海洋酸化和低氧及其節(jié)律性變化對(duì)海蜇碟狀幼體的影響

吳鐘啟悅, 王雷, 陳立飛, 李秀保, 董志軍

1. 海南大學(xué)海洋學(xué)院, 海南 ?？?570228;

2. 海南大學(xué), 南海海洋資源利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 海南 海口 570228;

3. 中國科學(xué)院煙臺(tái)海岸帶研究所, 牟平海岸帶環(huán)境綜合試驗(yàn)站, 山東 煙臺(tái) 264003;

4. 江蘇省鹽城市射陽縣金洋水產(chǎn)原種場, 江蘇 鹽城 224351

化石燃料資源過度開發(fā)和利用等人類生產(chǎn)活動(dòng)導(dǎo)致大氣中pCO2升高, 海洋對(duì)CO2的吸收使得海洋自身的碳酸鹽化學(xué)失衡, 造成海水酸度增加。自工業(yè)革命以來, 全球表層海水pH 已下降了0.1, 預(yù)計(jì)2100 年前表層海水pH 將下降0.3～0.4(Orr et al,2005)。20 世紀(jì)50 年代后, 河口和近岸海域的低氧問題也愈發(fā)嚴(yán)重。陸源營養(yǎng)鹽入海通量增加導(dǎo)致的富營養(yǎng)化是近岸海域低氧區(qū)擴(kuò)大的重要原因(Breitburg et al, 2018)。缺氧現(xiàn)象通常發(fā)生在夏季,由于水體和沉積物中微生物的礦化分解作用, 導(dǎo)致海水底層缺氧, 并通常伴隨著局部pH 降低的酸化過程。目前, 在渤海、黃海、長江口、珠江口和南海部分海域觀測(cè)到海水酸化與低氧的耦合現(xiàn)象(韋欽勝 等, 2017; 宋金明 等, 2021)。同時(shí), 海水pH值和溶解氧又呈現(xiàn)出明顯的晝夜變化特征, 白天光合作用強(qiáng)導(dǎo)致較高的溶解氧水平和pH, 而晚上呼吸作用的增強(qiáng)則導(dǎo)致較低的溶解氧水平和pH(Baumann et al, 2015, 2018; Gobler et al, 2016;Gedan et al, 2017)。

海洋酸化和低氧從多方面影響著不同營養(yǎng)級(jí)海洋生物, 是近岸海洋生態(tài)系統(tǒng)的重要環(huán)境威脅。酸化和低氧對(duì)海月水母(Aurelia aurita)螅狀幼體的研究顯示, 低溶解氧(dissolved oxygen, DO)可使螅狀幼體的無性出芽減少～50%, 酸化對(duì)無性生殖和有氧呼吸均無顯著影響(Treible et al, 2018)。脅迫因素的晝夜節(jié)律變化對(duì)生物體產(chǎn)生的效應(yīng)并不完全一致,因波動(dòng)的周期、幅度和生物體等的不同而異。研究顯示, DO 劇烈波動(dòng)增加了美洲牡蠣(Crassostrea virginica)對(duì)病原體的感染率和致病性, 影響甚至?xí)z留至次年, 而pH 波動(dòng)和雙因素波動(dòng)聯(lián)合對(duì)感染都無顯著影響, DO 和pH 單獨(dú)波動(dòng)及聯(lián)合波動(dòng)都會(huì)刺激血細(xì)胞活性, 但這種活性刺激可能無法有效預(yù)防病原體感染, 劇烈波動(dòng)利于寄生物感染附近種群,擴(kuò)大感染區(qū)阻礙牡蠣恢復(fù)(Keppel et al, 2015)。同樣,三種雙殼類幼體暴露于酸化和低氧實(shí)驗(yàn)顯示, 海灣扇貝(Argopecten irradians)幼體在恒定酸化或低氧下存活率降低、生長和發(fā)育延緩; 硬殼蛤(Mercenaria mercenaria)幼體在恒定酸化下存活率降低、在恒定低氧下發(fā)育延緩; 美洲牡蠣(Crassostrea virginica)幼體在恒定酸化下存活率降低、生長減緩, 且復(fù)合因素暴露相較單因素暴露表現(xiàn)出更大的負(fù)面影響; 該研究中晝夜波動(dòng)的CO2和DO 未完全減輕雙殼類幼體受低氧和酸化的影響,無法為其存活、生長和變態(tài)發(fā)育提供充分緩和(Clark et al, 2016)。但也有研究表明, 晝夜波動(dòng)間歇性應(yīng)激能在一定程度上緩解負(fù)面效應(yīng), 未來持續(xù)性的海洋酸化和缺氧對(duì)厚殼貽貝(Mytilus coruscus)的危害比波動(dòng)性酸化和缺氧更嚴(yán)重。但如果貽貝無法獲得外界能量的供應(yīng)和補(bǔ)償, 其酸化和缺氧會(huì)影響貽貝種群的生存和發(fā)育(Shang et al, 2020)。有關(guān)月銀漢魚(Menidia menidia)研究顯示, 恒定低氧嚴(yán)重降低了胚胎存活率、幼魚存活率、種群半孵化耗時(shí)、孵化時(shí)大小和孵化后幼魚生長速率, 而恒定酸化對(duì)大多數(shù)性狀并無影響。然而, 實(shí)驗(yàn)證實(shí)酸化和低氧的晝夜波動(dòng)降低了這些恒定條件對(duì)月銀漢魚(Menidia menidia)所有響應(yīng)性狀的負(fù)面影響, 而且緩解程度取決于波動(dòng)的幅度, 表明脅迫因素的波動(dòng)可能會(huì)為沿海生物提供周期性的生理庇護(hù), 從而促進(jìn)物種對(duì)氣候變化的適應(yīng)性(Cross et al, 2019)。此外, 這些研究大多集中在鈣化生物上, 而非鈣化生物仍未得到充分研究(Davis et al, 2013)。需多因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)來研究同時(shí)發(fā)生的應(yīng)激源(如海洋酸化和低氧)涉及的生物響應(yīng)。

