印記基因與細(xì)胞重編程

田佳卉，陳昱光 ，胡建宏 ，雷安民,*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院，陜西 楊凌 7121001；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院)

細(xì)胞重新編程是當(dāng)前生命科學(xué)研究中很熱門的一個話題。通過人為操作實現(xiàn)的細(xì)胞重編程技術(shù)手段有兩種，一種是體細(xì)胞克隆技術(shù)，一種是誘導(dǎo)重編程技術(shù)。體細(xì)胞克隆就是利用單個體細(xì)胞的遺傳物質(zhì)置換卵母細(xì)胞自身的遺傳物質(zhì)，利用卵母細(xì)胞質(zhì)的重編程能力使體細(xì)胞具備發(fā)育全能性并最終形成新的個體；誘導(dǎo)重編程技術(shù)就是通過母體細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)入外源基因(特定的轉(zhuǎn)錄因子)，最終形成一個一個小的細(xì)胞團，這些細(xì)胞團具備囊胚內(nèi)細(xì)胞團(ICM)同等的發(fā)育潛能。一般而言，體細(xì)胞克隆技術(shù)相對于誘導(dǎo)重編程技術(shù)而言，其重編程過程更為徹底。

兩種重編程的技術(shù)手段都涉及到印記基因的一些變化。而印記基因在細(xì)胞重編程中的變化規(guī)律還不是很清楚，學(xué)界還存在較多的爭議。本文參閱近年來的相關(guān)文獻，希望能夠?qū)⒓?xì)胞重編程過程中的印記基因的變化進行一些歸納，以達拋磚引玉之意。通過本文的綜述希望能夠引發(fā)更多學(xué)者對于重編程過程中印記基因的變化給予更多關(guān)注。

1 印記基因的基本概念

基因組印記是指來自父方和母方的等位基因在通過精子和卵子傳遞給子代時發(fā)生的特定修飾，使帶有親代印記的等位基因具有不同的表達特性，這種特定修飾常為DNA甲基化修飾，同時也包含組蛋白乙?；⒓谆绕渌谋磉z傳修飾方式。1980年前后，基因印記引起發(fā)育學(xué)研究人員的廣泛重視。Solter和Surani(2010)研究小鼠細(xì)胞核移植發(fā)現(xiàn)，印記基因影響其發(fā)育。同時，McGrath等(1984)進行細(xì)胞核移植時發(fā)現(xiàn)，兩原核分別來自父方和母方是胚胎發(fā)育所必需的，如果兩原核同時來自父方或者同時來自母方，這種組合胚雖然在初始階段可以發(fā)育，但是后期將發(fā)生死亡，無法獲得正常個體。這些早期胚胎發(fā)育的現(xiàn)象可能是由于印記基因引起，父源或母源印記基因的不表達或過表達都會導(dǎo)致胚胎發(fā)育失敗。

1960 年，Crouse在研究尖眼蕈蚊( Sciara) 時發(fā)現(xiàn)，其2條X染色體中只有來自母系的等位基因具有表達活性，而來自父系的等位基因始終處于沉默狀態(tài)，進而第一次提出了基因組印記的概念。隨后“基因組印記”被用來描述和解釋節(jié)肢動物物種的性別決定中起作用的父源特定染色體缺失。

印記基因的確切的含義應(yīng)該是，在有性生殖過程中，為避免和減少發(fā)育相關(guān)聯(lián)的關(guān)鍵基因之間的沖突而發(fā)生的兩性基因間在個體發(fā)育中表達并行使功能的分工約定，這種分工是在生物進化的長期過程中形成并固定下來。印記基因在個體的發(fā)育過程中存在明確的印記維持、印記擦除和印記重建過程。印記維持在正常體細(xì)胞中終生存在，不發(fā)生變化，而印記擦除和印記重建過程發(fā)生在生殖細(xì)胞的增殖與分化階段。

