲得陽(yáng)性培養(yǎng)物；在傳代培養(yǎng)中，生長(zhǎng)速度為1～2周，由于海分枝桿菌快速適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室條件的能力，可以縮短至4～5 d[1]。海分枝桿菌攜帶單個(gè)rRNA操縱子，其小亞基16S rRNA序列包含緩慢生長(zhǎng)分枝桿菌的基因特征，因此屬于緩慢生長(zhǎng)分枝桿菌屬[7]?；蚪M分析表明，生長(zhǎng)緩慢的物種中編碼氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)/代謝(例如livFGMH操縱子)和轉(zhuǎn)錄的基因以及ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白操縱子的缺失，致使氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)受到抑制，從而出現(xiàn)緩慢生長(zhǎng)物種的生物學(xué)特征和致病性[8]。

2 基因組的一般特征

目前海分枝桿菌至少有15個(gè)菌株亞型被發(fā)現(xiàn)，其中菌株M型以魚和人類為主要宿主，已從人體感染的標(biāo)本分離和培養(yǎng)出，其完整基因組于2008年發(fā)布[9]，基因組長(zhǎng)度為6.5 Mb，大于結(jié)核分枝桿菌(4.4 Mb)、麻風(fēng)分枝桿菌(3.3 Mb)和潰瘍分枝桿菌(5.8 Mb)的長(zhǎng)度，平均G/C含量為62.5%，擁有5 424蛋白質(zhì)編碼DNA序列和65個(gè)假基因，46個(gè)tRNA基因，1個(gè)rRNA操縱子和1個(gè)23 kb耐汞質(zhì)粒。研究[10]表明，海分枝桿菌和結(jié)核分枝桿菌基因組的相似性超過(guò)85%，共有3 000個(gè)直系同源基因。根據(jù)16S rRNA、編碼RNA聚合酶β亞單位編碼基因(rpoB)和65 kDa熱休克蛋白(hsp65)的系統(tǒng)發(fā)育樹分析，海分枝桿菌與結(jié)核分枝桿菌是關(guān)系最密切的兩個(gè)菌種(連同潰瘍分枝桿菌)之一，是結(jié)核分枝桿菌屬的一個(gè)分支。而海分枝桿菌與潰瘍分枝桿菌基因組核苷酸序列的同源性高達(dá)98%以上，依據(jù)用于物種識(shí)別的管家基因和結(jié)構(gòu)基因[如核糖體操縱子序列和rpoB、DNA螺旋酶(gyrA和gyrB)、16S rRNA/16S-23S rRNA ITS序列以及hsp65]無(wú)法將海分枝桿菌與潰瘍分枝桿菌區(qū)別開來(lái)，二者的區(qū)別為潰瘍分枝桿菌產(chǎn)生分枝桿菌內(nèi)酯(A/B/C/D)和含有超過(guò)300拷貝的兩個(gè)插入序列IS2404和IS2406[1]。研究[11]結(jié)果顯示，海分枝桿菌似乎是潰瘍分枝桿菌的祖先，其獲得了分枝桿菌內(nèi)酯生物合成的基因質(zhì)粒和隨后產(chǎn)生分枝桿菌內(nèi)酯的能力，是物種形成的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)力，因此，海分枝桿菌與潰瘍分枝桿菌一起構(gòu)成潰瘍分枝桿菌-海分枝桿菌復(fù)合體(M.ulcerans-M.marinum)。