海蜇(Rhopilema esculentum)隸屬于刺胞動(dòng)物門(Cnidaria)、缽水母綱(Scyphozoa)、根口水母目(Rhizostomeae)、根口水母科(Hizostomadae)、海蜇屬(Rhopilema), 在中國、日本、朝鮮半島沿海和俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)均有分布。海蜇為大型暖水性水母,主要棲息于近岸海域, 其食用價(jià)值及潛在的藥用價(jià)值使之成為我國重要的漁業(yè)資源之一(李云峰 等,2020)。自20 世紀(jì)80 年代以來, 為補(bǔ)充海蜇的種群資源, 遼寧、山東和浙江等多地進(jìn)行了增殖放流、人工育苗和養(yǎng)殖, 但由于海蜇對(duì)環(huán)境適應(yīng)能力較差,其資源日益匱乏的現(xiàn)狀并未得到顯著改善(王國善等, 2014)。海蜇的生活史具有水母體有性浮游世代和水螅體無性底棲世代交替出現(xiàn)的現(xiàn)象。成熟的海蜇水母體營浮游生活, 通過有性生殖產(chǎn)生受精卵,發(fā)育成為浮浪幼蟲, 繼而附著于附著基上變態(tài)為早期的螅狀幼體, 螅狀幼體可進(jìn)行無性生殖, 因環(huán)境條件作用和生存狀況差異, 進(jìn)行足囊生殖形成新的螅狀幼體或橫裂生殖產(chǎn)生碟狀幼體, 碟狀幼體再經(jīng)變態(tài)發(fā)育為水母體, 水母體根據(jù)其發(fā)育狀況再細(xì)分為稚蜇和成蜇(丁耕蕪 等, 1981; 孫婷婷 等,2017)。其中橫裂生殖是海蜇實(shí)現(xiàn)螅狀幼體世代向水母體世代轉(zhuǎn)變的唯一途徑, 海蜇早期生活史幼體階段的種群數(shù)量直接決定海蜇成體的漁業(yè)資源產(chǎn)量, 海蜇浮浪幼蟲的生存附著、螅狀幼體的無性生殖、碟狀幼體的生長發(fā)育均是影響海蜇種群變化的關(guān)鍵階段(Lucas et al, 2012)。本文旨在對(duì)海洋酸化和海洋低氧這兩個(gè)海洋生態(tài)環(huán)境正面臨的重大變化可能對(duì)海蜇碟狀幼體的影響進(jìn)行探討, 為闡明海蜇對(duì)海洋酸化和低氧的響應(yīng)模式和調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ), 以探究未來海洋中的酸化和低氧水平對(duì)海蜇種群發(fā)展的影響水平, 對(duì)于海蜇資源的預(yù)測(cè)和評(píng)估具有重要意義。

本研究設(shè)計(jì)兩個(gè)pH 水平(酸化pH 7.6; 正常pH 8.1)和兩個(gè)溶解氧(DO)水平(低氧 2mg·L–1; 常氧7mg·L–1), 考慮脅迫因素恒定或晝夜節(jié)律性變化,通過測(cè)定傘部直徑、收縮頻率、Ca2+-ATP 酶、Na+K+-ATP 酶、酸性磷酸酶(acid phosphatase, ACP)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, AKP)、過氧化氫酶(catalase, CAT)活力和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量等生理指標(biāo), 從生長和運(yùn)動(dòng)及酸堿平衡、免疫和抗氧化相關(guān)酶活力方面, 分析海蜇(R.esculentum)碟狀幼體在海洋酸化和低氧及其晝夜節(jié)律變化脅迫下的生理響應(yīng)。本文初步探討了海洋酸化和低氧及其晝夜節(jié)律變化對(duì)海蜇碟狀幼體生理代謝和生長發(fā)育等過程的差異影響, 為進(jìn)一步研究水母類群適應(yīng)氣候變化及未來環(huán)境條件下生物多樣性和生態(tài)進(jìn)程的變化趨勢(shì)提供理論依據(jù), 為漁業(yè)發(fā)展和海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

