蛇床子素白蛋白納米粒的制備及其體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究

辛 娟， 易 華， 李 明， 談秀鳳

(1.黃河科技學(xué)院，河南 鄭州 450063；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 201203)

蛇床子素是從蛇床子Cnidiummonnieri(L.)Cusson中提取出的一種香豆素類活性成分，具有抗心律失常、壯陽、抗腫瘤、抑菌、抗炎、抗過敏、降血壓、抗骨質(zhì)疏松、增強(qiáng)免疫等藥理作用[1-3]，在心腦血管疾病、內(nèi)分泌系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等方面中的應(yīng)用較多，但該成分溶解度僅為4.65 μg/mL，影響了溶出度[4]，而且胃腸道穩(wěn)定性差[5]，導(dǎo)致口服吸收生物利用度較低(僅為15.65%)[6]，不利于藥效發(fā)揮。另外，蛇床子素logP為3.46[7]，脂溶性較高，故提高該成分溶解度、溶出度有利于增加其體內(nèi)吸收程度。

白蛋白是一種安全的納米載體材料[8-10]，可提高難溶性藥物的溶解度、溶出度、體內(nèi)穩(wěn)定性[11-13]，促進(jìn)藥物吸收，并且自身可作為輔料制備凍干制劑。同時(shí)，蛇床子素與白蛋白之間具有較強(qiáng)的結(jié)合作用，故在一定制劑條件下可形成納米粒[14]。本實(shí)驗(yàn)制備蛇床子素白蛋白納米粒，并考察其體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)，以期為相關(guān)新制劑開發(fā)提供策略。

1 材料

Milli-Q超純水處理系統(tǒng)(美國Millipore公司)；安捷倫1200型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；MS105/A型電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；JC-HJ-A型磁力攪拌器(青島聚創(chuàng)環(huán)保集團(tuán)有限公司)；Master-sizer型粒度分析儀(英國馬爾文儀器有限公司)；Z32HK型高速離心機(jī)(德國Hermle公司)；KQ-300DB型超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司)；超濾離心管(30 K，美國Pall公司)；BK-FD10S型凍干機(jī)(博科控股集團(tuán)有限公司)；QIMO-DCY-12S型氮?dú)獯祾邇x[琪摩(上海)電子科技有限公司]。

蛇床子素對照品(批號(hào)110822-201810，純度99.5%，中國食品藥品檢定研究院)；蛇床子素原料藥(批號(hào)20191215，純度98%，西安佰斯特生物科技有限公司)。牛血清白蛋白(批號(hào)190725，純度≥98%，鹽城賽寶生物科技有限公司)。

SD大鼠，雌雄兼具，體質(zhì)量(250±20)g，購自河南省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(豫)2016-0001。

2 方法與結(jié)果

2.1 白蛋白納米粒及其凍干粉制備 參考文獻(xiàn)[12, 15-16]報(bào)道，稱取處方量原料藥至一定體積無水乙醇中，超聲溶解，作為有機(jī)相；稱取處方量牛血清白蛋白，置于40 mL pH 7.0緩沖液中，600 r/min磁力攪拌溶解，作為水相，將有機(jī)相以2 mL/min滴速滴加到水相中，超聲處理20 min，加入100 μL 0.2%戊二醛固化12 h，在40 ℃下減壓旋蒸1 h，除去無水乙醇，4 ℃、20 000 r/min離心45 min，移棄上清液，加蒸餾水至40 mL，過0.45 μm微孔濾膜，即得白蛋白納米粒，再將其置于-20 ℃中冰箱冷凍3 d，迅速轉(zhuǎn)移至初始溫度為-20 ℃的冷凍干燥機(jī)中抽真空后冷凍3 d，即得凍干粉。除不加原料藥外，同法制備空白白蛋白納米粒。

2.2 蛇床子素含量測定

2.2.1 色譜條件 Hypersil C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相水-甲醇(60∶40)；體積流量1.0 mL/min；柱溫35 ℃；檢測波長429 nm；進(jìn)樣量20 μL。

2.2.2 線性關(guān)系考察 稱取20 mg對照品至50 mL量瓶中，甲醇超聲溶解后定容，得400 μg/mL貯備液，流動(dòng)相制成20、10、5、1、0.1、0.05 μg/mL對照品溶液，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以對照品峰面積(Y)對其質(zhì)量濃度(X)進(jìn)行回歸，得方程為Y=14.148 2X+0.415 3(r=0.999 7)，在0.05～20 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.3 供試品溶液制備 取白蛋白納米粒1 mL，置于10 mL量瓶中，加入約5 mL甲醇，超聲處理2 min以沉淀蛋白，甲醇定容至刻度，取1 mL至10 mL量瓶中，8 500 r/min離心10 min，取上清液，即得。

