牛病毒性腹瀉膠體金檢測(cè)中樣本類(lèi)型和相關(guān)干擾物研究

高 萌，孫曉笛，陸維克

（杭州奧泰生物技術(shù)股份有限公司，浙江 杭州 310018）

牛病毒性腹瀉病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）所引起的疾病也稱(chēng)為黏膜病，是世界范圍內(nèi)牛的一種常見(jiàn)感染性疾病[1]，也是最重要的牛病之一[2]。BVDV是黃病毒科瘟病毒屬的一個(gè)成員[3]，可感染各年齡階段的牛，年齡越小易感性越高。BVDV能夠引起包括呼吸系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)在內(nèi)的多個(gè)器官系統(tǒng)疾病[4-5]，具體臨床表現(xiàn)通常取決于感染病毒毒株的毒力，主要造成患病母牛的生育力和產(chǎn)奶量下降、流產(chǎn)以及胎兒生長(zhǎng)緩慢等情況[6]。即使母牛妊娠期滿后能夠順利產(chǎn)下?tīng)倥＃瑺倥s對(duì)該病毒具有“免疫耐受”的現(xiàn)象。持續(xù)感染小牛（PI）是群體中新的重要傳染源[7-8]，主要通過(guò)分泌的體液持續(xù)釋放大量病毒。在幼牛身上的短暫感染（TI）可能會(huì)引起皮炎、上消化道潰瘍、發(fā)熱、腹瀉、白細(xì)胞減少咳嗽等癥狀，甚至導(dǎo)致死亡[9]。牛病毒性腹瀉在世界各國(guó)普遍存在，可嚴(yán)重影響牛的繁殖和生產(chǎn)，對(duì)養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。牛病毒性腹瀉雖然以其主要宿主命名，但在非牛物種中也具有一定的流行率。大多數(shù)野生反芻動(dòng)物對(duì)BVDV易感，多種家養(yǎng)非牛類(lèi)物種也可攜帶和傳播此病，大多數(shù)呈短暫感染所致常見(jiàn)的BVDV綜合征，如生殖功能不全、呼吸道疾病和免疫抑制。目前牛源性傳播的可能性雖尚未完全確定，但已有研究在羊、豬、水牛、鹿和駱駝等動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)BVDV，且已證明BVDV可在羊牛間進(jìn)行傳播[10-13]。

目前尚無(wú)治療BVDV的特效藥物，預(yù)防主要通過(guò)接種弱毒疫苗和滅活疫苗提高牛機(jī)體的自身免疫力[14]。盡管已有商業(yè)疫苗可用，但市面上的許多滅活疫苗和改良活疫苗僅可應(yīng)用于控制部分BVDV基因。有研究表明，接種疫苗在對(duì)新斷奶牛犢的預(yù)防效果上仍存在一定缺陷[15]。因此，明確該病的發(fā)病原因、加強(qiáng)牛群的免疫保護(hù)機(jī)制，并及時(shí)做出診斷和防治、降低感染風(fēng)險(xiǎn)，可有效降低牛產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)損失。

1 病原特征

BVDV是一種病毒性疾病，病原體在顯微鏡下呈球形，直徑約為30 mm。BVDV通常為單鏈的RNA結(jié)構(gòu)，有囊膜。在低溫環(huán)境下，病原體能夠長(zhǎng)期保存且保持良好的活力，高溫和紫外線照射會(huì)對(duì)BVDV產(chǎn)生較強(qiáng)的滅活能力[16]。BVDV的基因組全長(zhǎng)約12.3 kb，包含一個(gè)單一的開(kāi)放閱讀框架（ORF），編碼一種多聚蛋白；該多聚蛋白可協(xié)同和翻譯后加工為成熟的病毒蛋白，ORF兩側(cè)有5'和3'非翻譯區(qū)（UTRs）[17]。根據(jù)對(duì)BVDV基因組5'端非編碼區(qū)、N末端自身蛋白酶（NPro）區(qū)或包膜糖蛋白（E2）區(qū)部分序列的系統(tǒng)發(fā)育分析，BVDV通常分為兩個(gè)不同的遺傳物種，即BVDV-1和BVDV-2。BVDV-1毒株是主要毒株，分布于世界各地；BVDV-2毒株主要存在于美國(guó)、加拿大和南美洲，也有研究報(bào)道存在于歐洲和亞洲[18]。1980年，中國(guó)首次發(fā)現(xiàn)感染BVDV的病例，病毒毒株分離自一個(gè)流產(chǎn)的牛胎（命名為changchun 184號(hào)）。

截至目前，BVDV在中國(guó)各地廣泛傳播，具有很高的流行率和豐富的遺傳多樣性。因BVDV具有較強(qiáng)的傳播能力和感染能力，牛染病后的血液、眼鼻分泌物、尿液、精液、初乳（或乳汁）以及糞便中均含有病原，從而導(dǎo)致其他易感牛發(fā)病?；疾∨？祻?fù)之后可能長(zhǎng)時(shí)間攜帶病毒，并且反復(fù)發(fā)病[19]。

2 牛病毒性腹瀉膠體金抗原檢測(cè)中不同取樣方法比較

2.1 膠體金免疫層析技術(shù)