2 印記基因在胚胎發(fā)育過程中的作用

在生殖細(xì)胞形成過程中，來自父方和母方的印記將全部被消除，父方等位基因在精母細(xì)胞形成精子過程產(chǎn)生新的甲基化模式，但在受精時這種甲基化模式還將繼續(xù)發(fā)生改變；母方等位基因甲基化模式在卵子發(fā)生過程形成，因此在受精前來自父方和母方的等位基因具有不同的甲基化模式，這就形成了雙親印記基因的不同修飾與表達。一般情況下，印記基因在發(fā)揮功能時嚴(yán)格依照印記模式選擇性地表達父、母單方來源的拷貝。80%印記基因成簇出現(xiàn)，其表達調(diào)控主要通過位于基因簇中的印記基因調(diào)控區(qū)(ICR)，亦稱差異甲基化區(qū)域(DMR)來實現(xiàn)。

2.1 印記基因的存在反映了性別的競爭

研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)父方表達的印記基因缺失或被敲除時, 胎兒在子宮內(nèi)的生長將受到限制; 當(dāng)母方表達的印記基因,如IGF2R、H19 等，缺失或被敲除，則表現(xiàn)為IGF2 表達過量，導(dǎo)致胎兒生長過大。由此可見，父方對胚胎的貢獻是加速其發(fā)育，而母方則是限制胚胎發(fā)育速度，親代通過印記基因來影響其下一代，使其具有性別行為特異性，以保證本方基因在遺傳中的優(yōu)勢。綜合上述研究結(jié)果表明，印記基因是雙親遺傳物質(zhì)在向后代傳遞過程中既競爭又妥協(xié)的結(jié)果。

2.2 印記基因是平衡胎兒和胎盤發(fā)育的重要調(diào)節(jié)因素

研究發(fā)現(xiàn)，孤雌胚和核胚發(fā)育后缺少胎盤組織,而雄核胚可發(fā)育成較好的滋養(yǎng)層細(xì)胞,但胚胎本身的發(fā)育受阻。由此可知，胎盤的發(fā)育需要父方表達的印記基因表達，胎兒的發(fā)育則要求母方表達的印記基因表達。同時在反芻動物的胚胎移植后,大胎癥的概率增加，這可能與印記基因有關(guān)。因此,遺傳印記是平衡胎兒和胎盤發(fā)育的重要調(diào)節(jié)因素。但是, 也有一些印記基因與胚胎的發(fā)育無關(guān)，例如人第 15 條染色體上的三個印記基因,SNRPN、IPW、ZNF127,它們都是只表達父方。這些基因與人類的 Prader-Willi、Beckwith-Wiedemann 和 Angelman 綜合征有密切關(guān)系。

3 哺乳動物發(fā)育中的體細(xì)胞循環(huán)與生殖細(xì)胞循環(huán)研究

3.1 生殖細(xì)胞與體細(xì)胞的關(guān)系

1881年，由德國生物學(xué)家奧古斯特·魏斯曼提出的“種質(zhì)論”認(rèn)為生物體內(nèi)的細(xì)胞分為生殖細(xì)胞和體細(xì)胞。生殖細(xì)胞是遺傳信息的載體，壽命是無限的；而體細(xì)胞由生殖細(xì)胞衍生分化而來，輔助生殖細(xì)胞將遺傳信息傳給下一代，體細(xì)胞完成任務(wù)后表現(xiàn)為個體的死亡。由生殖細(xì)胞結(jié)合形成的受精卵分裂發(fā)育成為新的生物個體時，總是會“留出”(特殊的細(xì)胞分化過程)一些細(xì)胞繼續(xù)作為生殖細(xì)胞，同時分化出體細(xì)胞輔佐協(xié)助生殖細(xì)胞把遺傳信息傳給后代。對人類而言，身體只是生殖細(xì)胞的載具，幫助生殖細(xì)胞將遺傳信息不斷地傳遞下去。

3.2 體細(xì)胞循環(huán)與生殖細(xì)胞循環(huán)中印記基因的變化

魏斯曼理論將生命個體分為生殖循環(huán)和體細(xì)胞循環(huán)兩個過程。在單細(xì)胞生物中，生殖循環(huán)和體細(xì)胞循環(huán)是完全統(tǒng)一的，單細(xì)胞生物的分裂既是體細(xì)胞循環(huán)的結(jié)束，也是生殖循環(huán)的開始。但在多細(xì)胞生物體中，體細(xì)胞出現(xiàn)了明確的分工，只有專門負(fù)責(zé)遺傳信息的傳代的細(xì)胞具有生殖權(quán)，最終演化成為高等生命體內(nèi)的生殖細(xì)胞。