2.2.4 方法學(xué)考察 取“2.2.3”項(xiàng)下供試品溶液適量，于0、3、6、9、12、24 h在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得蛇床子素峰面積RSD為1.36%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。取“2.2.3”項(xiàng)下供試品溶液適量，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6次，測得蛇床子素峰面積RSD為0.56%，表明儀器精密度良好。取白蛋白納米粒適量，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得蛇床子素峰面積RSD為1.64%，表明該方法重復(fù)性良好。取9份白蛋白納米粒，每份0.5 mL，置于10 mL量瓶中，隨機(jī)分為3組，分別加入對照品溶液0.5、1、1.5 mL，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得蛇床子素平均加樣回收率分別為100.93%、99.37%、99.78%，RSD分別為1.06%、0.63%、1.11%。

2.3 包封率、載藥量測定 在超濾離心管(截留分子量8 000～14 000 Da)中加入1 mL白蛋白納米粒，8 500 r/min離心10 min，HPLC法測定濾液中游離蛇床子素量(m游離)；取白蛋白納米粒1 mL，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，HPLC法測定蛇床子素總量(m總)，計(jì)算包封率、載藥量，公式分別為包封率=[(m總-m游離)/m總]×100%、載藥量=[(m總-m游離)/m總質(zhì)量]×100%，其中m總質(zhì)量表示白蛋白納米粒總質(zhì)量。

2.4 Box-Behnken響應(yīng)面法 在課題組前期研究基礎(chǔ)上，選擇蛇床子素用量(X1)、白蛋白用量(X2)、無水乙醇用量(X3)作為影響因素，包封率(Y1)、載藥量(Y2)作為評價(jià)指標(biāo)，因素水平見表1，結(jié)果見表2。

表1 因素水平

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表3 方差分析

響應(yīng)面分析見圖1。由圖1A～1C可知，隨著白蛋白用量增加，包封率呈升高趨勢；隨著蛇床子素用量增加，包封率呈降低趨勢；隨著無水乙醇用量增加，包封率先升后降。由圖1D～1F可知，隨著白蛋白用量增加，載藥量呈降低趨勢；隨著蛇床子素用量增加，載藥量呈升高趨勢；隨著無水乙醇用量增加，載藥量先升后降。設(shè)置包封率最小值為50%，最大值為100%；載藥量最小值為2%，最大值為15%，得到最優(yōu)工藝為蛇床子素用量29.05 mg，白蛋白用量321.66 mg，乙醇用量7.59 mL，包封率為84.61%，載藥量為6.87%，考慮到實(shí)際操作性，將其修正為蛇床子素用量29 mg，白蛋白用量322 mg，乙醇用量7.6 mL。

按上述優(yōu)化工藝平行制備3份白蛋白納米粒，外觀見圖2A，測得平均包封率為83.71%，載藥量為6.59%，分別與預(yù)測值84.61%、6.87%接近；平均Zeta電位為-26.45 mV(圖3)，粒徑為113.82 nm(圖4)，PDI為0.081。凍干粉外觀見圖2B，可知為片狀疏松狀態(tài)的粉末，加入蒸餾水復(fù)溶后平均Zeta電位為-22.61 mV，粒徑為153.73 nm，PDI為0.127。

2.5 溶解度測定 取過量原料藥、物理混合物(蛇床子素+空白白蛋白納米粒)、白蛋白納米粒凍干粉適量，置于燒瓶中，加入10 mL蒸餾水(仍有藥物沉淀于底部)，25 ℃、600 r/min磁力攪拌72 h，取上層混懸液，8 500 r/min離心15 min，取上清液，計(jì)算溶解度。結(jié)果，原料藥、物理混合物溶解度分別為4.65、7.83 μg/mL，而白蛋白納米粒達(dá)107.98 μg/mL，是原料藥的23.22倍。

2.6 體外釋藥研究

2.6.1 人工胃液、人工腸液制備 取10 g胃蛋白酶，加400 mL純化水?dāng)嚢枞芙猓蝗?.8 mL濃鹽酸，加500 mL純化水，將兩者合并后振蕩混勻，加5 mL吐溫-80，純化水補(bǔ)至1 000 mL，振蕩混勻，即得人工胃液。取磷酸二氫鉀6.8 g，加500 mL純化水，振蕩溶解，0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至6.8；取胰蛋白酶10 g，加400 mL純化水，振蕩溶解，將兩者合并后振蕩混勻，加5 mL吐溫-80，純化水補(bǔ)至1 000 mL，振蕩混勻，即得人工腸液。

2.6.2 操作過程 取原料藥、物理混合物、白蛋白納米粒凍干粉適量(以蛇床子素計(jì)均為5 mg)，5 mL空白釋放介質(zhì)制成混懸液，置于透析袋中(截留分子量8 000～14 000 Da)，取1 000 mL人工胃液，設(shè)定溫度為37 ℃，轉(zhuǎn)速為100 r/min，于0、0.25、0.5、1、2 h各取樣3 mL，并加入同體積的人工胃液；同法考察各樣品在人工腸液中的釋藥情況，取樣時(shí)間為0、0.25、0.5、1、2、2.5、3、4、6、8、12 h，繪制釋藥曲線，結(jié)果見圖5～6。由此可知，白蛋白納米粒在人工胃液或人工腸液中的累積釋放度均高于原料藥，在人工胃液中2 h內(nèi)為44.86%；在人工腸液中8 h內(nèi)為90.40%，12 h內(nèi)為93.67%。