膠體金免疫層析技術(shù)是將膠體金作為示蹤物應(yīng)用于硝酸纖維素膜上，在特定位置發(fā)生抗原抗體特異性反應(yīng)的一種快速檢測(cè)技術(shù)，以簡(jiǎn)便快速、成本低廉、安全無(wú)毒、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)廣泛應(yīng)用于臨床檢測(cè)中。Feldherr等[20]于20世紀(jì)60年代首次提出，將膠體金作為一種電鏡示蹤標(biāo)志物；之后Faulk等[21]將膠體金作為示蹤物應(yīng)用于免疫組織學(xué)的相關(guān)研究中。同酶聯(lián)免疫標(biāo)記（ELISA）和聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)相比較，膠體金檢測(cè)技術(shù)具有更加簡(jiǎn)單、方便、快捷的優(yōu)勢(shì)[22]。近年來(lái)，膠體金免疫層析技術(shù)在檢測(cè)應(yīng)用市場(chǎng)擁有廣闊的發(fā)展前景，在人類(lèi)自身免疫缺陷病、傳染病、人畜共患病和毒品檢測(cè)等相關(guān)領(lǐng)域均有所涉及。王夢(mèng)露等[23]利用間接膠體金技術(shù)建立了一種針對(duì)人血清中抗環(huán)瓜氨酸肽（CCP）抗體含量的定量檢測(cè)方法，并對(duì)試驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，以滿足臨床檢驗(yàn)的需要。

在動(dòng)物診斷中，膠體金免疫層析技術(shù)也具有廣泛的應(yīng)用。為快速檢測(cè)及診斷犬細(xì)小病毒及其引起的傳染性疾病，劉潔等[24]研制了犬細(xì)小病毒膠體金檢測(cè)試紙條，經(jīng)特異性研究試驗(yàn)及與血凝試驗(yàn)的對(duì)比，證明其具有良好的敏感性和特異性，與進(jìn)口產(chǎn)品的總符合率為98%。有研究采用膠體金標(biāo)記豬瘟病毒抗原，通過(guò)雙抗原夾心法建立豬瘟抗體檢測(cè)體系，對(duì)不同養(yǎng)豬場(chǎng)收集的20例可疑病例進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，膠體金性能與間接血凝和IDEXX實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)基本一致，總體符合率均在98%以上，具有較高的靈敏度，適用于豬瘟的臨床診斷[25]。大量相關(guān)研究報(bào)道，膠體金技術(shù)在動(dòng)物疾病診斷中能夠獲得比較高的檢出率，表現(xiàn)出良好的特異性[26-28]。因此，將此技術(shù)廣泛應(yīng)用于動(dòng)物疾病診斷方面的價(jià)值非常高[29]。

2.2 不同取樣方法檢測(cè)比較

牛病毒性腹瀉抗原檢測(cè)的樣本類(lèi)型有多種，如血液（血清）、奶樣、耳組織和鼻咽拭子。成年牛尾靜脈采血較為方便，但對(duì)于犢牛而言，采樣流程比較費(fèi)時(shí)費(fèi)力，采血的難度較大，且在血樣采集時(shí)牛極易出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而對(duì)牛的健康情況造成傷害。奶樣的采集方法相對(duì)簡(jiǎn)單、方便、安全，對(duì)?；静辉斐捎绊?，但缺點(diǎn)是適用范圍較小，僅能夠?qū)嵤┯诿谌榕Ｈ?，無(wú)法檢測(cè)非泌乳牛群。耳組織的采樣方法更快速、損傷小，只需采集約2~3 mm的樣品，對(duì)牛幾乎不會(huì)造成損傷，尤其在飼喂時(shí)進(jìn)行采集更省時(shí)省力[30]。鼻咽拭子的采集方法則更加簡(jiǎn)潔，使用棉簽在牛鼻腔和咽喉部位輕輕刮取即可進(jìn)行快速的樣品采集，對(duì)牛完全沒(méi)有損傷。

若母牛曾感染過(guò)BVDV或接種過(guò)BVDV疫苗，犢?？蓴z入富含BVDV免疫球蛋白的初乳。已有研究表明，在使用抗原捕獲酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ACE）時(shí)，血清樣本和耳部組織樣本獲得的結(jié)果之間存在差異；在犢牛攝入初乳后，血清樣本呈陰性，但耳組織樣本在不同的生長(zhǎng)發(fā)育階段均呈BVDV陽(yáng)性[31]，即血清中源自初乳的抗體在PI犢牛中產(chǎn)生假陰性結(jié)果。因此，耳組織樣本被認(rèn)為是能夠解決初乳衍生抗體干擾的一種解決方案。在存在初乳來(lái)源抗體的情況下采用ACE檢測(cè)，除耳組織外，血清、鼻拭子和唾液拭子均受到3周齡以下?tīng)倥３跞檠苌贵w的干擾[32]，其中鼻拭子的影響小于血清和唾液拭子，耳組織樣本的影響最小。