海蜇碟狀幼體采集自鹽城金洋水產(chǎn)原種場, 選擇由螅狀幼體釋放的1 日齡碟狀幼體, 當(dāng)天運(yùn)送至中國科學(xué)院煙臺(tái)海岸帶研究所牟平海岸帶環(huán)境綜合試驗(yàn)站的水母養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)室, 將海蜇碟狀幼體置于玻璃水缸(200L)中, 加入經(jīng)砂濾處理的天然海水, 連通供氣裝置暫養(yǎng)3d, 暫養(yǎng)期間海水溫度18.0±0.5℃、鹽 度(32±0.5)‰ 、 pH 8.10±0.05 、 溶 氧 濃 度(7.0±0.3)mg·L–1。暫養(yǎng)期內(nèi)每日投喂足量鹵蟲無節(jié)幼體(Artemia nauplius)兩次。選擇狀態(tài)良好、結(jié)構(gòu)完整、大小一致(平均傘徑4mm)的碟狀幼體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與海水化學(xué)

實(shí)驗(yàn)采用正交設(shè)計(jì), 兩個(gè)pH 水平(酸化pH 7.6;正常pH 8.1)和兩個(gè)溶解氧(DO)水平(低氧2mg·L–1;常氧7mg·L–1)恒定處理, 以及僅pH 波動(dòng)酸化處理(pH: 8.0～7.2; DO: 7mg·L–1)、僅DO 波動(dòng)低氧處理(pH:8.1; DO: 3～1mg·L–1)、pH 和DO 聯(lián)合波動(dòng)的酸化和低氧復(fù)合處理(pH: 8.0～7.2; DO: 3～1mg·L–1), 共七種處理。暴露實(shí)驗(yàn)為期7d, 暴露期間7:00—19:00 為波動(dòng)處理的白天條件, 19:00—7:00 為波動(dòng)處理的夜間條件。每種處理設(shè)置3 個(gè)重復(fù), 每個(gè)重復(fù)包含100只海蜇碟狀幼體, 飼養(yǎng)于21 個(gè)20L U 型水母缸。使用氣體流量控制系統(tǒng)調(diào)節(jié)通入空氣-CO2-N2混合氣體的進(jìn)氣量與曝氣周期, 以達(dá)到目標(biāo)pH 和DO 水平實(shí)現(xiàn)酸化或/和低氧處理(劉輝 等, 2018)。

暴露實(shí)驗(yàn)期間海水溫度18 ℃, 每日投餌鹵蟲無節(jié)幼體兩次, 每兩天更換約2/3 經(jīng)相應(yīng)預(yù)處理的新鮮海水并吸底去污, 所用新鮮海水已分別按照相應(yīng)處理組的海水化學(xué)要求進(jìn)行預(yù)處理。每天使用YSI水質(zhì)監(jiān)測(cè)儀測(cè)定溫度、鹽度和溶解氧, 使用NBS 標(biāo)準(zhǔn)溶液校準(zhǔn)的pH 電極監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)水體pH。每兩天于白天時(shí)段和夜間時(shí)段, 在晝夜模式切換前1h 內(nèi), 從實(shí)驗(yàn)水體中采集水樣, 采用滴定法測(cè)定水體總堿度(total alkalinity, TA)。根據(jù)TA 值和測(cè)量參數(shù)(溫度、鹽度和pH), 利用CO2 SYS 軟件計(jì)算得海水碳酸鹽化學(xué)的溶解無機(jī)碳(dissolved inorganic carbon,DIC)、方解石飽和度、文石飽和度。

1.3 傘部直徑

暴露實(shí)驗(yàn)開始前和結(jié)束時(shí), 從每種處理的水母缸內(nèi)隨機(jī)取15 只實(shí)驗(yàn)個(gè)體, 放置在含有相應(yīng)處理海水的培養(yǎng)皿中, 使用體視顯微鏡連接電腦拍攝軟件OPT Pro,拍照測(cè)量碟狀幼體的傘部直徑(Heins et al, 2018)。

1.4 收縮頻率

暴露實(shí)驗(yàn)結(jié)束后, 從每種處理的水母缸內(nèi)隨機(jī)取15 只實(shí)驗(yàn)個(gè)體, 每只碟狀幼體單獨(dú)放置在含有相應(yīng)處理海水的500mL 燒杯內(nèi), 待穩(wěn)定3min 后, 記錄1min 內(nèi)碟狀幼體的收縮次數(shù), 作為收縮頻率(pulsation rates)(Algueró-Mu?iz et al, 2016)。

1.5 酶活力

暴露實(shí)驗(yàn)結(jié)束后, 用相應(yīng)處理的無菌海水浸泡清洗碟狀幼體, 吸取其表面水分后收集在無菌離心管中, 液氮速凍并轉(zhuǎn)移至–80℃冰箱保存待用。將待檢測(cè)的組織樣品在冰上解凍, 稱取約0.10g 碟狀幼體組織, 按照質(zhì)量(g):體積(mL)=1:9 的比例加入0.9%生理鹽水, 低溫勻漿后離心10min (2500r·min–1,4 ℃), 收集上清液分裝待測(cè)。組織樣的Ca2+-ATP 酶、Na+K+-ATP 酶、酸性磷酸酶(acid phosphatese, ACP)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, AKP)、過氧化氫酶(catalse, CAT)活力和丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量以及組織總蛋白濃度均采用南京建成生物工程研究所試劑盒并按照說明書進(jìn)行測(cè)定。

