苗藥小花清風(fēng)藤葉內(nèi)生真菌Guignardia sp.次生代謝產(chǎn)物化學(xué)成分的分離和結(jié)構(gòu)鑒定

李 婷，周永強(qiáng)，徐 慧，魏紫云，任佳霖，趙春麗*

（貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽(yáng) 550025）

小花清風(fēng)藤Sabia parviflora Wall.exRoxb 為清風(fēng)藤科清風(fēng)藤屬的常綠木本藤本植物[1]，入藥部位包括根、莖、葉具有治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)痛，腰痛，止血、止痛的作用。小花清風(fēng)藤主要含黃酮類、生物堿、五環(huán)三萜、揮發(fā)性等成分[2-7]。已有的研究結(jié)果表明，長(zhǎng)期的協(xié)同進(jìn)化，使某些藥用植物內(nèi)生真菌可以產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的活性物質(zhì)[8]。且不會(huì)引起宿主植物出現(xiàn)明顯感染癥狀。內(nèi)生真菌除了具有間接或直接，協(xié)同或拮抗宿主植物個(gè)體合成有機(jī)化學(xué)物質(zhì)能力，還能自身合成具有活性的化合物。目前，學(xué)者們的研究方向仍停留在小花清風(fēng)藤的化學(xué)成分、藥理作用、臨床作用層面，對(duì)于其內(nèi)生真菌的深入研究暫未報(bào)道。因此，從已發(fā)現(xiàn)的苗藥小花清風(fēng)藤內(nèi)生真菌Guignardia sp.（球座菌）活化后進(jìn)行大批量發(fā)酵，并采用溶劑萃取法、柱色譜法等制備有效部位，進(jìn)一步結(jié)合柱色譜的方法純化并結(jié)構(gòu)解析單體化合物。對(duì)小花清風(fēng)藤內(nèi)生真菌進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)利用，篩選活性物質(zhì)，對(duì)保護(hù)維護(hù)小花清風(fēng)藤生態(tài)環(huán)境與利用具有一定的科學(xué)意義。依托貴州中醫(yī)藥大學(xué)對(duì)小花清風(fēng)藤內(nèi)生真菌進(jìn)行分離，在小花清風(fēng)藤葉中分離出一株球座菌并命名為L(zhǎng)-53?，F(xiàn)有相關(guān)研究表明，球座菌代謝產(chǎn)生的Meroterpenes、Dioxolanone 及它們的化學(xué)合成衍生物具有較好的抗真菌活性。裙帶菜中的球座菌能夠產(chǎn)生麥角甾醇類化合物[9]為更好地合理利用小花清風(fēng)藤內(nèi)生真菌資源，本文對(duì)Guignardia sp. 次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行了分離提取與結(jié)構(gòu)確證。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

小花清風(fēng)藤內(nèi)生真菌菌株L-53 是從小花清風(fēng)藤葉中分離得到，經(jīng)鑒定為Guignardia sp.（球座菌屬），現(xiàn)保存于貴州中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥大學(xué)生物制藥實(shí)驗(yàn)室。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

甲醇、二氯甲烷、石油醚（天津市富宇精細(xì)化工有限公司），80-100 目/200-300 目柱層析硅膠（青島海洋化工有限公司）；SHB-Ⅲ循環(huán)式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；FA2104N 型電子天平（上海菁海儀器有限公司），DHG-9070B 智能型恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上?，樮帉?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；SB-600DTY 超聲波多頻清洗劑（寧波新芝生物科技股份有限公司）；DLSB-5L/20 低溫冷卻液循環(huán)泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；N-1300 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛(ài)朗儀器有限公司），UPTC-20 超純水機(jī)（閔測(cè)儀器設(shè)備有限公司），RE-5210A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠），HP-05 陶瓷封閉式恒溫電烤爐（上海學(xué)森儀器有限公司），DCD-642WEG 型冰箱（安徽康佳同創(chuàng)電器有限公司），01-5A 型烘干箱（杭州藍(lán)天儀器廠），18L 高壓滅菌鍋（貴陽(yáng)凱信商貿(mào)經(jīng)營(yíng)部），Gilson 移液槍（吉而遜實(shí)驗(yàn)儀器（上海）有限公司），LRH 型生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 培養(yǎng)基的制備及發(fā)酵菌種的活化

取4.01 g 鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）粉末加入100 ml 蒸餾水中，121 ℃高壓滅菌20 min，滅菌后放入超凈臺(tái)紫外滅菌30 min，等待溫度將至85 ℃時(shí)分裝至培養(yǎng)皿中，等待冷卻備用。將保存在斜面培養(yǎng)基中的L-53，放于操作臺(tái)中，紫外滅菌30 min。雙手用75%酒精擦拭后進(jìn)行操作，將要分離菌種的標(biāo)本接種針用酒精燈灼燒滅菌2～3 次，冷卻后在標(biāo)本上挑取微量菌種于冷卻后的平板上，平板倒置并用封口膜封口，在培養(yǎng)皿上寫上日期及菌種編號(hào)，將平板放置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 天。長(zhǎng)期冷藏保存的菌種需經(jīng)歷2～3 次活化完成復(fù)壯過(guò)程，活化后的菌種能更好的適應(yīng)外界培養(yǎng)環(huán)境，為后期大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)奠定良好基礎(chǔ)。

