UPLC-Q-TOF-MS法分析僵蛹和僵蠶化學成分差異

邢東旭， 李慶榮， 肖 陽， 趙超藝， 楊 瓊*

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣東 廣州 510610；2.嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學與技術(shù)廣東省實驗室茂名分中心，廣東 茂名 525000)

僵蠶是一種優(yōu)良的動物類中藥材，具有息風止痙、祛風止痛、化痰散結(jié)的功效[1]，臨床應用廣泛[2-3]。9%～9.6%成人用藥含僵蠶，兒童用藥中含僵蠶的比例則高達40%～45.3%[4]。僵蠶水提物或醇提物具有抗驚厥、抗癲癇、抗凝血等多種藥理活性[5-7]。

僵蠶年需求量在3 000噸左右，主要來自蠶區(qū)收集的病死僵蠶[8]。隨著蠶病防治技術(shù)的進步，僵病的發(fā)生得到有效控制，造成僵蠶原料日趨緊缺[9]。草酸銨是僵蠶重要活性成分之一，經(jīng)皮接種活蛹生成的僵蛹與僵蠶草酸銨含量相似[10]。另外，臨床上發(fā)現(xiàn)用僵蛹配伍全蝎、蜈蚣、天麻等治療乙型腦炎有高熱抽搐患者的療效與僵蠶相同[11]。如能以僵蛹作為僵蠶的代用品，既解決僵蠶供應，又實現(xiàn)蠶蛹的高值化利用[12]。然而，目前對僵蛹和僵蠶化學成分和療效的差異還缺乏全面認識。鑒于此，本研究擬采用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)分析僵蛹和僵蠶化學成分的差異，并比較兩者的抗驚厥作用，為僵蛹作為僵蠶的代用品提供更多依據(jù)。

1 材料

僵蛹和僵蠶由本實驗室人工生產(chǎn)獲得。白僵菌菌株為球孢白僵菌BeauveriabassianaJC-1，家蠶品種為四元雜交種“兩廣二號”。將白僵菌孢子液分別噴體感染5齡起蠶和化蛹第4天的蠶蛹，自然死亡后繼續(xù)僵化10 d后采收，100 ℃處理0.5 h使病原全部失活，后經(jīng)60 ℃烘干至水分質(zhì)量分數(shù)<13%，粉碎后過100目篩備用[13]。

Waters Q-TOF Premier飛行時間質(zhì)譜(美國沃特世公司)；TYSP-100高速多功能粉碎機(浙江省永康市紅太陽機電有限公司)；真空抽濾機(鞏義市予華儀器有限公司)；小鼠灌胃針(北京合力科創(chuàng)科技發(fā)展有限公司)；Milli-Q超純水儀(美國Millipore公司)；甲酸、甲醇(賽默飛世爾科技公司)。

2 方法

2.1 供試品溶液制備 稱取100 mg樣品，加1 mL溶劑(甲醇∶水=8∶2)，冰水浴超聲處理5 min，冷凍離心(4 ℃，16 000 g)15 min，取上清液。重復提取1次，合并上清液，用0.22 μm微孔濾膜濾過。

2.2 提取物制備 稱取僵蛹粉或僵蠶粉100 g，熱水回流提取2次，每次1 h，提取液過濾后真空濃縮，經(jīng)冷凍干燥獲得僵蛹水提物或僵蠶提取物，用于抗驚厥小鼠實驗。

2.3 分析方法 色譜柱為Waters Acquity UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)，流動相0.1%甲酸(A)-0.1%甲酸甲醇(B)(0～0.5 min，2%B；0.5～1.5 min，2%～40%B；1.5～9.5 min，40%～80%B；9.5～13 min，80%～100%B；13～13.4 min，100%～2%B；13.4～15.5 min，2%B)，梯度洗脫；體積流量0.38 mL/min；柱溫50 ℃；進樣量3 μL。采用ES+模式；離子源溫度115 ℃；毛細管電壓3 000 V；脫溶劑氣溫度350 ℃；氣體體積流量600 L/h；錐孔電壓35 V；錐孔氣體積流量50 L/h。質(zhì)譜掃描范圍m/z50～1 000，質(zhì)譜掃描時間為0.3 s，掃描間隔為0.02 s。

