HMGB1和TLR4在ARDS中作用的研究進展

舒小燚，李有霞，范紹輝，王紅嫚

急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是指繼發(fā)于內皮-上皮屏障的破壞、肺泡損傷和肺水腫，以呼吸窘迫、頑固性低氧血癥和呼吸衰竭為特征的急性炎癥性肺損傷［1］。目前該病治療的重點是保護性肺通氣策略，尚無特效藥物，總病死率高達45%［2］，給社會帶來了沉重的醫(yī)療和經濟負擔。特別是隨著2019 年新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）疫情在世界范圍的暴發(fā)，大量感染者的結局是病毒性肺炎引起的ARDS，最終導致死亡。因此，探明ARDS相關病理機制，發(fā)現更有效的治療靶點，對于ARDS 的防治和降低病死率具有重要意義。目前研究發(fā)現，炎癥反應的失控在ARDS 的病理進程中扮演關鍵角色，而高遷移率族蛋白B1（high mobility group box 1 protein，HMGB1）和Toll 樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4）是促發(fā)炎癥反應的關鍵介質，介導ARDS 炎癥發(fā)展的病理進程。本文就HMGB1、TLR4和兩者之間的關聯在ARDS中的作用和相關治療進展進行綜述。

1 ARDS概述

ARDS 的發(fā)病原因較多，其中臨床常見的主要為肺炎、非肺源性膿毒癥、異物吸入和重大創(chuàng)傷。炎癥反應的失控、肺泡毛細血管屏障功能障礙、凝血與纖溶異常、氧化應激失衡等均參與ARDS 的病理進程。其中，“炎癥反應的失控”被認為是ARDS 發(fā)病機制的本質。ARDS 發(fā)生時，過量的巨噬細胞、中性粒細胞、上皮細胞以及內皮細胞等炎性細胞在肺內聚集，產生白細胞介素（interleukin，IL）和腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）等多種促炎因子，使血管內皮通透性增加，各種炎性細胞、富含蛋白的水腫液及紅細胞進入肺泡腔和間質內，進一步加重肺損傷，導致急性炎癥反應失控的“瀑布樣”級聯效應［3］。近年來，隨著對該病研究的深入，體外膜肺氧合、肺通氣策略、俯臥位、神經肌肉阻滯劑和糖皮質激素等已成為降低ARDS患者病死率的治療措施和相關藥物［1］，但是仍缺乏有效且統(tǒng)一的治療性干預手段來減輕ARDS持續(xù)的肺部炎癥損傷和降低病死率。減輕炎癥反應的強度可能是ARDS治療的關鍵環(huán)節(jié)。

2 HMGB1在ARDS中的作用

HMGB1 因其在聚丙烯酰胺凝膠電泳中的高遷移率而得名，由216 個氨基酸殘基構成，形成2 個N端結構域和1 個 C 端酸性結構域（186-215aa），N 端分別由HMG A 盒（9-79aa）和HMG B 盒（95-163aa）組成。據報道，HMGB1的促炎活性區(qū)域主要定位于B 盒，而A 盒具有抗炎的作用，可作為HMGB1 拮抗劑［4-5］。研究進一步證實HMGB1可以與多種蛋白結合并相互作用，氨基酸殘基150-183 與晚期糖基化終產物的受體（advanced glycation end product receptor，RAGE）結合后可促進細胞遷移，而殘基89-108 和殘基 7-74 則分別與 TLR4 和 p53 反式激活結構域結合，促進炎癥反應和基因轉錄［4］。HMGB1作為內源性損傷相關分子模式（damage associated molecular patterns，DAMPs）的一份子，是炎癥中引發(fā)先天性和適應性免疫應答的關鍵介質，主要存在于細胞核中［6］。當細胞受到“危險信號”刺激時，HMGB1可以被迅速激活并釋放到細胞外，直接充當炎性細胞因子，啟動和維持由傳染性或非傳染性疾病引起的免疫反應，并在受損組織中維持免疫平衡［7］。HMGB1 分布于哺乳動物的多種器官和組織中，在肺組織的分布尤其廣泛。肺組織損傷或氧化應激時，單核/巨噬細胞和自然殺傷細胞等炎性細胞可主動分泌HMGB1；細菌產物、內毒素等外源性刺激和TNF-α、干擾素等內源性刺激均可以誘導HMGB1 的被動釋放。研究表明，細胞外HMGB1 作為一種晚期促炎因子，通過與相應受體如RAGE、TLRs、N-甲基-D-天門冬氨酸受體 1（NMDAR1）、CXC 趨化因子受體4、T 細胞免疫球蛋白黏蛋白3 和α-突觸核蛋白等結合，激活巨噬細胞、單核細胞、中性粒細胞、自然殺傷細胞、T 細胞、內皮細胞以及上皮細胞等多種炎性細胞，進而啟動絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、磷脂酰肌醇-3 激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（PI3K/AKT/mTOR）、Janus 激酶/信號轉導和轉錄激活因子（JAK/STAT）、核因子-κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）、活性氧（ROS）等促炎相關信號通路，誘導多種細胞因子生成，形成炎癥級聯反應［4］。目前僅有 RAGE 和 TLR4 被確定為功能性HMGB1受體［4-5，8］。

