紅毛丹果皮花色素苷鑒定及其穩(wěn)定性分析

李奕星，陳 嬌，李芬芳，洪克前，袁德保

（1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院?？趯?shí)驗(yàn)站 海南省香蕉遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 海口 571101；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所 海南省熱帶園藝產(chǎn)品采后生理與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088）

果實(shí)外觀色澤是其品質(zhì)性狀的重要評價(jià)指標(biāo)之一，良好的色澤能提高果實(shí)的商品性。紅毛丹因其果實(shí)鮮紅的色澤、獨(dú)特的風(fēng)味而深受消費(fèi)者喜愛。然而，紅毛丹誘人的果皮極易褪色與褐變，這是限制紅毛丹長期貯運(yùn)、導(dǎo)致其貨架期短和商品價(jià)值降低的主要因素。據(jù)報(bào)道，紅毛丹的果皮色素為花色素苷[1]?；ㄉ剀諏儆诙喾宇愇镔|(zhì)，分布于植物的根、莖、葉、花、果實(shí)等液泡中，賦予植物以紅、橙、黃、藍(lán)、紫等種顏色[2]，富含花色素苷的果蔬歷來是人們喜歡的食物原料，而花色素苷的變化是影響花與果實(shí)外觀顏色變化的重要因素?；ㄉ剀帐且环N水溶性黃烷類植物色素，在自然狀態(tài)下，植物組織中的花色素苷非常穩(wěn)定，日照、溫度等對其幾乎沒有影響。但是，由于花色素苷母核中有活躍的羥基，且花色素苷的陽離子因缺少電子易發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，其穩(wěn)定性易受到溫度、pH 值、光照、氧氣等因素的影響，導(dǎo)致花色素苷降解，呈色也會(huì)發(fā)生變化，這也會(huì)使得貯藏加工過程中果蔬品質(zhì)下降[3]。如在低pH 值下花色苷較為穩(wěn)定，其呈紅色；但是，隨著pH 值的升高，花色素苷迅速變色及降解，促使果皮迅速褐變[4]。過氧化物酶及多酚氧化酶在酚的作用下，可以促進(jìn)花色素苷的降解，使果皮進(jìn)一步褐變[5-6]。因此，了解紅毛丹果皮中花色素苷的主要組成成分及穩(wěn)定性，對于揭示紅毛丹的褐變機(jī)理，防止或減輕果皮褐變具有重要的理論和實(shí)踐意義。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試材與試劑

供試的‘保研-7號’紅毛丹Nephelium lcrppuceumLinn.果實(shí)購于海南省?？谑?，選擇成熟度一致、色澤一致、無蟲無病害的新鮮果實(shí)作為供試樣品。

甲醇和乙腈（色譜純），德國Merck 公司生產(chǎn)；甲酸（液質(zhì)純），美國賽默飛世爾科技公司生產(chǎn)；色譜用水為蒸餾水，屈臣氏集團(tuán)有限公司生產(chǎn)；分析用水為純水機(jī)自制水，其他試劑均為分析純。矢車菊素-3-O-葡萄糖苷（批號為wkq19403131）和對照品原花青素B2（批號為wkq19042903）均購于四川省維克奇生物科技有限公司，其純度均大于98%。

1.1.2 儀器與設(shè)備

Thermo Dionex UltiMate 3000 高效液相色譜儀、Thermo Q-Exactive Focus Orbitrap 質(zhì)譜儀，美國賽默飛世爾科技公司；EVOLUTION 300 紫外可見分光光度計(jì)，上海萊?？茖W(xué)有限公司；LRH-250-SE 恒溫恒濕培養(yǎng)箱，廣東泰宏君科學(xué)儀器股份有限公司；FE28-TRI pH 計(jì)，梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 紅毛丹果皮花色素苷提取液的制備

精密稱取一定量的粉碎的新鮮紅毛丹果皮，加入料液比為1∶5（g∶mL）的酸化乙醇（95%的 乙 醇∶1.5 mol·L-1的HCl = 85∶15，V∶V)，于40 ℃的溫度條件下浸提1 h，以4 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心15 min，反復(fù)浸提3 次，合并上清液，并用酸化乙醇定容。

