多菌靈與β-環(huán)糊精包合物的制備、表征及pH響應(yīng)性行為的研究

姜宇，劉興歡，劉升學，賈鑫

（石河子大學化學化工學院/新疆兵團化工綠色過程重點實驗室，新疆 石河子 832003）

多菌靈（CB）是一種用于防治植物多種真菌病害的內(nèi)吸性殺菌劑。其主要作用機制是干擾真菌有絲分裂中紡錘體的形成，從而影響細胞分裂[1]。此外，CB具有熱穩(wěn)定性、毒性低的優(yōu)點。市場上CB的主要劑型有可濕性粉劑、懸浮劑和水分散顆粒。這些常用劑型能夠在一定程度上提高CB在水中的分散性，但在實際應(yīng)用中仍存在水溶性差、生物利用率低、殘留過多等缺點，極大地限制了CB在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用[2]。利用超分子化學中的主客體匹配原理改善農(nóng)藥原藥的性能是超分子化學在農(nóng)藥學上的主要應(yīng)用，利用大環(huán)分子及其主客體識別來克服上述問題已受到廣泛關(guān)注。

環(huán)糊精（CDs）是1891年Villiers發(fā)現(xiàn)的由淀粉經(jīng)過酶解得到的環(huán)狀寡糖。它們是截錐狀的大環(huán)化合物，具有疏水的空腔和親水的外壁。這種獨特的結(jié)構(gòu)可以包合極性和尺寸合適的小分子化合物，通過主-客體相互作用形成包合物。由于CDs的細胞毒性較低，生物安全性良好，經(jīng)過CDs包合后可以減少或消除藥物的不良副作用。此外，難溶于水的分子可以通過與CDs形成包合物來改善其水溶性，同時改變了其理化性質(zhì)[3]。α-、β-和γ-CD分別由6、7和8個葡萄糖單元組成，是研究最多的環(huán)糊精。特別是，β-CD來源多樣、價格較為低廉，空腔尺寸更適合大多數(shù)疏水性分子嵌入，在醫(yī)藥和農(nóng)藥領(lǐng)域得到了尤為廣泛的應(yīng)用。Lezcano[4]使用相溶解度圖研究了β-CD對CB的增溶效果。Guo[5]和Li[6]研究表明β-CD分子可以與CB形成主客體包合物。Sun[7]進一步采用共沉淀法基于有機溶劑體系制備了CB和β-CD的包合物。但有機溶劑的使用對環(huán)境有害，其后處理也較為困難，增加了生產(chǎn)投入。

由于pH值對CB的溶解性有很大的影響[8]，本研究提出了一種制備CB和β-CD包合物的新方法，即調(diào)節(jié)水溶液的pH法，并對包合物進行表征和分析。該方法不添加任何有機溶劑，符合農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展方向。由于南方的梅雨天導致真菌大量繁殖，研究了包合物在pH=5.4（雨水的pH）的抑菌效果，其相較于CB原藥顯示出更加優(yōu)異的抑菌效果。對比了包合物在pH為5.4和7.8（正常灌溉用水的pH）的釋放情況，發(fā)現(xiàn)其具有pH響應(yīng)性釋放特性。這有利于CB的靶向應(yīng)用，大大提高了CB的生物利用率，保護了環(huán)境。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

紫外-可見分光光度計（Agilent Cary 60，德國）；熱重分析儀（STA 449F3，NETZSCH德國）；粉末X射線衍射儀（Panalytical X’Pert PRO，瑞士）；紅外光譜儀（Bruker Vertex 70V，瑞士）；掃描電鏡（SU8010，HITACHI日本）；核磁共振儀（Bruker Avance Ⅲ HD 400，瑞士）。

β-CD（純度>99.0%，分子量=1 135.0），CB，NaOH （AR）均購買于上海阿達瑪斯試劑有限公司。HCl（36.5 wt.%）購買于臨沂茂興化工有限公司。磷酸鹽緩沖溶液（pH為5.4和7.8）由KH2PO4（AR）和K2HPO4·3H2O（AR）按一定比例配制而成。早疫病菌由石河子大學農(nóng)學院提供。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）購買于青島海博生物科技有限公司。實驗使用的水均為超純水。