生殖細(xì)胞的出現(xiàn)是有性生殖的基礎(chǔ)，兩性配子的結(jié)合促進了生物個體之間遺傳信息的交流與重組，大大推動和加速了生物進化過程。但是同時也帶來了兩性遺傳信息在后代個體表達中發(fā)生沖突的可能性。如孟德爾遺傳學(xué)中顯性性狀與隱性性狀的問題，實質(zhì)就是兩性遺傳信息的競爭性表達。在一些特殊的情況下，尤其是多細(xì)胞生物胚胎發(fā)育的早期階段，雙親來源的基因競爭可能會引起基因表達的沖突與異常，導(dǎo)致發(fā)育終止。因此兩性生殖的過程需要一套有效的機制對特定階段的特定重要等位基因表達進行分工界定?；蚪M印記的遺傳理論認(rèn)為母系印記基因促進胎兒和胎盤增長，父系印記基因則限制胎體生長，這種分工需要在配子的形成過程中確定，這可能就是基因印記的最早的進化基礎(chǔ)。

哺乳動物發(fā)育生物學(xué)的相關(guān)研究顯示，基因印記在精子和卵母細(xì)胞發(fā)生的早期階段開始形成，表現(xiàn)為兩性生殖細(xì)胞之間染色質(zhì)的不同甲基化(或組蛋白甲基化、乙?；绕渌磉z傳修飾形式)范型，在兩性配子結(jié)合后形成早期胚胎的發(fā)育過程中，兩性來源的遺傳信息都會依照印記基因的分工，協(xié)調(diào)和高效地進行表達并指導(dǎo)早期胚胎及其后發(fā)育。這種印記基因形成的兩性基因差異性表達會在個體體細(xì)胞的整個生命過程中持續(xù)穩(wěn)定存在，終生不會發(fā)生改變，這就是印記基因在體細(xì)胞分化過程中的維持；但在新生個體的生殖系統(tǒng)中，當(dāng)原始生殖細(xì)胞進行分化并預(yù)備形成配子時，原始生殖細(xì)胞就會對雙親來源的印記基因進行全面抹除，并重新依據(jù)個體性別重建新的基因印記。

從印記基因的角度出發(fā)，新生個體的體細(xì)胞循環(huán)過程中，體細(xì)胞終生攜帶源自受精卵的基因印記標(biāo)志；而生殖系統(tǒng)中的生殖細(xì)胞其作用就是在個體發(fā)育過程中，將雙親來源的印記標(biāo)記抹除后重建基于自體的印記標(biāo)記并將其遺傳下去。生命個體單次的體細(xì)胞循環(huán)中，印記基因不發(fā)生變化(僅在當(dāng)前正確的觀點)；而在生殖循環(huán)過程中，通過生殖細(xì)胞形成過程對印記基因的循環(huán)性抹除與重建，實現(xiàn)遺傳信息在世代之間的傳遞與更迭。

4 細(xì)胞重編程處理研究進展

生命之初，受精卵經(jīng)過幾次有絲分裂后開始分化，由于啟動的基因表達譜的差異，不同細(xì)胞的發(fā)育命運也不盡相同，最終分化為具有不同形態(tài)特征和生理功能的終末分化的體細(xì)胞和極少數(shù)的成體干細(xì)胞。所以，個體發(fā)育被認(rèn)為是從全能的受精卵到多能或單能干細(xì)胞或不具分化潛能的體細(xì)胞的過程，在該過程中細(xì)胞逐步喪失增殖和分化能力，并且基本無法逆轉(zhuǎn)。但隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)，卵細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中存在一種“特殊物質(zhì)”，有能力解除體細(xì)胞分化過程中形成的限制，使已經(jīng)分化的體細(xì)胞重新回到早期受精卵或早期胚胎的狀態(tài)。這說明體細(xì)胞的命運是可逆的。成年哺乳動物的體細(xì)胞已經(jīng)積累了相當(dāng)數(shù)量的受損物質(zhì)，但這些物質(zhì)并不能阻擋體細(xì)胞在卵細(xì)胞質(zhì)內(nèi)重新獲得永生的能力。卵細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的“特殊物質(zhì)”類似于具復(fù)老還童的“青春因子”，可以讓體細(xì)胞回到發(fā)育的起始點。