3 牛病毒性腹瀉抗原檢測(cè)的假陽(yáng)性

3.1 其他抗體干擾

牛的血液樣本（全血、血清、血漿）中可能存在其他抗體的干擾，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果呈假陽(yáng)性。血清或血漿中的內(nèi)源性異嗜性抗體，可與其他種屬的免疫球蛋白進(jìn)行結(jié)合，包括作為免疫分析試劑的異源抗體。上述抗體可對(duì)免疫檢驗(yàn)體系產(chǎn)生干擾，造成與實(shí)際分析物濃度無(wú)關(guān)的虛高檢測(cè)值，存在很大概率導(dǎo)致誤診。在人自身免疫性疾?。ˋDS）的免疫系統(tǒng)中會(huì)產(chǎn)生多種自身抗體，如類(lèi)風(fēng)濕因子（RF）、抗環(huán)瓜氨酸肽（抗CCP）和抗核抗體（ANA），可能導(dǎo)致交叉反應(yīng)和血清學(xué)檢測(cè)的假陽(yáng)性結(jié)果。

免疫分析的假陽(yáng)性結(jié)果往往是由于自身抗體、異嗜性抗體和血清中的補(bǔ)體與檢測(cè)試劑中的抗體結(jié)合導(dǎo)致，但這些結(jié)合往往是非特異性的，且弱于特異性反應(yīng)。在SARSCoV-2抗體檢測(cè)中，血清中高類(lèi)風(fēng)濕因子（RF）水平升高可能導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果，尿素解離試驗(yàn)有助于降低假陽(yáng)性結(jié)果的發(fā)生率，使用高純度的抗體和適當(dāng)?shù)淖钄鄤┯兄谔岣咂錂z測(cè)的特異性[33]。因此，推測(cè)BVDV抗原檢測(cè)假陽(yáng)性的出現(xiàn)可能與患牛的血液樣本中存在其他抗體的干擾有關(guān)。

3.2 藥物和樣本基質(zhì)成分干擾

在牛病毒性腹瀉檢測(cè)過(guò)程中，藥物和樣本基質(zhì)成分會(huì)對(duì)測(cè)試結(jié)果造成假陽(yáng)干擾。首先，患牛若在測(cè)試之前服用過(guò)其他藥物，藥物將會(huì)通過(guò)體內(nèi)代謝作用改變待測(cè)血液樣本的濃度和pH值，造成假陽(yáng)性。其次，由于藥物本身或其代謝產(chǎn)物對(duì)免疫分析產(chǎn)生的效應(yīng)造成體外干擾。再次，血液樣本（全血、血清、血漿）基質(zhì)中含有的其他成分和本身的不穩(wěn)定性也可能產(chǎn)生假陽(yáng)性干擾。

其中，血漿樣本的主要干擾因素是血漿中含有纖維蛋白原和抗凝劑。在遠(yuǎn)程運(yùn)輸中，血清樣本的某些物質(zhì)會(huì)發(fā)生不穩(wěn)定性釋放?？鐕?guó)運(yùn)輸?shù)膶?duì)照血清在測(cè)試中出現(xiàn)了陽(yáng)性干擾，此干擾是由于運(yùn)輸過(guò)程中對(duì)照血清的非酯化脂肪酸釋放造成的。據(jù)推測(cè)，非酯化脂肪酸進(jìn)行非特異性地結(jié)合血清蛋白，發(fā)生了競(jìng)爭(zhēng)抗體結(jié)合位點(diǎn)現(xiàn)象，導(dǎo)致了測(cè)試結(jié)果的假陽(yáng)性。也有試驗(yàn)表明，某廠家的牛病毒腹瀉病毒抗原即時(shí)檢測(cè)產(chǎn)品在測(cè)試患牛血液樣本時(shí)會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性，更換使用耳組織樣本檢測(cè)且其他條件保持不變時(shí)，則不存在假陽(yáng)干擾[32]。因此，在BVDV抗原的膠體金檢測(cè)中，患牛的血液樣本可能存在干擾物質(zhì)造成結(jié)果異常，此時(shí)可選用耳組織進(jìn)行檢測(cè)。

4 結(jié)論

綜上所述，在牛病毒性腹瀉BVDV抗原檢測(cè)的不同取樣方法比較中，奶樣適用范圍小，血樣采集難度大，且在初乳喂養(yǎng)的PI犢牛檢測(cè)中存在誤差。鼻拭子和唾液拭子上清液在初乳衍生抗體存在的情況下，表現(xiàn)出與血清相似的檢測(cè)局限性。耳組織是相對(duì)較好的樣本選擇，取樣快速，對(duì)牛的損傷小，還能夠避免初乳衍生抗體干擾問(wèn)題。此外，血液樣本（全血、血清、血漿）中假陽(yáng)性的出現(xiàn)可能是由于存在其他抗體、藥物和基質(zhì)成分的干擾。

為提高后續(xù)BVDV抗原檢測(cè)的臨床診斷和治療水平，加強(qiáng)對(duì)血液樣本中產(chǎn)生的假陽(yáng)性原因分析并做出合理的解決方案，建議采用更加簡(jiǎn)便、快捷的耳部組織樣本取樣方法，減少初乳衍生抗體和假陽(yáng)干擾。