1.2 包合物與物理共混的制備

環(huán)糊精包合物的制備方法主要有溶劑揮發(fā)法，冷凍干燥法，研磨法，噴霧干燥法和共沉淀法等。本工作通過調(diào)節(jié)水溶液的pH來制備CB和β-CD的包合物。將含有0.5 mmol CB的30 mL 0.1 mmol·L-1HCl溶液緩慢加入含有0.5 mmol β-CD的30 mL 0.1 mmol·L-1NaOH溶液，控制反應(yīng)溫度40 ℃，攪拌速度500 r·min-1。滴加完成后，維持溫度和攪拌速度不變，繼續(xù)反應(yīng)4 h后過濾，對濾液進行透析處理，對透析后得到的清液進行冷凍干燥，得到CB和β-CD的包合物，即CB@β-CD complex。

等摩爾的CB和β-CD研磨至混合均勻，40 ℃真空干燥后，得到CB和β-CD的物理混合物，即CB/β-CD mix。

1.3 測試和表征

對CB進行紫外全波長掃描確認其最大吸收波長為285 nm，準確稱量10 mg CB于2 L的容量瓶中，并用超純水定容，超聲使得完全溶解后即制得5 μg·mL-1的CB母液。分別取80、60、40、20 mL母液置于4個100 mL容量瓶中，并用超純水定容，即分別得到4、3、2、1 μg·mL-1的CB溶液。使用超純水作為空白對照，測量5個濃度的CB溶液在285 nm處的吸光度。繪制標準曲線時，CB溶液濃度為橫坐標，在不同濃度下的吸光度作為縱坐標，使用Origin 2018軟件擬合出CB的標準曲線。

采用Higuchi和Connors[9]的方法研究CB在β-CD存在下的相溶解度。在相同體積的不同濃度（0 ～ 20 mmol·L-1）的β-CD水溶液中加入過量的CB。溶液在室溫下攪拌7 d以達到溶解平衡。分離上清液，通過0.22 μm PES濾器過濾。通過測定濾液在CB最大波長處的吸光度來分析CB的濃度。通過CB和β-CD的濃度關(guān)系得到相溶解度圖。

觀察CB、β-CD、CB/β-CD mix、CB@β-CD complex的紫外特征吸收峰。掃描范圍為200～400 nm。以超純水作為空白對照。

熱重分析（TGA）分別取適量的CB、β-CD、CB/β-CD mix、CB@β-CD complex研磨、制樣。N2環(huán)境，升溫速率10 ℃·min-1，溫度范圍25～800 ℃。

對CB、β-CD、CB/β-CD mix以及CB@β-CD complex進行XRD分析。測試條件：掃描角度5～50°，掃描速度5°/min，電壓：45 kV，電流：40 mA。

使用KBr壓片法，測試了CB、β-CD、CB/β-CD mix以及CB@β-CD complex在4000～500 cm-1波數(shù)范圍的紅外吸收數(shù)據(jù)。

使用SEM觀察CB、β-CD、CB/β-CD mix以及CB@β-CD complex的微觀形貌。測試之前，需對樣品噴金。

CB、β-CD以及CB@β-CD complex分別溶于DMSO-d6測定核磁氫譜（1H-NMR），以殘余溶劑峰作為內(nèi)標。

1.4 pH響應(yīng)性釋放實驗

南方的梅雨時節(jié)，真菌大量繁殖。此時對植物做好系統(tǒng)的殺菌就顯得尤為重要，使用的CB會大大增加。由于南方雨水的pH范圍為5.0～6.5，因此選擇pH=5.4來模仿雨水的pH。經(jīng)過測量，選擇pH=7.8模仿灌溉用水的pH。CB分子在低pH下能形成共振穩(wěn)定的陽離子[8]，這是CB分子在低pH下溶解度升高的原因。根據(jù)pH對CB溶解度提高的影響，研究了包合物在pH為5.4和7.8下的釋放效果。使用紫外-可見吸收光譜確定釋放量。

1.5 抑菌實驗

測試了CB和CB@β-CD complex在兩種pH環(huán)境下對早疫病的抑菌活性。使用兩種PBS（0.1 M KH2PO4、K2HPO4按一定比例配制的pH為5.4和7.8的PBS）分別配制100 μg·mL-1的CB和CB@β-CD complex藥液，然后將5 mL的藥液與已融化的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（15 mL，調(diào)整至相應(yīng)的pH）在培養(yǎng)皿中快速混合?？瞻讓φ战M加入相應(yīng)pH值的PBS代替藥物溶液。取PDA平板上培養(yǎng)72 h菌落外緣相同半徑圓周上圓形菌餅（D=5 mm）當混合物凝固后，用接種針將5 mm的菌餅接入平板中心，每個培養(yǎng)皿中只放置一個菌餅。所有培養(yǎng)皿在28 ℃下倒置培養(yǎng)72 h，用十字交叉法測定菌絲生長直徑（cm）。整個實驗要求無菌操作。