HMGB1 在ARDS 的病理過程中扮演著重要角色。動物體內實驗發(fā)現，在小鼠氣管內滴注重組HMGB1（rHMGB1）會引起肺組織嗜中性粒細胞募集，并伴有肺組織損傷和肺泡內炎癥反應以及肺通透性的增加，最終造成急性肺損傷（ALI）/ARDS［9］。在ALI 的發(fā)展過程中，黑素瘤缺乏因子2（AIM2）炎癥小體被激活，調節(jié)半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1 的活化，然后促進細胞因子前體pro-IL-18 和pro-IL-1β的成熟和釋放，誘導肺部炎癥；而HMGB1可以激活巨噬細胞中的AIM2 炎癥小體，通過TLR2、TLR4和RAGE/NF-κB 信號通路誘導M1 巨噬細胞的極化來參與ALI的發(fā)病［10］。另有研究發(fā)現，HMGB1激活PI3K/AKT/mTOR 通路后，樹突狀細胞可通過該通路調節(jié)ALI中的急性肺部炎癥和病理損傷［11］。另有研究表明，HMGB1 可在脂多糖、TNF-α 和IL-1β 刺激下從巨噬細胞中主動釋放，隨后通過激活NF-κB易位，增加促炎細胞因子水平和增強肺通透性來促進內毒素誘導的ALI/ARDS，而阻斷HMGB1 或敲除磷酸酶-張力蛋白同源物（PTEN）基因可通過破壞巨噬細胞HMGB1/PTEN 減輕小鼠肺損傷［12］。連接蛋白（Connexin，Cx）通道有助于嗜中性粒細胞和巨噬細胞在ALI 期間的移動和募集，經Cx 阻斷劑P5 干預后，通過抑制HMGB1 的細胞外釋放，可減少經脂多糖誘導的ALI 小鼠肺泡灌洗液中的白細胞，表明在ALI中該通道的通透性與炎性細胞的遷移率呈正相關［13］。肺泡上皮細胞（AECs）通過合成和分泌表面活性劑促進正常呼吸。在ALI/ARDS 期間，AECs 可分泌大量炎性細胞因子（如IL-1β、IL-6）和趨化因子［ 如 單 核 細 胞 趨 化 蛋 白 -1（monocyte ehemoattractant protein-1，MCP-1）、IL-8］來參與炎癥反應。Zhou 等［14］利用脂多糖刺激 A549 細胞后發(fā)現，HMGB1/RAGE 通路被激活，而抑制長鏈非編碼RNA 核富集轉錄體1（LncRNA NEAT1）的表達可阻斷 HMGB1/RAGE 信號通路，表明 NEAT1 在 AECs 參與的炎癥反應中可能具有促炎作用；進一步研究發(fā)現，ALI小鼠肺組織中NEAT1高表達，而抑制其表達后肺部炎癥減輕，死亡減少。肺微血管內皮細胞在維持微血管腔和肺間質之間的內皮屏障完整性方面起著關鍵作用。內皮細胞的屏障功能取決于細胞完整性、細胞連接復合物中蛋白質的協(xié)調表達和相互作用，包括F-肌動蛋白細胞骨架、黏附連接（AJ）和緊密連接（TJ）。內皮細胞的細胞骨架重排、AJ 與TJ 的破壞可引起屏障通透性增高，導致細胞收縮和細胞間隙形成。而HMGB1 可以破壞細胞間連接，增加細胞屏障通透性，最終導致血管外高蛋白性水腫［15］。