4.1 體細(xì)胞克隆技術(shù)使體細(xì)胞重編程

體細(xì)胞克隆技術(shù)可以使同樣遺傳背景的個體數(shù)量增加，同時能夠在不改變個體印記的前提下，使生命返老還童。低等動物通過將個體一分為二完成克隆，如渦蟲和蚯蚓，有實驗證明渦蟲能夠被一次性切割279份，其中每份都可以重新形成新的個體；在發(fā)育非常早期的階段，哺乳動物的克隆也可以采用個體一分為二的辦法，例如在桑椹胚或者早期囊胚階段之前對胚胎進行分割，可以得到遺傳信息完全一致的兩個或者兩個以上個體。因此，在發(fā)育生物學(xué)中應(yīng)該將細(xì)胞分化過程與生殖細(xì)胞的特化過程(也是一種特殊的分化)分開，體細(xì)胞克隆技術(shù)只涉及細(xì)胞分化的逆轉(zhuǎn)，并不涉及類似生殖細(xì)胞發(fā)生過程中的印記基因的重寫。

體細(xì)胞核移植技術(shù)只是動物克隆的方法之一，在低等動物甚至是高等哺乳動物中，都存在著比體細(xì)胞核移植技術(shù)更為簡潔的克隆辦法。但是體細(xì)胞核移植與這些辦法的區(qū)別在于體細(xì)胞核移植是真正意義上的克隆，即源自單個細(xì)胞重新編程的個體，而其他的克隆方法往往是一群細(xì)胞共同重編程的結(jié)果。

4.2 誘導(dǎo)干細(xì)胞技術(shù)使體細(xì)胞重編程

體細(xì)胞在分化過程中，由于周圍細(xì)胞的競爭以及發(fā)育過程的細(xì)胞分化壓力，朝著預(yù)設(shè)的、各自不同的方向演化，這樣不同的終末體細(xì)胞都有著各自獨特的基因表達范型，這種范型不但受到細(xì)胞內(nèi)部的嚴(yán)格調(diào)控和維持，同時許多外部的細(xì)胞所給予的壓力也促使細(xì)胞穩(wěn)定停留在這一狀態(tài)。人工誘導(dǎo)干細(xì)胞技術(shù)將細(xì)胞進行體外培養(yǎng)，使其脫離其在機體內(nèi)所受到的各種周圍管控壓力，獲得相對獨立和自由的生存空間；但同時也失去了很多以前周圍細(xì)胞的支持，取而代之的是周圍細(xì)胞提供的許多功能支持必須由自己獨立完成。這種外因和內(nèi)因的簡單變化本身就會引發(fā)細(xì)胞自身基因表達的改變，使得細(xì)胞能夠適應(yīng)變化的環(huán)境。

人工誘導(dǎo)干細(xì)胞技術(shù)通過人工強制性地將特定的幾個功能強大的多能性因子轉(zhuǎn)入到細(xì)胞，這些轉(zhuǎn)錄因子能夠持續(xù)性地引導(dǎo)細(xì)胞朝著早期胚胎的表達模式轉(zhuǎn)化，最終這些外源轉(zhuǎn)錄因子的持續(xù)性表達能夠引發(fā)細(xì)胞內(nèi)自身基因組中多能性因子的激活，由此這些細(xì)胞就不再需要外源的轉(zhuǎn)錄因子的存在而僅依賴本身多能性因子的表達就可以維持在類似于早期胚胎的狀態(tài)。

誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞最初是日本科學(xué)家山中伸彌團隊在2006年利用病毒載體將四個轉(zhuǎn)錄因子(Oct4， Sox2，Klf4 和c-Myc)的組合轉(zhuǎn)入到小鼠胚胎或皮膚纖維母細(xì)胞中，使其重編程而得到的類似胚胎干細(xì)胞的一種細(xì)胞類型。相比于胚胎干細(xì)胞，iPS細(xì)胞不會產(chǎn)生倫理問題，且利用宿主自身的成體細(xì)胞(如皮膚細(xì)胞、血細(xì)胞等)經(jīng)重編程變成iPS細(xì)胞，將它們移植回相同個體，就不引發(fā)免疫反應(yīng)，此外iPS細(xì)胞非常適合用來構(gòu)建疾病模型，不過將iPS細(xì)胞用于治療時也有風(fēng)險，讓ips細(xì)胞移植到體內(nèi)時有可能會產(chǎn)生腫瘤。誘導(dǎo)多能新干細(xì)胞的獲得，不同的動物，其研究進展差異很大。由于豬在人類的器官移植中是一個潛在的異種器官供體動物，所以豬的iPS研究近期一直進展迅速，是當(dāng)今生命科學(xué)的一個研究熱點。

4.3 重編程與印記基因

綜上所述，理想狀態(tài)下，重新編程是僅限于體細(xì)胞循環(huán)過程的發(fā)育起點的還原問題，就現(xiàn)在的認(rèn)知而言不涉及到基因印記的改變。體細(xì)胞從早期胚胎向后續(xù)的發(fā)育過程，是體細(xì)胞循環(huán)的過程，僅存在著細(xì)胞分化，這種分化的基礎(chǔ)依賴于生殖細(xì)胞結(jié)合之前已經(jīng)產(chǎn)生的印記。體細(xì)胞在分化過程中僅存在細(xì)胞分化導(dǎo)致的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化，并不涉及到印記基因的問題。而我們現(xiàn)在已有的人工的去分化的手段，第一是核移植技術(shù)，其次是人工誘導(dǎo)干細(xì)胞技術(shù)，都只是將分化的體細(xì)胞拉回到原始的胚胎發(fā)育起點，但是并不改寫或者改變胚胎的印記基因。但在實際情況中，兩種重新編程都會經(jīng)常性地引發(fā)印記基因的表達異常，最終引發(fā)重編程的失敗。

5 目前存在科學(xué)問題與展望

5.1 重編程技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

重編程的理論研究具有重要意義。該理論可以應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)臨床治療，支持我們從患者身上采樣，獲得體細(xì)胞，將這些體細(xì)胞進行重新編程使其恢復(fù)到發(fā)育起始點，然后重新分化成為不同的組織，以此替代患者受損的相應(yīng)組織，進而達到器官置換(移植替代)的治療目的。當(dāng)前，利用干細(xì)胞治療寵物的疾患已經(jīng)在獸醫(yī)臨床治療中開展應(yīng)用。利用干細(xì)胞治療人類疾病的一些領(lǐng)域也已經(jīng)獲得許可。

此外腫瘤生物武學(xué)的研究顯示，還能多腫瘤發(fā)生的原因在于細(xì)胞的表遺傳，甚至是關(guān)鍵的印記基因發(fā)生改變，導(dǎo)致了機體腫瘤的發(fā)生，通過對于腫瘤生物學(xué)中印記基因表達變化規(guī)律的研究，也將有助于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?qū)τ谀[瘤治療的進步與療效改善。

5.2 重編程在家畜育種領(lǐng)域的可能應(yīng)用與挑戰(zhàn)

5.2.1 重編程技術(shù)快速復(fù)制良種個體 應(yīng)用體細(xì)胞核移植快速地擴增優(yōu)良個體數(shù)量，早有成功報道，大家畜成功比例在1%～3%；人工對于體細(xì)胞的誘導(dǎo)重編程也有突破性進展，利用四倍體的補償技術(shù)能夠得到來自于誘導(dǎo)重編程細(xì)胞的個體。并且這種技術(shù)已經(jīng)用于大量地制作基因缺陷的小鼠模型。然而需要指出的是，體細(xì)胞核移植與誘導(dǎo)干細(xì)胞的四倍體嵌合法獲得個體的機理上是完全不同的。體細(xì)胞核移植是單個細(xì)胞重新編程后支持的個體發(fā)育，而四倍體嵌合的克隆辦法則是一群細(xì)胞共同重編程的結(jié)果。因此從原理而言，四倍體嵌合補償技術(shù)獲得的個體要比體細(xì)胞克隆技術(shù)獲得個體的效率高，同時畸形率低。