2.2 菌絲體的提取、分離與純化

菌株L-53 經(jīng)復(fù)蘇后，與馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基（Potato Dextrose Broth,PDB）一起放入超凈臺(tái)中滅菌30 min。將接菌環(huán)反復(fù)灼燒滅菌2～3 次，冷卻后將已經(jīng)純化分離好的L-53 菌單個(gè)菌落挑出，并迅速伸入裝有液體培養(yǎng)基的錐形瓶與液面銜接處，上下滑動(dòng)摩擦瓶壁，使孢子成功接入液體培養(yǎng)基中。接菌后再用透氣封口膜和棉繩封口。放入恒溫震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 d（28 ℃，150 r/min），獲得種子培養(yǎng)液。L-53 菌株用馬鈴薯培養(yǎng)基大規(guī)模發(fā)酵，發(fā)酵200瓶（每1000 mL 的三角錐形瓶中加入200 mL 的培養(yǎng)液），在121 ℃的高溫滅菌鍋中滅菌20 min，待培養(yǎng)基冷卻后接種，室溫靜置發(fā)酵30 d。發(fā)酵產(chǎn)物使用布氏漏斗進(jìn)行減壓抽濾將菌體發(fā)酵液和菌絲體分離，共得到菌體發(fā)酵液7.5 L，菌體鮮重80 g。將菌體浸入分析純甲醇中，在40 KHz 條件下超聲作用20 min 使細(xì)胞壁破碎，補(bǔ)充甲醇至料液比1:8，加熱回流提取三次，每次2 h，合并三次提取液，濃縮后得到總浸膏共5.2 g。按1:1.5 比例加入80-100 目硅膠進(jìn)行拌樣，水浴揮干甲醇，濕法裝柱，干法上樣。用不同比例的二氯甲烷和甲醇進(jìn)行梯度洗脫，依次以20:1、10:1、8:1、6:1、4:1、3:1、2:1、1:1、甲醇進(jìn)行洗脫，分別命名共收集A-I共九個(gè)組分。

其中H 旋蒸濃縮后在樣品表面出現(xiàn)無(wú)色晶體化合物，用二氯甲烷:甲醇=1:1 溶劑重結(jié)晶析出得到透明無(wú)色結(jié)晶化合物1（15.62 mg）。向E 中樣品添加少量的二氯甲烷:甲醇=4:1 溶劑長(zhǎng)期處于0 ℃條件下析出一白色結(jié)晶化合物，用極性較低的石油醚對(duì)晶體進(jìn)行3 次潤(rùn)洗得到的白色晶體化合物2（7.52 mg）。工藝流程圖見(jiàn)圖1。

圖1 小花清風(fēng)藤葉內(nèi)生真菌菌體成分提取、分離純化及鑒定工藝流程圖

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 D- 半乳糖醇的結(jié)構(gòu)確定

化合物1 為透明無(wú)色晶體，易溶于熱水(1:2)，溶于冷水(1:30)，微溶于乙醇。分子式為C6H14O6。1H-NMR(400 MHz, DMSO-d6)（表1）顯示δH：3.33-3.41 (4H,m)，4.32 (2H, t,J=4.52 Hz)，4.41 (2H, d, J=4.84Hz)，13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6)（表1），δC：63.9(C-1,C-6)，69.7(C-2, C-5)，71.4(C-3, C-4)與已知文獻(xiàn)[10]對(duì)照，數(shù)據(jù)基本一致，故確定化合物1 為D- 半乳糖醇，其結(jié)構(gòu)（圖2）。

圖2 化合物1 的結(jié)構(gòu)

表1 化合物1 的1H-NMR 和13C-NMR 數(shù)據(jù)(CD3SOCD3)

3.2 丙三醇的結(jié)構(gòu)確定

化合物2 低溫下呈現(xiàn)白色晶體（丙三醇長(zhǎng)期放置于0 ℃低溫處，能形成熔點(diǎn)為17.8 ℃的白色結(jié)晶）[12-13]，常溫狀態(tài)為無(wú)色澄清狀粘稠液體。可混溶于乙醇，與水混溶，不溶于氯仿、醚、二硫化碳、苯、油類。分子式為C3H8O3。

根據(jù)1H-NMR（400 MHz,DMSO-d6）（表2）顯示δH：4.28-4.48 為羥基氫，3.30-3.40（2H，m），3.49-3.58（4H，m），在13C-NMR（100 MHz,DMSO-d6）（表2）中δC：63.3（C-1, C-3），72.6（C-2）。

表2 化合物2 的1H-NMR 和13C-NMR 數(shù)據(jù)（CD3SOCD3）

以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]基本一致，故確定化合物2 為丙三醇（圖3）。

圖3 化合物2 的結(jié)構(gòu)

4 結(jié)論與討論

小花清風(fēng)藤具較高的藥用價(jià)值和臨床價(jià)值，但小花清風(fēng)藤資源分布少。目前人們獲取臨床所需藥物主要是通過(guò)合成、半合成或從藥用植物中提取?；瘜W(xué)合成藥物存在收率低、污染大、副產(chǎn)物多等弊端，而直接從藥用植物中提取有效成分也受許多因素的限制。近年來(lái)，內(nèi)生真菌及其次生的代謝產(chǎn)物研究都有明顯進(jìn)步，微生物發(fā)酵具有成本低、易于培養(yǎng)、產(chǎn)量穩(wěn)定、周期較段、易于調(diào)控等優(yōu)點(diǎn)。本文應(yīng)用正相硅膠柱色譜、重結(jié)晶1H-NMR、13C-NMR 等方法對(duì)小花清風(fēng)藤內(nèi)生真菌Guignardia sp. 菌絲體的甲醇提取物的化學(xué)成分進(jìn)行了系統(tǒng)研究，從部位中分離得到了2 個(gè)化合物，并應(yīng)用理化性質(zhì)、核磁共振氫譜、核磁共振碳譜對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證。對(duì)小花清風(fēng)藤內(nèi)生真菌進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)利用，篩選活性物質(zhì)，對(duì)保護(hù)維護(hù)小花清風(fēng)藤生態(tài)環(huán)境與利用具有一定的科學(xué)意義。