1.6 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 22.0 軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù), 分別對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行了方差齊性檢驗(yàn)以及正態(tài)分布檢驗(yàn)。使用two-way ANOVA 來確定pH 和DO 之間是否存在相互作用影響。使用student-t 檢驗(yàn)分析每個(gè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間, 以及每個(gè)對(duì)應(yīng)波動(dòng)處理組和恒定處理組之間差異性是否顯著, 顯著性水平設(shè)定為P＜0.05。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 海水化學(xué)

本實(shí)驗(yàn)通過向?qū)嶒?yàn)海水充入CO2氣體模擬海洋酸化環(huán)境, 充入N2氣體模擬海洋低氧環(huán)境。根據(jù)實(shí)驗(yàn)測(cè)得的數(shù)據(jù), 溫度、鹽度、pH、DO 均保持在實(shí)驗(yàn)?zāi)康沫h(huán)境條件范圍內(nèi), 根據(jù)計(jì)算得出其他碳酸鹽化學(xué)參數(shù) (表1)。

表1 本實(shí)驗(yàn)中相關(guān)海水化學(xué)參數(shù)Tab. 1 Chemical parameters of seawater in this experiment (mean±SD)

2.2 傘部直徑

與對(duì)照組相比, 所有波動(dòng)處理組的碟狀幼體傘部直徑均顯著降低(P＜0.05), 恒定和波動(dòng)處理組中, 均沒有觀察到pH 和DO 之間的交互作用(P>0.05; 表2、3)。碟狀幼體的傘部直徑在酸化、低氧、酸化與低氧聯(lián)合的恒定和波動(dòng)處理組之間均無顯著差異(P>0.05, 圖1)。

圖1 海蜇碟狀幼體暴露于恒定/波動(dòng)的酸化和/或低氧處理后的傘部直徑*表示和對(duì)照組有顯著差異(P＜0.05)Fig. 1 Bell diameter of R. esculentum ephyrae after constant/fluctuating acidification and/or hypoxia exposure.The * error bar indicates significant difference (P＜0.05) as compared to control group

表2 雙因素方差分析結(jié)果: 恒定酸化和低氧脅迫對(duì)海蜇碟狀幼體的影響Tab. 2 Two-way ANOVA summary: Effects of constant acidification and hypoxia on the R. esculentum ephyrae

續(xù)表

表3 雙因素方差分析結(jié)果: 波動(dòng)酸化和低氧脅迫對(duì)海蜇碟狀幼體的影響Tab. 3 Two-way ANOVA summary: Effects of fluctuating acidification and hypoxia on the R. esculentum ephyrae

2.3 收縮頻率

與對(duì)照組相比, 恒定和波動(dòng)的酸化與低氧聯(lián)合處理組的海蜇碟狀幼體收縮頻率顯著降低(P＜0.05)。恒定和波動(dòng)處理組中, 均沒有觀察到pH 和DO 之間的交互作用(P>0.05; 表2、3)。碟狀幼體的收縮頻率在酸化、低氧、酸化與低氧聯(lián)合的恒定和波動(dòng)處理組之間均無顯著差異(P>0.05; 圖2)。

圖2 海蜇碟狀幼體暴露于恒定/波動(dòng)的酸化和/或低氧處理后的收縮頻率*表示和對(duì)照組有顯著差異(P＜0.05)Fig. 2 Pulsation rates of R. esculentum ephyrae after constant/fluctuating acidification and/or hypoxia exposure.The * error bar indicates significant difference (P＜0.05) as compared to control group

2.4 酸堿平衡、免疫和抗氧化相關(guān)酶活力

2.4.1 Ca2+-ATP 酶和Na+K+-ATP 酶活力

與對(duì)照組相比, 恒定的酸化、低氧、酸化與低氧聯(lián)合處理的海蜇碟狀幼體Ca2+-ATP 酶活力均顯著升高(P＜0.05), 但波動(dòng)的酸化、低氧處理的海蜇碟狀幼體Ca2+-ATP 酶活力則顯著降低(P＜0.05)。在恒定和波動(dòng)處理組中, pH 和DO 之間都存在顯著的交互作用(P＜0.001; 表2、3)。碟狀幼體的Ca2+-ATP 酶活力在暴露于酸化、低氧、酸化與低氧聯(lián)合的恒定處理后, 均顯著高于對(duì)應(yīng)的波動(dòng)處理組(P＜0.05, 圖3a)。

圖3 海蜇碟狀幼體暴露于恒定/波動(dòng)的酸化和/或低氧處理后的酶活力*表示和對(duì)照組有顯著差異(P＜0.05); 誤差棒上方不同英文小寫字母表示恒定和波動(dòng)的實(shí)驗(yàn)組之間存在顯著差異(P＜0.05)Fig. 3 Enzyme activities of R. esculentum ephyrae after constant/fluctuating acidification and/or hypoxia exposure. The *above error bar indicates the significant difference (P＜0.05) as compared to control group; the different lowercase letters indicate significant differences (P＜0.05) between constant and fluctuating treatment groups