3 菌株的致病性和毒力

海分枝桿菌與其他分枝桿菌一樣，是公認(rèn)的兼性細(xì)胞內(nèi)病原體，不產(chǎn)生內(nèi)部和外部毒素，也不會(huì)產(chǎn)生侵入性酶[12]，其致病性由菌體成分引起，在不與溶酶體融合的非酸性(pH為6.1～6.5)吞噬體中增殖。ESX(ESAT-6 secretion system)位點(diǎn)是編碼專門的ATP依賴性分泌器官的大型基因簇，通過(guò)分泌某些效應(yīng)因子參與毒力，海分枝桿菌至少具有5個(gè)ESX ATP依賴性蛋白分泌系統(tǒng)，稱為ESX-1、ESX-3、ESX-4、ESX-5和ESX-6[9]，研究最深入的是ESX-1，其分泌的效應(yīng)因子包括早期分泌靶向抗原(early secreting antigen target 6，ESAT-6，6 kD)和培養(yǎng)濾過(guò)蛋白肽段庫(kù)(culture filtrate protein 10，CFP-10，10 kD)，這是結(jié)核分枝桿菌和海分枝桿菌的主要毒力決定簇，在這兩個(gè)物種間具有高度保守性[10，13]。其關(guān)鍵功能之一是誘導(dǎo)吞噬體膜的破裂，目前的模型表明分泌性底物ESAT-6是吞噬體滲透所必需的，隨后細(xì)菌DNA被動(dòng)泄漏到宿主細(xì)胞質(zhì)，被循環(huán)GMP-AMP合成酶(cGAS)和干擾素刺激因子檢測(cè)出，以誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生[14]。海分枝桿菌也表達(dá)ESX-5分泌系統(tǒng)，目前已經(jīng)證實(shí)有100多種外膜通道蛋白PE/PPE家族的蛋白質(zhì)通過(guò)ESX-5系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)[15]。Weerdenburg等[16]報(bào)道ESX-5缺陷的海分枝桿菌在斑馬魚胚胎中毒力顯著降低，表明ESX-5也是一個(gè)重要的毒力因子。分枝桿菌屬(結(jié)核分枝桿菌)的另一個(gè)重要分泌系統(tǒng)是輔助Sec易位途徑SecA2，已證明幾種蛋白質(zhì)是通過(guò)這種途徑分泌[17]。試驗(yàn)表明在海分枝桿菌感染的小鼠模型以及斑馬魚中，SecA2的抑制可導(dǎo)致毒力因子蛋白激酶Ga的減少，干擾吞噬體-溶酶體與細(xì)胞膜的融合，導(dǎo)致肉芽腫的形成能力受阻[18]。

分枝桿菌內(nèi)酯是潰瘍分枝桿菌的主要毒力決定因素，是一族化學(xué)結(jié)構(gòu)上相似、多聚乙酰(polyketide)衍生的12元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯(macrolide)，具有一致的生物學(xué)活性，但毒力強(qiáng)度有所變化[19]。目前除潰瘍分枝桿菌外，其他種類的產(chǎn)分枝桿菌內(nèi)酯的分枝桿菌(mycolactoneMycobacterium，MPM)，包括Mycobacteriumliflandii和Mycobacteriumpseudoshottsii，只在兩棲動(dòng)物和魚類中引起疾病[20-21]。產(chǎn)分枝桿菌內(nèi)酯的海分枝桿菌僅在西亞周邊地區(qū)(以色列、地中海和紅海)被發(fā)現(xiàn)，并從受感染魚類中分離出一種分枝桿菌內(nèi)酯F[22]，但目前尚未在人類中發(fā)現(xiàn)和報(bào)道。2017年，臺(tái)灣地區(qū)Li等[22]在捕獲的香港疣蠑螈檢測(cè)到產(chǎn)分枝桿菌內(nèi)酯的海分支桿菌，這是東亞地區(qū)第一次報(bào)道產(chǎn)分枝桿菌內(nèi)酯的海分枝桿菌感染哺乳動(dòng)物的研究，該研究表明MPM可能通過(guò)未確定的途徑進(jìn)行跨界傳播。因此，進(jìn)一步監(jiān)測(cè)和調(diào)查不同地區(qū)水生和/或野生動(dòng)物的MPM，并對(duì)相關(guān)菌株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)和深入研究，有可能發(fā)現(xiàn)國(guó)內(nèi)游泳池肉芽腫高發(fā)的新致病菌株。

4 流行病學(xué)及臨床病理表現(xiàn)