2 結(jié)果與討論

2.1 相溶解度研究

相溶解度圖已廣泛應(yīng)用于研究在CDs存在下某些藥物和農(nóng)藥的溶解度[10]。圖1為CB在不同濃度β-CD存在下的相溶解度圖。從圖中可以看出，CB的溶解度隨β-CD濃度的增加呈線性增加，屬于Higuchi和Connors定義的AL型包合物，表明CB與β-CD之間形成1∶1的包合物。通過線性擬合并使用公式（1）計算得到表觀穩(wěn)定常數(shù)（Kf）：

（1）

S0為不含 β-CD時CB的溶解度，slope為相溶解度圖的斜率。

經(jīng)過計算，Kf為7 048.19 M-1, K1∶1大多在50 ～ 2 000 M-1范圍內(nèi)。Kf值的大小說明了β-CD空腔與CB的結(jié)合強度，因此可以看出CB進入β-CD空腔內(nèi)的趨勢較強。

A: CB的標準曲線; B: CB在β-CD存在下的相溶解度圖。圖1 相溶解度圖

2.2 包合物的表征和分析

通過測試CB, β-CD, CB/β-CD mix, CB@β-CD complex的紫外吸收光譜探究包合對CB的影響。如圖2A所示，CB在超純水中的最大吸收在285 nm，而在包合物的譜圖中，最大吸收峰藍移了5 nm。β-CD在200～400 nm范圍內(nèi)沒有特征吸收；物理共混的最大吸收峰是285 nm，這和CB是一致的，表明物理共混并不能影響CB的紫外吸收，也并不能促使包合物形成[11]。與之形成對比的是，包合物的特征吸收發(fā)生了偏移，這種現(xiàn)象說明CB和β-CD之間存在相互作用，其改變了CB的共軛結(jié)構(gòu)，影響了電子云的排布，最終使CB的紫外吸收產(chǎn)生了偏移，證明了包合物的形成。

采用TGA研究了包合物的熱穩(wěn)定性。與熱重結(jié)果對應(yīng)的DTG圖如圖2C所示，從這兩個圖中可以看出，β-CD的失重過程可分為兩個階段，第1階段為69.3～99.6 ℃，這是由于空腔內(nèi)水分子的損失；在320.3～341.8 ℃，大環(huán)的熔融和熱分解使這一階段的失重率達到了69.81%。CB失重了94.88%，此過程開始于213.2 ℃，結(jié)束于328.5 ℃。混合物有3個失重階段，分別是失水階段、CB熱分解階段以及β-CD熱分解階段，由此可以得出物理混合并沒有提高CB的熱分解溫度。

在包合物的熱重曲線中，有2個失重階段，第1階段是由包合物脫水導致的，第2階段是包合物的熱分解過程。可以看出，熱分解溫度為237 ℃，與CB原藥相比，熱分解溫度升高，最終失重率達到95.2%。結(jié)果表明，包合物的熱穩(wěn)定性優(yōu)于CB, TG曲線有力地證明了包合物的成功制備。

A:CB，β-CD，CB/β-CD mix，CB@β-CD complex的;紫外吸收光譜;B:熱重圖; C:微商熱重圖;D:粉末X射線衍射;E:紅外光譜。圖2 CB，β-CD，CB/β-CD mix，CB@β-CD complex的表征和分析圖

使用XRD證明包合物的形成[12]。CB、β-CD、混合物、包合物的XRD圖如圖2D所示。CB和β-CD均有一定的結(jié)晶度，CB的尖峰為10.7、18.6、25.9和28.2°（2θ），晶態(tài)較好；β-CD的特征衍射峰為10.5、12.4和22.8°（2θ）?；旌衔镆簿哂薪Y(jié)晶度，特征衍射峰10.7、12.4、18.6、22.8、22.9、25.9、28.2°（2θ）依然存在，其并沒有改變CB本來的晶態(tài)，簡單的物理共混并不能使兩者產(chǎn)生相互作用[13]。包合物的晶態(tài)性質(zhì)非常不明顯，CB的強衍射峰18.6、25.9、28.2°在包合物中消失，表明CB進入β-CD空腔中形成了包合物，調(diào)節(jié)水溶液pH法制備這一包合物的可行性。