2.4 數(shù)據(jù)處理 通過Mass Lynx 4.1軟件包的Data Bridge軟件將原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為Net CDF格式，在R軟件中采用XCMS和CAMERA軟件包對進行質(zhì)譜數(shù)據(jù)預處理，用Excel軟件對所有樣品進行歸一化，將歸一化的數(shù)據(jù)導入SIMCA 軟件進行多維統(tǒng)計分析，包括主成分分析和正交偏最小二乘法判別分析。采用Welch’s t test對正態(tài)分布數(shù)據(jù)進行參數(shù)檢驗，而對于非正態(tài)分布數(shù)據(jù)則采用Wilcoxon Mann-Whitney test進行非參數(shù)檢驗。

2.5 差異化學成分鑒定 根據(jù)OPLS-DA模型第一主成分的變量重要投影(VIP)>1并結(jié)合非參數(shù)檢驗 Mann-Whitney U test 的P<0.05來篩選差異化學成分。基于自建數(shù)據(jù)庫及代謝物信息公共數(shù)據(jù)庫，根據(jù)一級質(zhì)譜的精確m/z并輔助二級質(zhì)譜碎片信息對差異化學成分進行定性并基于標準品或文獻報道對部分差異成分進行確認。脂類成分通過和脂質(zhì)理論庫比對后獲得。

2.6 小鼠分組與給藥 雄性SPF級昆明小鼠，18～22 g。購入后適應性喂養(yǎng)3 d，然后將小鼠隨機分為4組，對照組、模型組、僵蛹組和僵蠶組，每組10只。用無菌水將水提物溶解，給藥組按照預設劑量(生藥20 g/kg)灌胃給藥，對照組和模型組給予等體積的無菌水，連續(xù)灌胃5 d。第6天給藥30 min，除對照組外，各組小鼠均腹腔注射1.6 mg/kg士的寧注射液。

2.7 小鼠驚厥反應觀察 持續(xù)觀察30 min，記錄小鼠的陣攣潛伏期(Ⅰ-Ⅲ級的發(fā)作時間)、強直性驚厥潛伏期(Ⅴ級發(fā)作)和30 min內(nèi)小鼠死亡的只數(shù)，通過視頻監(jiān)控小鼠癇性發(fā)作過程。小鼠驚厥反應的觀察參照Racine標準。0級無反應；Ⅰ級節(jié)律性口角、耳或面部肌肉抽動陣攣；Ⅱ級點頭并伴隨更嚴重的面部肌肉抽動陣攣；Ⅲ級出現(xiàn)前肢陣攣但不伴隨直立；Ⅳ級前肢陣攣伴隨直立；Ⅴ級全身強直陣攣發(fā)作而跌倒[14]。

3 結(jié)果

3.1 化學成分 僵蛹和僵蠶的UPLC-Q-TOF-MS基峰強度(BPI)色譜圖見圖1。采用PCA無監(jiān)督模式識別對僵蛹和僵蠶樣品的差異進行分析。從PCA 模型(圖2A)可以看到，僵蛹和僵蠶樣品有明顯的區(qū)分，僵蠶組內(nèi)樣品間的變異性稍大。為了達到最大化分離和尋找差異性成分，建立有監(jiān)督模式識別方法OPLS-DA模型(圖2B)，發(fā)現(xiàn)僵蛹與僵蠶分別處于左右兩側(cè)，說明兩組樣品能被顯著區(qū)分。結(jié)果表明僵蛹和僵蠶在化學成分上存在顯著差異。