海分枝桿菌感染患者多聚集在海邊或水域，中國(guó)、美國(guó)及歐洲各國(guó)等沿海、沿湖國(guó)家發(fā)病率相對(duì)較高[4]。目前，國(guó)內(nèi)缺乏大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查，海分枝桿菌感染的發(fā)生率未知。法國(guó)1996—1998年的年發(fā)病率為0.04/10萬(wàn)人，丹麥的研究[4]顯示，2004—2009年的年發(fā)病率為0.04～0.06/10萬(wàn)人，2010—2016年發(fā)病率為0.05～0.13/10萬(wàn)人，海分枝桿菌感染的發(fā)生率呈遞增趨勢(shì)。男女比例大約為6∶4，絕大多數(shù)病例可追溯其外傷史及接觸史，其中多為海產(chǎn)品接觸史及魚缸劃傷史，報(bào)道職業(yè)多集中在漁民、家庭主婦及廚師等[23]。本病無(wú)傳染性，病例多為散發(fā)報(bào)道，然而Feng等[24]在2011年報(bào)道了中國(guó)江蘇海安養(yǎng)魚場(chǎng)的一起海分枝桿菌群體感染事件。臨床對(duì)本病宣傳力度不夠，患者對(duì)海分枝桿菌認(rèn)識(shí)不足，導(dǎo)致患者在接觸魚蝦時(shí)防護(hù)不到位，就醫(yī)不及時(shí)，更有甚者對(duì)原有皮損進(jìn)行清創(chuàng)治療致使雜菌感染，致臨床診斷更加困難。國(guó)內(nèi)外的病例報(bào)告[4，23，25]表明，能在3個(gè)月內(nèi)就診并正確診斷及治療的不足60%，部分病例病程可長(zhǎng)達(dá)數(shù)十年，對(duì)人民健康造成傷害，對(duì)醫(yī)療資源造成極大浪費(fèi)。

本病臨床誤診率較高，海分枝桿菌引起損傷的潛伏期為2～4周，亦可長(zhǎng)達(dá)9個(gè)月，平均診斷時(shí)間為3.5個(gè)月[25]。男女比例1.48∶1，年齡分布為13～91歲，平均發(fā)病年齡為42.78歲[23]。人體的感染部位主要位于肢端，一項(xiàng)55例的病例研究[4]顯示，88.7%的感染部位為手指/手，32.1%累及上肢，下肢和關(guān)節(jié)分別為5.7%、3.8%，皮損以紅斑、丘疹結(jié)節(jié)為主，有時(shí)表現(xiàn)為膿皰、潰瘍、肉芽腫或疣狀斑塊[1]。Aubry等[1]的病例研究中，60%的患者表現(xiàn)為手指或手的單發(fā)孤立性皮損，僅25%的病例表現(xiàn)為孢子絲菌的串珠樣改變，20%～40%可表現(xiàn)為深部感染的腱鞘炎、關(guān)節(jié)炎或骨髓炎等；根據(jù)感染嚴(yán)重程度分為4個(gè)臨床類型[26]：孤立或有限(1～3個(gè))病灶(Ⅰ型)、多個(gè)(>3個(gè))病灶伴有炎性結(jié)節(jié)或呈孢子絲菌病樣分布特點(diǎn)或有膿腫和肉芽腫(Ⅱ型)、伴或不伴皮膚受累的深部感染(Ⅲ型)和播散性感染(Ⅳ型)。此病的組織學(xué)特征類似于其他分枝桿菌感染，可呈急性或慢性炎癥，可見結(jié)核性肉芽腫、纖維素樣變性及干酪樣壞死，Aubry等[1]認(rèn)為肉芽腫中央為纖維素樣壞死，但不是干酪樣壞死，偶爾可以觀察到朗漢斯巨細(xì)胞。其組織病理學(xué)變化與取材時(shí)機(jī)、部位及取材手法等都有相關(guān)性，活檢在非潰瘍的化膿性區(qū)域進(jìn)行，抗酸染色和培養(yǎng)均可獲得較高陽(yáng)性率。

5 診斷和治療

在臨床診斷中，海分枝桿菌感染部位的載菌量非常低，通過(guò)組織學(xué)或抗酸染色找到病原學(xué)感染證據(jù)較為困難，而常規(guī)的分枝桿菌培養(yǎng)需要數(shù)周[1]，因此，分子生物學(xué)作為一種更快捷、更靈敏的診斷工具正日益得到人們的認(rèn)可。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外應(yīng)用的檢測(cè)技術(shù)有16S rRNA擴(kuò)增和測(cè)序雜交技術(shù)、熱休克蛋白65基因檢測(cè)技術(shù)[27]、環(huán)介素等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，高分辨率熔解曲線分析技術(shù)(high-resolution melting analysis，HRMA)，熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)(fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET)等[7]。同時(shí)，有學(xué)者用PCR限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)分析法作為一種既敏感又快速的方法鑒定了14個(gè)非結(jié)核分枝桿菌菌屬，其結(jié)果與常規(guī)細(xì)菌學(xué)鑒定結(jié)果一致[28]。自2014年二代測(cè)序首次被用于臨床感染病例的病原學(xué)診斷以來(lái)，其正越來(lái)越廣泛地被應(yīng)用于臨床實(shí)踐。