與對(duì)照組相比, 所有處理組的海蜇碟狀幼體Na+K+-ATP 酶活力均顯著降低(P＜0.05)。在恒定和波動(dòng)處理組中, pH 和DO 之間都存在顯著的交互作用(P＜0.001; 表2、3)。相較于恒定處理, 碟狀幼體在暴露于波動(dòng)的低氧、酸化與低氧聯(lián)合處理后Na+K+-ATP 酶活力顯著降低(P＜0.05; 圖3b)。

2.4.2 酸性磷酸酶(ACP)和堿性磷酸酶(AKP)活力

與對(duì)照組相比, 恒定的酸化、低氧、酸化與低氧聯(lián)合處理的海蜇碟狀幼體ACP 活力均顯著升高(P＜0.05), 但波動(dòng)的酸化、低氧、酸化與低氧聯(lián)合處理組的ACP 活力則顯著降低(P＜0.05)。在恒定和波動(dòng)處理組中, 恒定處理組的pH 和DO 之間沒有交互作用(P>0.05; 表2、3), 但波動(dòng)處理組的pH 和DO之間觀察到交互作用(P＜0.001; 表2、3)。碟狀幼體的ACP 活力在暴露于酸化、低氧、酸化與低氧聯(lián)合的恒定處理后, 均顯著高于對(duì)應(yīng)的波動(dòng)處理組(P＜0.05, 圖3c)。

與對(duì)照組相比, 恒定的酸化、低氧、酸化與低氧聯(lián)合處理的海蜇碟狀幼體AKP 活力均顯著升高(P＜0.05), 但波動(dòng)的酸化、低氧處理組的AKP 活力則顯著降低(P＜0.05)。在恒定和波動(dòng)處理組中, pH 和DO 之間都存在交互作用(P＜0.001; 表2、3)。碟狀幼體的AKP 活力在暴露于酸化、低氧、酸化與低氧聯(lián)合的恒定處理后, 均顯著高于對(duì)應(yīng)的波動(dòng)處理組(P＜0.05; 圖3d)。

2.4.3 過氧化氫酶(CAT)活力和丙二醛(MDA)含量

恒定酸化組與對(duì)照組相比沒有顯著差異, 其余處理組的海蜇碟狀幼體CAT 活力相較于對(duì)照組均顯著降低(P＜0.05)。在恒定和波動(dòng)處理組中, 恒定處理組的pH 和DO 之間沒有交互作用(P>0.05; 表2、3),但波動(dòng)處理組的pH 和DO 之間觀察到交互作用(P＜0.05; 表2、3)。暴露于波動(dòng)的酸化、低氧、酸化與低氧聯(lián)合處理的碟狀幼體, 相比于對(duì)應(yīng)的恒定處理組, 其CAT 活力顯著降低(P＜0.05, 圖3e)。

所有處理組的海蜇碟狀幼體MDA 含量相較于對(duì)照組均顯著升高 (P＜0.05)。在恒定和波動(dòng)處理組中, pH 和DO 之間都存在交互作用 (P＜0.05; 表2、3)。碟狀幼體的MDA 含量在酸化、低氧、酸化與低氧聯(lián)合的恒定和波動(dòng)處理組之間均沒有顯著差異(P>0.05, 圖3f)。

3 討論

3.1 酸化和低氧晝夜波動(dòng)抑制海蜇碟狀幼體生長

本研究表明, 不同晝夜變化的海水酸化和低氧對(duì)海蜇碟狀幼體生長的影響不同, 恒定處理暴露7d后, 未出現(xiàn)顯著差異, 而波動(dòng)處理暴露7d 后, 海水酸化、低氧、酸化與低氧聯(lián)合處理對(duì)海蜇碟狀幼體的生長均顯示顯著抑制作用。有研究發(fā)現(xiàn), 部分水母物種無論是底棲階段還是浮游階段, 都同時(shí)對(duì)環(huán)境有很大的適應(yīng)性(Algueró-Mu?iz et al, 2016)。海月水母(Aurelia aurita)的酸化暴露實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn), pH 7.62～7.72 對(duì)其無致命影響(Treible et al, 2018)。大多數(shù)水母物種生活在溶解氧含量大于2mg·L–1的水體環(huán)境中, 但部分物種如大西洋金黃水母(Chrysaora quinquecirrha)和淡海櫛水母(Mnemiopsis leidyi)等對(duì)低氧環(huán)境表現(xiàn)出耐受性(Purcell et al, 2001)。與其他浮游分類群相比, 碟狀幼體階段通常是水母生活史中最脆弱的階段之一(Algueró-Mu?iz et al, 2016)。碟狀幼體在晝夜波動(dòng)的酸化和低氧處理后表現(xiàn)出生長抑制, 可能是波動(dòng)條件極值對(duì)碟狀幼體攝食等方面產(chǎn)生的負(fù)面效應(yīng), 例如酸化等暴露下, 水母毒素的生物活性受影響, 夜光游水母(Pelagia noctiluca)的刺細(xì)胞受損并影響捕食行為(Morabito et al, 2013)。研究發(fā)現(xiàn),餌料豐度是影響海蜇幼體生長發(fā)育及生存的重要因子, 碟狀幼體的器官尚未發(fā)育成熟, 浮游及捕食能力較弱, 主要借助水流實(shí)現(xiàn)浮游和攝食, 營養(yǎng)對(duì)晚期碟狀幼體的生長有顯著的影響(劉頂海, 2011)。