目前眾多的臨床研究結果也與動物體內實驗研究結果一致。郭小芙等［16］發(fā)現，合并ARDS 患者的血清HMGB1 表達水平明顯高于普通膿毒癥患者和健康志愿者，HMGB1表達水平的升高可能是膿毒癥患者并發(fā)ARDS 的危險因素之一，HMGB1 介導的炎癥反應參與了膿毒癥患者肺組織損傷過程。孫麗等［17］研究顯示，ARDS死亡患者血清IL-6及HMGB1表達水平均顯著高于存活組，而IL-10 水平低于存活組，IL-6、IL-10及HMGB1可作為ARDS 患者預后結局的預估指標。Chen 等［18］發(fā)現，COVID-19 引起的ARDS患者血清HMGB1水平明顯升高，甘草甜素作為HMGB1 的直接抑制劑可以明顯改善其預后。綜合以上結果可以推測HMGB1 是介導ALI/ARDS病理過程中炎癥反應的重要靶點。

3 TLR4的概述及在ARDS中的作用

TLRs 作為模式識別受體（pattern recognition receptor，PPR）家族中的一員，可通過識別外源性病原體相關分子模式（pathogen associated molecular pattern，PAMP）和DAMP，并通過一系列信號轉導機制誘導炎性因子如IL-1、IL-6、TNF-α和細胞間黏附分子-1等表達，介導機體免疫應答與組織損傷。目前已經證實，TLRs 可在單核細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞等免疫細胞中表達，而非免疫細胞如血管內皮細胞、上皮細胞、平滑肌細胞和心肌細胞也可見TLRs 表達［19-20］。TLR4 既可以通過 PAMPs 識別細菌、病毒、真菌和寄生蟲，也可以通過DAMPs 激活HMGB1、熱休克蛋白、細胞外基質降解產物等內源性化合物，通過細胞內信號轉導途徑激活先天免疫防御，導致促炎因子和趨化因子在組織損傷期間釋放，同時激活TLR4非感染性途徑，誘導組織修復［8］。髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）依賴性和非依賴性途徑是TLR4誘導炎癥因子和刺激因子釋放的主要信號轉導通路。MyD88依賴性信號轉導途徑指MyD88 氨基端與IL-1 受體相關激酶結合，使后者發(fā)生自身磷酸化，促使TNF受體相關因子-6 的激活，活化NF-κB 和激活蛋白1（activator protein 1，AP-1）轉錄因子，使其轉位到細胞核，最終促使IL-1β、IL-6、IL-8 等炎性因子的釋放。MyD88非依賴性信號轉導途徑指TIR結構域銜接蛋白作為適配子蛋白與TLR4結合，使TNF受體相關蛋白因子3 和受體相互作用蛋白1 磷酸化，導致NF-κB 活化因子結合激酶 1 和 MAPK 激活，分別募集干擾素調節(jié)因子3及其家族成員，使激活蛋白1被活化，從而導致促炎因子的產生［21-22］。