結(jié)核T淋巴細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-SPOT．TB)是一種干擾素釋放試驗(yàn)(interferon-gamma release assay)，通過(guò)檢測(cè)外周血中經(jīng)結(jié)核分枝桿菌特異性抗原ESAT-6和CFP-10刺激后釋放干擾素的T淋巴細(xì)胞，判斷是否感染結(jié)核的技術(shù)。如上所述，海分枝桿菌與結(jié)核分枝桿菌共享這項(xiàng)檢測(cè)中使用的特定抗原；而基因組測(cè)序顯示，ESAT-6和CFP-10編碼基因的差異1區(qū)域，也存在于堪薩斯分枝桿菌[29]、蘇爾加分枝桿菌和戈登分枝桿菌[30]同源基因序列中。因此，干擾素γ釋放試驗(yàn)在海分枝桿菌感染的診斷中有一定的參考價(jià)值，但不能作為診斷標(biāo)準(zhǔn)。

目前，對(duì)于海分枝桿菌感染的治療還缺乏關(guān)于藥物選擇、劑量和濃度的統(tǒng)一規(guī)范或標(biāo)準(zhǔn)[31]。在美國(guó)一項(xiàng)回顧性研究[32]中，海分枝桿菌感染患者在確診前，65%患者被診斷為其他感染性疾病并接受抗菌藥物治療，其中使用頭孢菌素和青霉素治療的人數(shù)最多；21%患者被誤診為真菌感染而使用口服伊曲康唑等，貽誤治療時(shí)機(jī)。在目前的研究報(bào)道[7]中，利福平、鏈霉素、紅霉素、乙胺丁醇、異煙肼、多西環(huán)素、卡那霉素、乙硫異煙胺、米諾環(huán)素和四環(huán)素均有取得治療成功的案例。根據(jù)體外藥敏試驗(yàn)推薦的治療方案：采用利福平或利福布汀、乙胺丁醇和克拉霉素，二聯(lián)或三聯(lián)，療程2周～18個(gè)月[1]。單用抗菌藥物對(duì)海分枝桿菌早期皮膚感染有效，但深部組織感染及播散性感染需聯(lián)合應(yīng)用抗菌藥物及手術(shù)治療[1]。根據(jù)海分枝桿菌不耐高溫的特性，有研究[33]中應(yīng)用熱敷療法，效果良好。其他療法，如冷凍療法、X射線療法和電化療法[23]，已有報(bào)道但尚未得到評(píng)估。當(dāng)發(fā)生海分枝桿菌感染的患者接受藥物治療時(shí)，應(yīng)定期監(jiān)測(cè)肝功能、腎功能及藥物相關(guān)不良反應(yīng)，適時(shí)調(diào)整用藥及保護(hù)重要器官功能，還應(yīng)建議在抗菌藥物治療期間停止腫瘤壞死因子-α(TNF-α)抑制劑或其他免疫抑制治療[34]。

6 預(yù)防和展望

由于目前還沒(méi)有關(guān)于海分枝桿菌感染的人際傳播報(bào)告[1]，預(yù)防環(huán)境接種是根除這種疾病的主要戰(zhàn)略。鑒于海分枝桿菌感染絕大多數(shù)是散發(fā)病例[23]，個(gè)人預(yù)防應(yīng)作為第一道防線，強(qiáng)烈建議從事海產(chǎn)品相關(guān)工作(包括日常生活處理海產(chǎn)品)或水族館維護(hù)人員戴手套，增強(qiáng)包括手部保護(hù)和衛(wèi)生措施在內(nèi)的常識(shí)性措施的傳播和推廣，并評(píng)估這些措施的有效性，從而進(jìn)一步降低海分枝桿菌感染發(fā)病率。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。