1.2.2 紅毛丹果皮中花色素苷的組分分析

色譜條件：Thermo Scientific Hypersil GOLD aQ 色譜柱（100 mm × 2.1 mm，1.9 μm）， 美國賽默飛世爾科技公司；所用檢測器為二極管陣列（DAD）檢測器，流動(dòng)相（體積分?jǐn)?shù)）由A（0.1%的甲酸水）與B（100%的乙腈）組成。流動(dòng)相洗脫梯度：0 ～2 min，95%～90%，A；2 ～5 min，90% ～85%（A）；5 ～12 min，85% ～55%（A）；12 ～15 min，55%～25%（A）；15 ～20 min，25%～5%（A）；20 ～20.1 min，5%～95%（A）；20.1 ～25 min，95% （A）。流速為0.3 mL·min-1，柱溫為35 ℃，進(jìn)樣量為2 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI）；正離子模式下檢測（Positive）；數(shù)據(jù)采用一級母離子全掃描和數(shù)據(jù)依賴性前三強(qiáng)二級子離子掃描模式（Full Scan-ddMS2）；掃描范圍：120 ～1 500 m·z-1；分辨率：35 000；毛細(xì)管溫度：320 ℃；鞘氣壓力為30 Arb；輔助氣壓力為 10 Arb；噴霧電壓為3.5 kV；碰撞能量：50 V。

1.2.3 紅毛丹果皮中花色素苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定

用紫外可見分光光度計(jì)，在波長為400 ～700 nm 處，對紅毛丹果皮花色素苷的提取液進(jìn)行光譜掃描，以確定最大吸收波長；采用pH 示差法[7]測定紅毛丹果皮中花色素苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，設(shè)3次重復(fù)，按如下公式計(jì)算花色素苷含量（JT，mg·kg-1）：

JT(mg·kg-1) = (A/ε)×MW×DF×V/Wt；

A=ApH1.0(A535nm-A700nm)-ApH4.5(A535nm-A700nm)。

式中：ε表示消光系數(shù)（L·mol-1），取值為26 900 L·mol-1；MW表示矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的摩爾質(zhì)量（g·mol-1），取值為449.2 g·mol-1；DF表示稀釋倍數(shù)；V表示提取液體積（mL）；Wt表示樣品質(zhì)量（g）；A表示提取液在pH 值分別為1.0 和4.5 時(shí)吸光值的差值，ApH1.0、ApH4.5分別表示提取液pH 值分別為1.0 和4.5 時(shí)的吸光值，A535nm表示提取液在535 nm 處的吸光值，A700nm表示提取液在700 nm 處的吸光值。

1.2.4 溫度對紅毛丹果皮中花色素苷穩(wěn)定性的影響

取4 份紅毛丹果皮的花色素苷提取液，每份各取1 mL，用酸化乙醇定容至25 mL，然后將其分別置于4、12、25、40 ℃的溫度條件下避光恒溫保存，再分別于保存后的0、2、4、6、8 d 測定波長為535 nm處的吸光值（A）。每個(gè)處理各設(shè)3 次重復(fù)，以花色素苷的保存率（R）表示測定結(jié)果，以此分析不同溫度對紅毛丹果皮花色素苷穩(wěn)定性的影響情況。

R=A/A0，A0為初始吸光值。

1.2.5 光照對紅毛丹果皮花色素苷穩(wěn)定性的影響

參照吳春太等[8]的方法，取3 份紅毛丹果皮花色素苷提取液，每份各取1 mL，用酸化乙醇定容至25 mL，然后將其分別置于日光燈、自然光、黑暗條件下保存，每隔1 h 取樣1 次，測定波長為535 nm 處的吸光值，計(jì)算花色素苷的保存率（R）。每個(gè)處理各設(shè)3 次重復(fù)。

1.2.6 食品添加劑對紅毛丹果皮花色素苷穩(wěn)定性的影響

取4 份花色素苷提取液，每份各取1 mL，分別加入24 mL 的蒸餾水、5%的葡萄糖溶液、5%的蔗糖溶液、5%的檸檬酸溶液，搖勻，避光保存5 d，每天取樣測其在波長為535 nm 處的吸光值，計(jì)算花色素苷的保存率（R）。以蒸餾水為對照（CK），每個(gè)處理各設(shè)3 次重復(fù)。

1.2.7 pH 值對紅毛丹果皮花色素苷穩(wěn)定性的影響

參照于聰?shù)萚9]的方法（稍有改動(dòng)）測定紅毛丹果皮中花色素苷的穩(wěn)定性。取4 份花色素苷提取液，每份各取1 mL，然后用pH 值分別為1、2、3、4、5、6、7 的緩沖液將其定容至25 mL，定容24 h 后，測定其波長為535 nm 處的吸光值，計(jì)算花色素苷的保存率（R）。每個(gè)處理各設(shè)3 次重復(fù)。