3.2 酸化和低氧耦合降低海蜇碟狀幼體收縮頻率

海蜇碟狀幼體的運(yùn)動(dòng)主要依靠緣葉的舒張和收縮, 通過收縮運(yùn)動(dòng)捕獲獵物和躲避敵害等(Kikkawa et al, 2010)。本研究中, 對(duì)照組海蜇碟狀幼體的收縮頻率最高, 酸化或低氧的單獨(dú)暴露對(duì)收縮頻率沒造成顯著影響, 而酸化和低氧聯(lián)合暴露后收縮頻率顯著降低, 在恒定和波動(dòng)對(duì)應(yīng)處理中無顯著差異。有研究表明, 海蜇碟狀幼體在pH 為7.15～8.15 的海水中能夠正常生活, 而在pH 為7 或9 的水體中其收縮頻率僅略低于正常值(宋晶 等, 2009)。Kikkawa 等(2010)研究顯示, 海月水母(Aureliasp.)碟狀幼體在暴露于5000μatmpCO2的酸化條件時(shí)收縮頻率才出現(xiàn)降低趨勢(shì)。Algueró-Mu?iz 等(2016)研究表明, 海月水母(Aurelia aurita)碟狀幼體在溫度、pCO2和溶解氧的三因素脅迫下, 大多數(shù)處理組的收縮頻率無顯著差異, 而高溫時(shí)的pCO2效應(yīng)隨DO 不同而不同,低DO 時(shí)呈顯著正效應(yīng)而高DO 時(shí)呈負(fù)效應(yīng)。Winans等(2010)報(bào)道海月水母(Aurelia labiata)碟狀幼體和螅狀幼體在pH 7.5 和7.3 下處理后, 其存活及無性繁殖均無顯著差異, 但發(fā)現(xiàn)低pH 處理導(dǎo)致平衡石減小, 每個(gè)平衡囊中的平衡石數(shù)量不變, 對(duì)平衡石的影響可能使碟狀幼體表現(xiàn)出運(yùn)動(dòng)行為變化(Winans et al, 2010)。

3.3 酸堿平衡、免疫和抗氧化相關(guān)酶活力

3.3.1 Ca2+-ATP 酶和Na+K+-ATP 酶活力

當(dāng)pH、DO 等環(huán)境因子發(fā)生變化時(shí), 海洋生物需調(diào)整ATP 敏感的離子通道, 改變離子代謝速率等,從而適應(yīng)環(huán)境因子的變化(肖武漢, 2014; 莊淑芳等, 2014)。Ca2+-ATP 酶和Na+K+-ATP 酶是分布于細(xì)胞膜表面的離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白, 是環(huán)境脅迫時(shí)的敏感生物標(biāo)志物(Marques et al, 2020)。Ca2+-ATP 酶對(duì)Ca2+的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)和維持酸堿平衡至關(guān)重要(Al-Horani et al, 2003)。Na+K+-ATP 酶能消耗ATP 驅(qū)動(dòng)細(xì)胞膜兩側(cè)Na+、K+離子交換運(yùn)輸, 對(duì)于維持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓平衡和離子調(diào)節(jié)等方面有重要調(diào)節(jié)作用(韓春艷 等,2016)。本研究顯示, 恒定的酸化、低氧、酸化與低氧聯(lián)合處理導(dǎo)致海蜇碟狀幼體Ca2+-ATP 酶活力均顯著升高, 但是波動(dòng)的酸化、低氧處理的海蜇碟狀幼體Ca2+-ATP 酶活力則都顯著降低, 恒定處理中碟狀幼體的Ca2+-ATP 酶活力均顯著高于對(duì)應(yīng)的波動(dòng)處理組。研究表明, 日本虎斑猛水蚤(Tigriopus japonicus)無節(jié)幼體在酸化暴露后Ca2+-ATP 酶活力顯著增強(qiáng), 可能是環(huán)境脅迫下生物體進(jìn)行離子調(diào)節(jié)作用, 造成能耗增加及對(duì)生殖、發(fā)育的負(fù)面影響(李飛 等, 2018)。海月水母(Aurelia labiata)的酸化和重金屬離子暴露實(shí)驗(yàn)顯示, 海洋酸化和 Cu2+均對(duì)Ca2+-ATP 酶活性具有較強(qiáng)的抑制效應(yīng), 且酸化條件會(huì)導(dǎo)致碟狀幼體的鈣質(zhì)結(jié)構(gòu)如平衡石受損(Winans et al, 2010)。不同程度酸化低氧脅迫大黃魚(Larimichthys crocea)幼魚的研究顯示, 慢性低氧脅迫下其鰓Ca2+-ATP 酶活力與對(duì)照組無顯著性差異,急性酸化脅迫下其鰓Ca2+-ATP 酶活力呈先增加后減少趨勢(shì), 慢性酸化、急性低氧酸化協(xié)同脅迫下,Ca2+-ATP 酶活力隨時(shí)間延長趨向恢復(fù)至初始水平,發(fā)現(xiàn)低氧與酸化之間存在拮抗性(曾姣, 2021)。另外,酸化和低氧對(duì)華美盤管蟲(Hydroides elegans)變態(tài)期幼蟲蛋白質(zhì)組的研究表明, 在一定程度上, 機(jī)體對(duì)低氧的生理響應(yīng)可能削弱由酸化作用引起的不利影響, 酸化和低氧對(duì)生物體顯示出拮抗作用(Wu, 2002;Fabry et al, 2008)。本研究中, 酸化、低氧、酸化與低氧聯(lián)合處理的恒定模式和波動(dòng)模式均導(dǎo)致海蜇碟狀幼體Na+K+-ATP 酶活力顯著降低, 相較于恒定處理, 碟狀幼體在暴露于波動(dòng)的低氧、酸化與低氧聯(lián)合處理后 Na+K+-ATP 酶活力被顯著抑制。Na+K+-ATP 酶活力降低表明生物體在脅迫環(huán)境中可能呈現(xiàn)代謝率和代謝需求降低, 與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似,大黃魚(Larimichthys crocea)幼魚在急性低氧脅迫下其鰓中 Na+K+-ATP 酶活力顯著低于對(duì)照組(曾姣,2021)。研究表明海水pH 降低導(dǎo)致的組織損傷或引起Na+K+-ATP 酶活力變化, 海水酸化脅迫導(dǎo)致長牡蠣(Crassostrea gigas)鰓中的Na+K+-ATP 酶活力顯著下降(王曉芹, 2018)。