FT-IR可以確定包合物結(jié)構(gòu)中客體分子的存在以及環(huán)糊精與客體分子之間是否形成包合物。包合物、兩種單體以及混合物的紅外光譜如圖2E所示。在CB的譜圖中，在3 056、1 637、1 593、739 cm-1的吸收峰，對應(yīng)于苯環(huán)上的C-H伸縮振動，C=C伸縮振動，C-H彎曲振動；1 712 cm-1是C=O的伸縮振動。β-CD的特征峰主要有3 395、2 924、1 639 cm-1，分別是 -OH，C-H的伸縮振動和H-O-H的彎曲振動。在混合物的紅外光譜中同時出現(xiàn)了CB和 β-CD的尖強特征峰，整體可以看作是兩種化合物的特征吸收峰的簡單疊加。進一步證明簡單的物理混合并不能使兩者發(fā)生主客體相互作用。形成包合物之后，客體分子的吸收峰發(fā)生偏移、消失或減弱，例如1 712 cm-1處的吸收峰明顯減弱，1 637、1 593、739 cm-1處的吸收峰偏移到1 629、1 596、730 cm-1處。這些變化都可以說明β-CD成功包合CB。

2.3 微觀形貌

包合物形成后，進入β-CD空腔的CB分子的結(jié)晶度會大大降低甚至完全消失，同樣地，β-CD分子的晶態(tài)和空間結(jié)構(gòu)也發(fā)生了變化，因此使用SEM可以觀察到形貌特征的變化[14]。如圖3A所示，CB本身呈不規(guī)則片狀，尺寸分布非常分散。β-CD的形貌比CB的更加規(guī)則，并且可以觀察到晶體的厚度，整體為較規(guī)整的顆粒（圖3B）。在圖3C中，混合物有粒狀和片狀兩種形狀，顆粒和片間的界線很清晰，結(jié)合形態(tài)和尺寸，這是β-CD和CB的形態(tài)特征。而當包合物形成后，顆粒和薄片間的界線消失，出現(xiàn)了小晶體顆粒堆積和粘附形成的大塊形貌。包合物的微觀形態(tài)特征與主客體分子以及混合物完全不同，這是由于CB和β-CD之間的主客體相互作用。

A：CB；B：β-CD；C：CB/β-CD mix；D：CB@β-CD complex的掃描電鏡圖。圖3 掃描電鏡圖

2.4 核磁氫譜

核磁氫譜是證明包合物形成的有力手段[15]。CB、β-CD和包合物的核磁氫譜如圖4所示，可以看到每種化學環(huán)境下的氫原子的數(shù)量。表1列出了包合前后的化學位移以及變化?；瘜W位移的改變小于0.15 ppm，因為在包合物中主客體分子間沒有形成實質(zhì)的化學鍵，兩者間的作用力主要包括范德華力、氫鍵和疏水作用力等弱相互作用。因此，與相應(yīng)的客體分子和β-CD相比，形成包合物之后核磁氫譜化學位移改變較?。ㄔ诤舜艢渥V中一般小于0.30 ppm）。

圖4 CB，β-CD，CB@β-CD complex在DMSO-d6中的核磁氫譜

表1 CB，β-CD包合前后的核磁氫譜（在295 K，DMSO-d6中）化學位移及變化

包合物在7～7.5 ppm范圍內(nèi)的多重峰屬于CB芳香區(qū)的質(zhì)子（H-1, 4；H-2, 3），初步證實了CB存在于包合物中。CB的質(zhì)子H-1, 4；H-2, 3以及活潑氫N-H （H-10, 11）在包合物的核磁氫譜中分別位移了-0.057，-0.055和-0.063 ppm。化學位移向高場移動，表明苯環(huán)上的電子密度增加，CB的微環(huán)境發(fā)生了變化，這證明了包合物的形成[16]。β-CD的質(zhì)子H-3, H-5的化學位移在包合物中分別偏移了0.053和0.018 ppm，由于這兩個位置的質(zhì)子都位于β-CD的空腔內(nèi)，H-3靠近空腔的寬口，H-5靠近窄口，所以CB是從寬口進入β-CD的空腔內(nèi)。