1.2.8 氧化劑和還原劑對紅毛丹果皮花色素苷穩(wěn)定性的影響

參照宋鵬等[10]的方法（稍有改動(dòng)）測定紅毛丹果皮中花色素苷的穩(wěn)定性。以H2O2為氧化劑，以Na2SO3為還原劑，配制濃度分別為0.5%、1.0%、2.0%、3.0%的H2O2溶液和Na2SO3溶液，取2 mL紅毛丹果皮花色素苷提取液，分別加入不同濃度的H2O2溶液或Na2SO3溶液至25 mL，搖勻后將其置于暗處，2 h 后測定其在波長為535 nm 處的吸光值，計(jì)算花色素苷保存率（R），每個(gè)處理各設(shè)3 次重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析；所有試驗(yàn)均設(shè)3 次重復(fù)，取其（平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差）表示試驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅毛丹果皮花色素苷組分分析

紅毛丹果皮中花色素苷的化學(xué)成分見表1。由表1可知，紅毛丹果皮花色素苷共檢測出36 種化合物，通過與已有文獻(xiàn)比對，推斷出的化合物有32 種，其分別為：芍藥花素[11]、原花青素B2[12]、天竺葵素異構(gòu)體[11]、天竺葵素異構(gòu)體[11]、兒茶素[12]、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷[13]、矢車菊素-3-O-蕓香糖苷[13]、芍藥花素-3-O-蕓香糖苷[14]、矢車菊素-3-O-木糖苷[13]、(-)-兒茶素沒食子酸酯[15-16]、矢車菊素-3-O-戊糖[17]、原花青素B 型[12]、飛燕草素-3-O-蕓香糖苷[13]、飛燕草素-3-O-葡萄糖苷[13]、矢車菊素-3-O-蕓香糖苷異構(gòu)體[18]、矢車菊素-3-O-蕓香糖苷異構(gòu)體[18]、矢車菊素-3-O-己糖苷[19]、飛燕草素-3-O-阿拉伯糖苷[12]、(-)-表兒茶素沒食子酸酯[15-16]、矢車菊素-3-O-蕓香糖苷[14]、矮牽牛素-3-O-蕓香糖苷[14]、矢車菊素異構(gòu)體[11]、矮牽牛素-3-O-葡萄糖苷[13]、芍藥花素-3-O-蕓香糖苷[13]、芍藥花素-3-O-葡萄糖苷[13]、錦葵色素-3-O-葡萄糖苷[12]、矢車菊素-3-O-戊糖苷[20]、原花青素A2[21]、飛燕草素[11]、矢車菊素異構(gòu)體[11]、矮牽牛素[11]、錦葵色素[11]?？梢?，紅毛丹果皮花色素苷的主要成分分別為矢車菊素（cyanidin）、飛燕草素（delphinidin）、天竺葵素（pelargonidin）、矮牽牛素（petunidin）、芍藥花素（peonidin）、錦葵色素（malvidin），其連接的糖主要有葡萄糖和蕓香糖。

表1 紅毛丹果皮中花色素苷類的化學(xué)成分Table 1 Anthocyanins composition of rambutan pericarp

2.2 紅毛丹果皮花色素苷的紫外最大吸收波長及質(zhì)量分?jǐn)?shù)

掃描可知，紅毛丹果皮花色素苷提取液的最大吸收波長為535 nm。用pH 示差法計(jì)算得出的紅毛丹果皮花色素苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（0.119±0.003）mg·g-1。

2.3 溫度對紅毛丹果皮花色素苷穩(wěn)定性的影響

將紅毛丹果皮花色素苷提取液分別放置于不同的溫度條件下，不同天數(shù)后其花色素苷的保存率如圖1所示。由圖1可知，放置于不同溫度下的花色素苷提取液，其花色素苷的保存率隨著放置時(shí)間的延長均下降，且不同溫度條件下花色素苷保存率的差異顯著，說明溫度對紅毛丹果皮花色素苷有較大的影響。放置8 d 后，置于4、12、25、40 ℃下的提取液其花色素苷保存率分別為87.96%、78.32%、36.53%、23.03%。由此可見，花色素苷的耐熱性差，低溫可以抑制其降解。