3.2 差異化學成分鑒定與分析 尋找貢獻值較大的變量，OPLS-DA 載荷圖結(jié)合VIP>1及P<0.05作為標準篩選差異化學成分。共篩選出46種差異化學成分。由表1可知，19種化學成分含量顯著減少，其中脂類物質(zhì)有11種，為甘油三酯(TG)與山奈酚-7-O-β-D-4-O-甲基葡萄糖苷、山柰酚、桑色素等3種黃酮類。27種化學成分含量顯著增多，其中脂類物質(zhì)有20種，主要為甘油二酯(DG)、單酰甘油(MG)、磷脂酰膽堿(PC)、溶血磷脂酰膽堿(LPC)和游離脂肪酸(FFA)，以及甜菜堿、腺嘌呤、L-左旋肉堿、膽堿、乙酰肉毒堿等。

表1 僵蛹和僵蠶差異性化學成分

注：a為標準品比對，b為數(shù)據(jù)庫比對，c為文獻報道。差異倍數(shù)計算方法為兩組數(shù)據(jù)均值之比的對數(shù)，正值表示該物質(zhì)在僵蛹中的水平高于僵蠶，負值則相反。

3.3 僵蛹和僵蠶抗驚厥效果比較 通過士的寧致癇小鼠模型對僵蛹和僵蠶水提物的抗驚厥效果進行比較，結(jié)果見表2。與模型組比較，僵蠶水提物能夠延長小鼠陣發(fā)性痙攣發(fā)作潛伏期(P<0.01)，提高小鼠的死亡保護率。僵蛹水提物能夠延長小鼠陣發(fā)性痙攣發(fā)作潛伏期(P<0.01)，還可以提高小鼠的死亡保護率(P<0.001)。30 min內(nèi)僵蠶組和僵蛹組分別有2只和3只小鼠未出現(xiàn)強直陣攣反應，兩組其它小鼠平均強直潛伏期較模型組均延長。僵蛹和僵蠶水提物均有抗驚厥作用，且僵蛹水提物對士的寧致癇小鼠的治療效果更好。

表2 僵蛹和僵蠶對士的寧致癇小鼠效果

4 討論

2018年全國蠶繭產(chǎn)量67.9萬噸，估算每年的蠶蛹產(chǎn)量在50萬噸以上。由于一直將蠶蛹作為繅絲工業(yè)的副產(chǎn)品，蠶蛹資源未得到很好地利用[9,11]。有報道僵蛹可以作為僵蠶的代用品，但由于對僵蛹和僵蠶化學成分差異缺乏整體了解，對僵蛹的抗驚厥效果研究較少，僵蛹作為中藥材僵蠶的代用品尚未得到足夠的認可。UPLC-Q-TOF-MS是近年來發(fā)展起來的具有高效分離和定性檢測綜合能力的分析方法，在中藥化學成分分析等研究中已得到較多應用[15-17]。

PCA和OPLS-DA分析結(jié)果表明，僵蛹和僵蠶的化學成分存在顯著差異，僵蛹中TG含量減少，DG、PC、LPC和FFA含量增多。與白僵菌將蠶(蛹)體脂肪水解為游離脂肪酸供其生長所需有關(guān)[18]。此外，山奈酚、山奈酚-7-O-β-D-4-O-甲基葡萄糖苷和桑色素等黃酮類成分含量下降。山柰酚、槲皮素和桑色素等是蠶體中主要的黃酮類物質(zhì)，來自于桑葉黃酮在蠶體中的積累[19]。山柰酚-7-O-β-D-4-O-甲基葡萄糖苷是僵蠶僵化反應的特征成分，白僵菌能夠以蠶體中的山柰酚為底物發(fā)生4-O-甲基葡萄糖苷化反應，生成山柰酚-7-O-β-D-4-O-甲基葡萄糖苷[20]。另外，僵蛹中甜菜堿、腺嘌呤、L-左旋肉堿和膽堿成分含量有所增加。

通過士的寧致癇模型小鼠對僵蛹和僵蠶抗驚厥效果進行評價，發(fā)現(xiàn)僵蛹和僵蠶水提物均有抗驚厥作用，且僵蛹水提物在延長小鼠陣發(fā)性痙攣發(fā)作潛伏期和提高小鼠死亡保護率方面的效果更好。為僵蛹作為僵蠶代用品提供了重要理論依據(jù)。