5.2.2 體外人工生成單倍體生殖細(xì)胞 體外人工生成單倍體的生殖細(xì)胞是當(dāng)前十分具有挑戰(zhàn)性的工作?？茖W(xué)家已經(jīng)通過體外培養(yǎng)獲得了雌性與雄性的生殖細(xì)胞，并且成功得到了后代。這一研究涉及到了印記基因的重寫。在活體中，神經(jīng)系統(tǒng)將自身生活過程中的一些體驗融入配子的表遺傳修飾中(可以稱之為漸進性的進化印記)，參與生殖細(xì)胞的形成。而體外人工制作的配子顯然缺乏進化印記。通過人工重寫印記基因，科學(xué)家已經(jīng)能獲得來源于雙雌性或者雙雄性的后代，盡管效率很低，且雙雄性后代并不算完美，但是這些都為我們進一步研究印記基因展現(xiàn)了美好前景。

6 總結(jié)

在哺乳動物個體發(fā)育過程中，性細(xì)胞獨立于體細(xì)胞而特定的兩性性腺環(huán)境中發(fā)生發(fā)展，兩性配子生成環(huán)境的差異使得兩性配子間遺傳物質(zhì)形成差異化的修飾非常簡單。而兩性間印記基因就是這種差異在分子層面的一個最具代表性的反映。而重編程過程中，體細(xì)胞內(nèi)所攜帶雙親來源的遺傳物質(zhì)都是在無差異的同一環(huán)境下被執(zhí)行重編程過程，如何能夠建立一種重編程的技術(shù)手段，使得重編程過程不傷及體細(xì)胞本身攜帶的印記基因，能夠?qū)в胁煌揎椀碾p親遺傳組織達到區(qū)別對待、精準(zhǔn)施作，達到完美的重編程效果是當(dāng)前急需深入研究的重要課題，需要科技工作者嚴(yán)謹(jǐn)，認(rèn)真的長期探索。

在重編程的研究領(lǐng)域仍有一些關(guān)鍵的生物學(xué)問題值得我們深入思考，例如①不同領(lǐng)域科學(xué)家對生命起始點的認(rèn)識仍不統(tǒng)一。哺乳動物胚胎是卵母細(xì)

胞受精形成。受精之后形成含有兩個原核的受精卵，稱之為原核期胚胎(1984年，諸多孤雌和孤雄胚胎的制備就是利用這一時期的胚胎，也是由此使人們關(guān)注到了印記基因問題)。近期的研究發(fā)現(xiàn)，即使卵子受精之后，精卵來源的遺傳物質(zhì)仍然未能夠完全的融合，甚至到了進入二細(xì)胞前的第一次有絲分裂階段，仍然是相對獨立的存在，證據(jù)就在于父母雙方來源的染色體有各自獨立的紡錘體結(jié)構(gòu)；生命起始于精子進入卵子？還是起始于雌雄原核融合？或是起始于胚胎基因的表達；②此外，源自父母雙親的基因印記的最終定型的時間點目前并不確定。研究發(fā)現(xiàn)，雌雄原核的甲基化狀態(tài)是完全不一樣的，且卵子內(nèi)存在一些物質(zhì)能夠?qū)雍诉M行不同于卵原核的甲基化修飾，這種甲基化修飾應(yīng)屬于基因印記的一個組成部分。但這些甲基化的修飾在印記基因中的比例尚不清晰。利用受精卵作為細(xì)胞質(zhì)受體核移植研究顯示，雌雄原核中只有雄原核才具有類似于成熟卵細(xì)胞質(zhì)的重編程能力。對于印記基因的研究是未來的一個重要研究方向，幫助我們更加深刻理解有性生殖。