圖1 溫度對紅毛丹果皮花色素苷穩(wěn)定性的影響Fig.1 Effects of temperature on the stability of the anthocyanins in rambutan pericarp

2.4 光照對紅毛丹果皮花色素苷穩(wěn)定性的影響

將紅毛丹果皮花色素苷提取液分別放置于自然光、日光燈、避光條件下，不同天數(shù)后其花色素苷的保存率如圖2所示。由圖2可知，放置于自然光、日光燈、避光條件下8 d 后，提取液中花色素苷的保留率分別為35.50%、49.37%、53.70%，其保存率均呈下降趨勢。其中，放置于自然光下的提取液其花色素苷保留率的下降最為顯著，其次是放置于日光燈下的，說明避光條件可以有效抑制花色素苷的降解。因此，應(yīng)注意將紅毛丹果皮花色素苷置于避光條件下保存。

圖2 光照對紅毛丹果皮花色素苷穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effects of light on the stability of the anthocyanins in rambutan pericarp

2.5 食品添加劑對紅毛丹果皮花色素苷穩(wěn)定性的影響

將分別加入了3 種食品添加劑的紅毛丹果皮花色素苷提取液置于避光條件下保存不同天數(shù)后，提取液中花色素苷的保存率如圖3所示。由圖3可知，3 種食品添加劑對提取液中的花色素苷均有降解作用，添加了檸檬酸的提取液其花色素苷相對穩(wěn)定，放置8 d 后，其花色素苷的保存率一直顯著高于其余3 個(gè)處理的，放置期結(jié)束后，其花色素苷的保存率為70.85%，而添加了葡萄糖、蔗糖的處理組與對照組的提取液中花色素苷的保存率分別為35.97%、46.77%和40.94%。因此，檸檬酸可以維持紅毛丹果皮花色素苷的穩(wěn)定性。

圖3 食品添加劑對紅毛丹果皮花色素苷穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effects of food additives on the stability of the anthocyanins in rambutan pericarp

2.6 pH 值對紅毛丹果皮花色素苷穩(wěn)定性的影響

用于定容紅毛丹果皮花色素苷溶液的緩沖液的pH 值對其花色素苷的最大吸收波長及穩(wěn)定性的影響情況見表2。由表2可知，當(dāng)緩沖液的pH值≤3 時(shí)，紅毛丹果皮花色素苷的最大吸收波長為535 nm，且保存24 h 后其保存率較高；當(dāng)緩沖液的pH 值為1 時(shí)，其保存率最高。隨著緩沖液pH 值的不斷增大，其最大吸收波長發(fā)生紅移現(xiàn)象，花色素苷的保存率迅速下降，當(dāng)緩沖液的pH 值為6 時(shí)，花色素苷的保存率僅為35.50%；而當(dāng)緩沖液的pH 值為7 時(shí)，紅毛丹果皮花色素苷溶液變成了褐色，且無特征吸收峰。由此可見，酸性條件更利于紅毛丹果皮花色素苷的保存。

表2 緩沖液的pH 值對紅毛丹果皮花色素苷的最大吸收波長及穩(wěn)定性的影響Table 2 Effects of pH value of buffer on the stability of the anthocyanins in rambutan pericarp

2.7 氧化劑和還原劑對紅毛丹果皮花色素苷穩(wěn)定性的影響

氧化劑H2O2和還原劑Na2SO3對紅毛丹果皮花色素苷穩(wěn)定性的影響情況見表3。由表3可知，紅毛丹果皮花色素苷對不同濃度的氧化劑和還原劑的耐受性都差，隨著氧化劑H2O2或還原劑Na2SO3濃度的增加，其花色素苷的保存率均急劇下降，說明氧化劑H2O2和還原劑Na2SO3對紅毛丹果皮花色素苷的破壞性均較大。

表3 氧化劑H2O2 和還原劑Na2SO3 對紅毛丹果皮花色素苷穩(wěn)定性的影響Table 3 Effects of H2O2 and Na2SO3 on the stability of the anthocyanins in rambutan pericarp

3 討 論

花色素苷是天然色素的主要成分之一，影響著果實(shí)的商品特性，然而其穩(wěn)定性差。在采后貯運(yùn)中，果皮中的花色素苷會(huì)因?yàn)闇囟取⒐庹?、食品添加劑等因素的影響而發(fā)生變化，這給果實(shí)品質(zhì)的保持帶來了困難。本研究分析了紅毛丹果皮花色素苷的主要成分，并考察了溫度、光照、食品添加劑、緩沖液的pH 值、氧化劑及還原劑對其穩(wěn)定性的影響情況。