Huang等［23］發(fā)現，TLR4通過激活MyD88/NF-κB途徑可以加重機械通氣誘發(fā)的肺損傷，而使用抗TLR4單克隆抗體預處理的大鼠可通過抑制MyD88/NF-κB 信號通路來保護其免受此類肺部損傷。在LPS誘導的ALI/ARDS小鼠模型中，小鼠肺部病理損傷和炎癥改變可能與TLR4/MYD88/NF-κB 信號通路有關，通過敲除小鼠TLR4基因可以減輕LPS誘導的ALI 小鼠肺內的炎癥和凋亡程度，進一步證實TLR4在ALI/ARDS中具有靶向作用［24］。另有研究發(fā)現，在ARDS大鼠模型中用抗TLR4單克隆抗體進行預處理后，大鼠肺損傷、炎癥浸潤和肺水腫減輕，TNF-α 和IL-1β 表達降低，TLR4、MyD88 和NF-κB表達水平下降，而且動脈血氧分壓升高，這些結果表明，通過抑制TLR4/MyD88 信號傳導途徑可調節(jié)巨噬細胞激活和炎癥反應［25］。體外實驗也發(fā)現，在LPS 誘導人肺上皮細胞出現類似ARDS 的損傷后，TLR4、NF-κB 以及相關炎性因子的表達明顯增加［26］。在進一步體外實驗中，通過抑制TLR4/MYD88/NF-κB 通路顯著減少了肺內皮細胞的凋亡［24］。在臨床研究中也發(fā)現，TLR4 在 ALI/ARDS 中具有重要作用。陳顯峰等［27］分別采集膿毒癥合并ARDS 無鎮(zhèn)靜處理患者和右美托咪定處理患者的中心靜脈血和肺泡灌洗液進行相關檢測，發(fā)現經右美托咪定鎮(zhèn)靜處理后患者血清IL-6、TNF-α 表達及肺泡灌洗液中TLR4和MyD88蛋白表達均較鎮(zhèn)靜前明顯下降，該研究指出，右美托咪定鎮(zhèn)靜可能依賴于TLR4/MyD88 信號途徑減輕膿毒癥合并ARDS 患者的炎癥反應。

結合多方面的研究可以推斷，通過TLR4調控炎癥反應可能在ARDS的病理損傷過程中具有重要作用，研發(fā)更多針對TLR4靶點的治療藥物可以為臨床降低ARDS患者的病死率提供新的思路。

4 HMGB1/TLR4信號通路與ARDS

目前已知HMGB1 的受體有10 余種，但是被廣泛研究且作用明確的主要是TLR4 和RAGE。HMGB1可以引發(fā)包括炎癥在內的多種細胞反應，通過與TLR4 結合介導炎癥過程的激活［28］。隨著各類研究的不斷深入，HMGB1/TLR4 信號通路介導炎癥反應的作用機制更加明確，通過調控HMGB1/TLR4信號軸可以緩解病毒性肝炎時的肝損傷［29］；抑制HMGB1/TLR4/NF-κB 通路可以降低骨關節(jié)炎患者血清中TNF-α、IL-1β和IL-6水平，從而減輕關節(jié)炎癥反應［30］。最新研究證實，HMGB1/TLR4 信號通路調控的炎癥反應在肺部損傷中同樣具有重要作用，通過收集放射性肺損傷小鼠支氣管肺泡灌洗液進行檢測，發(fā)現HMGB1、TLR4、TNF-α、IL-1β 和IL-6 表達水平均有上升；而且通過培養(yǎng)小鼠白化病上皮細胞和小鼠單核細胞發(fā)現，細胞中TLR4 的表達增加，但是當使用不含HMGB1 的條件培養(yǎng)基時，TLR4 的表達卻未見明顯變化［31］。另有研究表明，在小鼠哮喘模型中，通過競爭性抑制HMGB1與TLR4的結合，可以減少下游NF-κB 的釋放，減輕炎癥反應，從而改善小鼠的哮喘癥狀［32］。為了確認HMGB1/TLR4信號通路和ALI/ARDS之間的相關性，有研究向小鼠氣管內滴注不同劑量rHMGB1，結果發(fā)現，rHMGB1以劑量依賴方式誘導ALI/ARDS 發(fā)生，通過肺部病理切片可以觀察到明顯的ARDS 損傷，包括肺泡間隔增厚、間質水腫、血管充血和間質中性粒細胞浸潤，檢測相關指標發(fā)現TLR4 蛋白、TLR4 mRNA 和促炎細胞因子的表達水平明顯升高，且肺損傷以及促炎細胞因子水平在抑制TLR4 后有所下降［33］。Tadie 等［34］發(fā)現，在小鼠 ALI/ARDS 模型中，TLR4 通過DAMPs 識別HMGB1，誘導中性粒細胞外誘捕網的過度形成，促進TNF-α 和IL-1β 等促炎因子的產生，以及血管內皮損傷和滲漏，加重ARDS 小鼠肺部損傷及炎癥反應。因此，可以推測HMGB1/TLR4信號通路調控的炎癥反應在ALI/ARDS 的病理過程中扮演重要角色，通過尋找針對HMGB1、TLR4 和HMGB1/TLR4 信號通路的拮抗劑可以為臨床治療ALI/ARDS 的肺部損傷并改善其預后提供新的思路。