3.3.2 酸性磷酸酶(ACP)和堿性磷酸酶(AKP)活力

磷酸酶通過水解磷酸單酯去除底物分子上的磷酸基團(tuán), 是一類可催化相應(yīng)底物去磷酸化的酶, 又稱磷酸單酯水解酶, 根據(jù)其催化作用的最適pH 分為酸性磷酸酶(ACP)和堿性磷酸酶(AKP)。磷酸酶廣泛存在于動(dòng)物各組織中, 在去磷酸化反應(yīng)、生理代謝、免疫防御和環(huán)境適應(yīng)等方面起重要作用, 外源物質(zhì)通過機(jī)體第一道免疫防線后, ACP、AKP 和溶菌酶(Lysozyme, LZM)等酶類物質(zhì)可發(fā)揮降解作用,當(dāng)免疫水平改變時(shí)磷酸酶會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)變化(霍達(dá),2020)。ACP 主要位于溶酶體和內(nèi)膜系統(tǒng), 是溶酶體的標(biāo)志酶(Pipe, 1990), 在酸性環(huán)境下催化磷酸單酯水解成酚和磷酸, 破壞表面含磷酸酯的異物, 起到預(yù)防感染的作用(徐彥, 2012); AKP 為含鋅(Zn2+)和鎂(Mg2+)的金屬酶, 存在于絕大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞的質(zhì)膜上, 能夠促進(jìn)鈣的吸收, 參與碳酸鈣的分泌和積聚, 堿性環(huán)境下催化磷酸單脂水解成乙醇和磷酸鹽,并且參與磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移, 在動(dòng)物代謝過程中起重要的調(diào)控和解毒作用(徐彥, 2012)。本研究結(jié)果表明,恒定的酸化、低氧、酸化與低氧聯(lián)合處理導(dǎo)致海蜇碟狀幼體ACP 和AKP 活力均顯著升高, 但波動(dòng)的酸化、低氧、酸化與低氧聯(lián)合處理導(dǎo)致ACP 活力顯著降低, 波動(dòng)的酸化、低氧處理導(dǎo)致AKP 活力顯著降低。恒定的酸化、低氧、酸化與低氧聯(lián)合處理后碟狀幼體的ACP 和AKP 活力均顯著高于對(duì)應(yīng)的波動(dòng)處理組。有研究顯示, ACP 或AKP 活力升高表明環(huán)境脅迫在某種程度上誘導(dǎo)了機(jī)體內(nèi)免疫相關(guān)防御機(jī)制,反之酶活力降低可能意味著免疫損傷, 刺參(Apostichopus japonicus)在暴露于低氧脅迫下也表現(xiàn)出ACP 活力顯著升高(霍達(dá), 2020)。環(huán)境適宜時(shí)ACP和AKP 活力較低, 生物體內(nèi)ACP 和AKP 活力的增強(qiáng)表明機(jī)體免疫功能被激活, 推測(cè)碟狀幼體通過采取主動(dòng)調(diào)節(jié)進(jìn)而維持體內(nèi)免疫及酸堿平衡, 晝夜波動(dòng)脅迫過度使生物免疫受損時(shí)難以調(diào)節(jié)維持穩(wěn)態(tài)則表現(xiàn)出一種被動(dòng)病理特征(朱曉聞, 2012)。同樣, 溫度、鹽度、pH 對(duì)馬氏珠母貝(Pinctada martensii)稚貝生理學(xué)特征的聯(lián)合效應(yīng)研究顯示, pH 的一次效應(yīng)和二次效應(yīng)對(duì)馬氏珠母貝稚貝體內(nèi)ACP 和AKP 活力均有極顯著影響, 當(dāng)存在環(huán)境因子脅迫時(shí), 免疫功能表現(xiàn)出一段增強(qiáng)期(文春根 等, 2009; 朱曉聞, 2012)。3.3.3 過氧化氫酶(CAT)活力和丙二醛(MDA)含量