不同植物所含花色素苷的主要成分是不同的，相關(guān)研究報(bào)道很多，而關(guān)于紅毛丹果皮花色素苷的主要成分的研究尚未見諸報(bào)道。本研究分析了‘保研-7 號’紅毛丹果皮中花色素苷的組成，結(jié)果表明，‘保研-7 號’紅毛丹果皮花色素苷的主要成分為矢車菊素、飛燕草素等，連接的糖主要有葡萄糖和蕓香糖。而同為無患子科的荔枝果皮，其花色素苷的主要成分為矢車菊-3-蕓香糖苷、矢車菊-3-葡萄糖苷[22]。同一物種不同品種，其花色素苷的主要成分也不一定相同，如‘廣紫9’紫薯花色素苷的主要成分為芍藥素3-咖啡酰-p-羥基苯甲?；碧擒?5-葡糖苷和芍藥素3-咖啡酰-阿魏?；碧擒?5-葡糖苷，而‘廣紫12-87’紫薯花色素苷的主要成分為矢車菊素3-咖啡酰-p-羥基苯甲?；碧擒?5-葡糖苷和矢車菊素3-p-羥基苯甲酰槐糖苷-5-葡糖苷[23]。本研究僅對‘保研-7 號’紅毛丹果皮花色素苷進(jìn)行了定性分析，而有關(guān)紅毛丹不同品種果皮花色素苷的主要成分及含量，有待進(jìn)一步研究。

花色素苷穩(wěn)定性受理化因素的影響較大，容易通過不同途徑降解為無色或者棕褐色的可溶或不溶性產(chǎn)物[24]。低溫條件下，紅毛丹果皮花色素苷較為穩(wěn)定，隨著溫度的上升和放置時(shí)間的延長，花色素苷迅速降解，這與溫度對荔枝果皮[4]、黑果腺肋花楸果[25]花色素苷的影響情況均相似，保存溫度過高時(shí)，花色素苷會(huì)發(fā)生水解或去糖基開環(huán)反應(yīng)，從而形成無色查耳酮或其同分異構(gòu)體α-二酮，然后繼續(xù)降解為酚酸和醛類物[26]。避光條件可以有效抑制紅毛丹果皮花色素苷的降解，這可能因?yàn)榛ㄉ剀盏慕到馐芄庹盏挠绊?，基態(tài)的花色素苷吸收光能后，轉(zhuǎn)變?yōu)榧ぐl(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)花色素苷的C4位發(fā)生水解，生成中間產(chǎn)物C4加合物，隨后該C4 加合物的C2 位水解開環(huán)形成另一中間產(chǎn)物，生成查爾酮，該中間產(chǎn)物繼續(xù)降解生成酚酸和醛類[27]。添加檸檬酸及酸性條件均能維持紅毛丹果皮花色素苷的穩(wěn)定性，這是因?yàn)殡S著pH 值的升高，花色素苷的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，無色的甲醇假堿其比例逐漸增大[28]?；ㄉ剀毡旧硎强寡趸镔|(zhì)的，具有較強(qiáng)的清除自由基能力。研究中發(fā)現(xiàn)，氧化劑H2O2會(huì)使紅毛丹果皮花色素苷的穩(wěn)定性顯著下降，這可能與H2O2為強(qiáng)氧化劑有關(guān)，其可直接親核攻擊花色苷的C2位，使其開環(huán)，引起花色素苷的降解[29-30]；此外，還原劑Na2SO3對紅毛丹果皮花色素苷的破壞性較大，說明紅毛丹果皮花色素苷對還原劑的耐受力極差。

4 結(jié) 論

紅毛丹果皮中花色素苷的組成成分非常豐富且種類多，其主要苷元為矢車菊素與飛燕草素，連接的糖主要有葡萄糖和蕓香糖；其紫外最大吸收波長為535 nm；低溫更利于其保存；避光保存可抑制其降解；添加5%的檸檬酸可以維持其穩(wěn)定性；保存于酸性條件下其穩(wěn)定性好；其對氧化劑和還原劑的耐受性均差。該結(jié)果能為防止或減輕紅毛丹果皮褐變提供理論參考依據(jù)。