對包合物譜圖中的峰積分，7.006 ppm處的峰積分值為2，對應(yīng)苯環(huán)上H-1, 4的兩個質(zhì)子，因此包合物中含有一個CB分子，7.331 ppm的峰也可以得出相同的結(jié)論。β-CD的H-1質(zhì)子的峰在4.825 ppm附近，積分值為7[13]。由于一個β-CD分子含有7個葡萄糖單元，因此含有7個H-1質(zhì)子，即包合物中含有一個β-CD分子。結(jié)果表明，包合物中CB和 β-CD的摩爾比為1∶1，這與相溶解度圖的分析是一致的。核磁氫譜不僅有力地證明了包合物的形成，并且明確了包合物中主客體分子結(jié)合比。

2.5 pH響應(yīng)性釋放

圖5A為包合物在pH 5.4和7.8的釋放曲線，可以看出，經(jīng)過0.5 h，pH=7.8的溶液中出現(xiàn)了少量的CB，但體系中檢測到的CB濃度并沒有隨著時間的推移而增加。這可能是由于有部分未包合的CB分子殘留在包合物中，弱堿性的pH并不會破壞CB和 β-CD之間的弱相互作用，被包合的CB分子無法從 β-CD的空腔中釋放出來，最終pH=7.8的體系中只有極少量的CB。當pH=5.4時，溶液中CB的濃度隨著時間的延長而顯著增加，包合物表現(xiàn)出pH響應(yīng)性的特性。這可能是由于在酸性條件下，一些氫離子會進入β-CD的非極性空腔使CB分子質(zhì)子化，CB由非極性狀態(tài)變?yōu)闃O性狀態(tài)，破壞了CB與β-CD的主客體相互作用，使CB從β-CD的空腔中釋放出來。因此，隨著時間的延長釋放出來的CB逐漸增多，溶液中CB的濃度逐漸增加。在36 h后，溶液中CB濃度基本穩(wěn)定，累積釋放率達到71.06%，該包合物具有pH響應(yīng)性釋放的特性。

A:包合物在pH 為5.4和7.8的釋放曲線；B：CB和包合物在pH 為5.4和7.8的抑菌效果；C：菌落在pH 7.8時（Ⅰ）加入PBS，（Ⅱ）加入CB，（Ⅲ）加入包合物的生長情況以及菌落在pH 5.4時（Ⅳ）加入PBS，（Ⅴ）加入CB，（Ⅵ）加入包合物的生長情況。圖5 藥效對比圖

2.6 抑菌實驗

圖5B是在pH為7.8和5.4時，CB和包合物對菌落生長的抑制情況。pH=5.4時，正常生長菌落的直徑為2.95 cm（圖5C Ⅳ），pH=7.8時，正常生長菌落的直徑為2.85 cm（圖5C Ⅰ），出現(xiàn)這種差異是因為早疫病菌生長的最適pH為5.0～7.0。在pH為5.4和7.8的培養(yǎng)基中加入CB，菌落的生長直徑分別為2.45 cm（圖5C Ⅴ）和2.40 cm（圖5C Ⅱ）。在弱酸性條件下，部分CB分子質(zhì)子化，增加了CB在溶液中的溶解度。早疫病菌在環(huán)境pH和CB的雙重影響下，生長情況略有差異。在pH為5.4和7.8的培養(yǎng)基中加入包合物，菌落生長直徑分別為2.00 cm（圖5C Ⅵ）和2.45 cm（圖5C Ⅲ）。在酸性環(huán)境中，包合物有更好的抑菌效果，說明其具有pH響應(yīng)性。抑菌實驗平行進行3組，同一條件下菌落生長情況的差異體現(xiàn)在圖5B的誤差棒上，可以看到的是，平行實驗間的差異是非常小的，并不影響整體的規(guī)律性。抑菌實驗的結(jié)果與pH響應(yīng)性釋放實驗的結(jié)果相符。尤為重要的是，pH為5.4時，包合物的抑菌效果優(yōu)于CB。說明在特定的環(huán)境刺激下，使用包合物可以明顯減少CB的投入，提高CB的生物利用率。綜上所述，包合物適合在南方的梅雨時節(jié)使用，預(yù)防植物病害。

3 結(jié)論

這項研究使用調(diào)節(jié)水溶液pH法制備了主客體比為1∶1的CB和β-CD包合物。該方法充分利用了客體分子的溶解特性，制備過程不使用有機溶劑，比傳統(tǒng)的制備環(huán)糊精包合物的方法更符合農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展方向。包合物具有pH響應(yīng)性釋放的特性，尤其適合用于南方的梅雨季節(jié)。在弱酸性條件下，相同質(zhì)量的包合物的抑菌效果優(yōu)于CB原藥，大大提高了CB的生物利用率。