當(dāng)環(huán)境因子發(fā)生不利于生物體的變化時(shí), 生物體內(nèi)活性氧自由基含量升高, 活性氧作為高活性分子, 會(huì)氧化細(xì)胞成分而造成細(xì)胞膜損傷等(Valko et al, 2007)。為了保護(hù)機(jī)體免受氧自由基造成的損傷,生物體采取一系列自適應(yīng)策略, 通過抗氧化系統(tǒng)來降低活性氧水平?？寡趸甘堑挚够钚匝醯牡谝坏婪谰€, 例如超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)等(霍達(dá), 2020)。CAT 是抗氧化系統(tǒng)中清除多余活性氧自由基的主要抗氧化酶之一(Magnadóttir,2006)。本研究結(jié)果顯示, 除恒定酸化組與對(duì)照組無顯著差異外, 其余處理組的海蜇碟狀幼體CAT 活力相較于對(duì)照組均顯著降低, 且暴露于波動(dòng)的酸化、低氧、酸化與低氧聯(lián)合處理的碟狀幼體, 相比于對(duì)應(yīng)的恒定處理組, 其CAT 活力顯著降低。同樣, 海月水母(Aurelia coerulea)碟狀幼體和?？?Exaiptasia pallida)暴露于酸化條件時(shí), 其CAT 活力也受到顯著抑制(Siddiqui et al, 2015; 王雷, 2020)。另外, 在低氧、高溫、高溫低氧三種脅迫下, 刺參(Apostichopus japonicus)的CAT 活力均顯著降低(霍達(dá), 2020)。研究發(fā)現(xiàn), 當(dāng)生物處于環(huán)境脅迫下, 海洋生物體內(nèi)的抗氧化酶會(huì)發(fā)生一定的變化, 僅輕度環(huán)境脅迫時(shí),抗氧化酶體系會(huì)顯著升高, 而當(dāng)處于嚴(yán)重的環(huán)境脅迫下時(shí), 生物體的有關(guān)酶活力會(huì)顯著下降(張培玉等, 2007; 姜娓娓 等, 2017)。丙二醛(MDA)是脂質(zhì)過氧化作用的最終產(chǎn)物, 可以作為氧化應(yīng)激損傷的主要生物標(biāo)志物, 反映生物體內(nèi)氧自由基引起的應(yīng)激壓力(del Rio et al, 2005)。本研究中, 酸化、低氧、酸化與低氧聯(lián)合的恒定和波動(dòng)處理組的海蜇碟狀幼體MDA 含量相較于對(duì)照組均顯著升高。實(shí)驗(yàn)表明,環(huán)境壓力造成機(jī)體氧化應(yīng)激而引起脂質(zhì)過氧化, 進(jìn)而對(duì)生物體的組織和細(xì)胞造成氧化損傷, 低氧脅迫和高溫低氧脅迫下刺參(Apostichopus japonicus)中MDA 含量極顯著升高與本實(shí)驗(yàn)海蜇碟狀幼體結(jié)果相似(霍達(dá), 2020)。Shi 等(2005)表明MDA 積累程度與氧化應(yīng)激水平呈正相關(guān)。環(huán)境脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)生了大量活性氧自由基且無法被有效清除, 生物體遭受氧化損傷, 與此同時(shí)抗氧化酶活力受抑制, 脂質(zhì)過氧化程度加劇, 因而作為脂質(zhì)過氧化作用代謝產(chǎn)物的MDA 含量就會(huì)增加(Martínez-álvarez et al, 2005)。

綜上所述, 海洋酸化和低氧在不同程度上影響海蜇碟狀幼體的生理代謝和生長發(fā)育, 且酸化和低氧之間表現(xiàn)出部分拮抗作用, 如對(duì) Ca2+-ATP酶、酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活力的影響。整體上,晝夜波動(dòng)的暴露模式對(duì)海蜇碟狀幼體的損傷程度大于恒定的暴露模式, 表明碟狀幼體為海蜇生活史中極為脆弱的階段, 關(guān)于海蜇其他生活史階段對(duì)酸化和低氧脅迫不同暴露模式的響應(yīng)還有待研究, 進(jìn)一步揭示缽水母類群適應(yīng)氣候變化和抵抗逆境的關(guān)鍵機(jī)制。