在抑制HMGB1依賴性炎癥過程中，已經出現針對阻斷HMGB1/TLR4 信號通路的拮抗劑?？笻MGB1抗體和重組HMGB1 A盒蛋白在多種炎癥疾病模型中已顯示出顯著效果［35］。在HMGB1 誘導的人巨噬細胞的研究中，P5779 被認定為一種特異性MD-2 拮抗劑，可競爭性抑制 HMGB1 與 MD-2 的結合，從而抑制TLR4信號的傳導，減少TNF的釋放；而葉酸、甲氨蝶呤因與P5779具有相似的結構，低濃度的葉酸和甲氨蝶呤在HMGB1 誘導的人巨噬細胞研究中均有抑制TNF釋放的作用。因此，葉酸、甲氨蝶呤也可能作為減輕該類炎癥的藥物［36-37］。抗HMGB1 m2G7 可以與HMGB1 A 盒中的一個表位結合（位于HMGB1 序列的氨基酸53-63），影響HMGB1 與 RAGE 和 TLR4 相互作用；在脂多糖誘導的大鼠敗血癥模型的研究中，應用抗HMGB1 m2G7治療后小鼠生存率明顯提高［38-39］。白藜蘆醇可以通過激活SIRT1 以抑制HMGB1/TLR4/MyD88/NF-κB信號傳導和隨后的神經炎癥反應［40］；在大鼠哮喘模型的研究中也證實其可下調肺組織中HMGB1、TLR4、MyD88和NF-κB mRNA的表達及降低氣道壁厚度［41］。右美托咪定則是通過激活膽堿能抗炎途徑下調 TLR4 的表達來減輕炎癥反應［27，42］。此外，抗HMGB1 單抗10-22、血栓調節(jié)蛋白、觸珠蛋白、二甲雙胍等HMGB1 受體拮抗劑也被證實對多個炎癥疾病模型有治療作用［43-44］。但在ARDS 的臨床診療中尚鮮見應用針對阻斷HMGB1/TLR4信號通路拮抗劑療效的相關報道，可見今后在該方向還具有廣闊的探索空間。

5 總結與展望

HMGB1 可通過與 TLR4 結合在 ARDS 中發(fā)揮促炎作用，誘導下游炎癥通路的激活，刺激大量促炎因子的釋放，使各種促炎因子相互作用，進一步放大炎癥反應，最終導致ALI/ARDS 肺部損傷的加重，但是HMGB1/TLR4 信號通路在ARDS 肺部損傷中作用的具體機制還需進一步闡明。除此之外，目前HMGB1/TLR4拮抗劑已在多種炎癥疾病模型中取得了進展，但臨床研究仍未見顯著成效。因此，尋找更明確的HMGB1/TLR4 信號通路在ALI/ARDS 的發(fā)生和發(fā)展中作用的證據，以及開發(fā)新型、有效的HMGB1/TLR4 拮抗劑可能為今后ARDS 的治療提供更多的選擇。