2.7 穩(wěn)定性考察 稱取2份白蛋白納米粒凍干粉，每份0.2 g，置于50 mL人工胃液或人工腸液中(4 ℃)，在37 ℃下于0、0.5、1、2、3、4、5 h測定粒徑，結(jié)果見圖7。由此可知，白蛋白納米粒凍干粉粒徑在蒸餾水中的變化程度最小，5 h后仍小于200 nm；在人工胃液中2 h后粒徑增加至457.92 nm；在人工腸液中2 h后粒徑增加至352.17 nm，4 h后接近1 000 nm。

2.8 體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究

2.8.1 分組、給藥與采血 取禁食1 d的大鼠18只(其間可自由飲水)，隨機(jī)分為3組，每組6只，分別灌胃給予原料藥、物理混合物(原料藥+空白白蛋白納米粒)、白蛋白納米粒凍干粉的混懸液(用0.5%CMC-Na溶液配制，蛇床子素質(zhì)量濃度為3.5 mg/mL)，劑量均為30 mg/kg，乙醚麻醉后于0.25、0.5、0.75、1.0、1.5、2、3、4、6、8、10、12 h眼眶取血各約0.2～0.3 mL，置于肝素化離心管中，振蕩混勻，3 000 r/min離心2 min，分離血漿，密封，保存于-20 ℃冰箱中。

2.8.2 血漿處理 將大鼠血漿在室溫下解凍后精密吸取100 μL，置于離心管中，加入內(nèi)標(biāo)溶液(精密稱取丹皮酚對照品20.80 mg，置于50 mL量瓶中，甲醇溶解定容并稀釋至400 ng/mL，即得)100 μL、甲醇3 mL，密封渦旋3 min，6 500 r/min離心8 min，取上層有機(jī)相，氮?dú)饩徛蹈桑?00 μL甲醇復(fù)溶，6 500 r/min離心8 min，進(jìn)樣分析。

2.8.3 線性關(guān)系考察 取“2.2.2”項(xiàng)下貯備液適量，甲醇稀釋至1 600、1 200、800、200、50、20 ng/mL，分別精密吸取100 μL至離心管中，45 ℃氮?dú)饩徛蹈?，加?00 μL空白血漿，作為血漿對照品溶液，按“2.8.2”項(xiàng)下方法處理，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以對照品質(zhì)量濃度(Y)對其與內(nèi)標(biāo)峰面積比值(X)進(jìn)行回歸，得方程為Y=143.68X+3.12(r=0.994 6)，在20～1 600 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.8.4 專屬性考察 取空白血漿、血漿對照品溶液(20 ng/mL)、給藥12 h后血漿適量，按“2.8.2”項(xiàng)下方法處理，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖8，可知該方法專屬性良好。

2.8.5 方法學(xué)考察 取20、800、1 600 ng/mL血漿對照品溶液適量，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣測定6次，測得對照品、內(nèi)標(biāo)峰面積比值RSD分別為12.07%、7.66%、9.18%，表明儀器精密度良好。取800 ng/mL血漿對照品溶液，于0、2、4、8、12、24 h在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得對照品、內(nèi)標(biāo)峰面積比值RSD為6.04%，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。制備800 ng/mL血漿對照品溶液，平行6份，按“2.8.2”項(xiàng)下方法處理，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得對照品、內(nèi)標(biāo)峰面積比值RSD為10.43%，表明該方法重復(fù)性良好。取20、800、1 600 ng/mL血漿對照品溶液適量，按“2.8.2”項(xiàng)下方法處理，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得蛇床子素平均加樣回收率分別為93.59%、89.41%、92.25%，RSD分別為9.17%、5.42%、7.01%。

2.8.6 結(jié)果分析 取含原料藥、物理混合物、白蛋白納米粒的血漿適量，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，采用DAS2.0藥動(dòng)學(xué)軟件自動(dòng)擬合數(shù)據(jù)，繪制血藥濃度-時(shí)間曲線，結(jié)果見圖9、表4。由此可知，與原料藥比較，物理混合物Cmax、tmax、Cmax、AUC0～t無顯著差異(P>0.05)，表明空白白蛋白納米粒對蛇床子素基本無促吸收作用；與原料藥、物理混合物比較，白蛋白納米粒Cmax、AUC0～t、AUC0～∞升高(P<0.01)，tmax縮短(P<0.05)，口服生物利用度增加至3.29倍。

表4 蛇床子素主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

3 討論

蛇床子素、白蛋白用量會(huì)影響白蛋白納米粒包封率、載藥量，故結(jié)合前期預(yù)實(shí)驗(yàn)需要對兩者(20～40、300～600 mg)進(jìn)行優(yōu)化。隨著乙醇用量增加，體系依次經(jīng)歷澄清、乳光、渾濁、沉淀等變化，而乳光至渾濁是初步形成納米粒的最佳區(qū)間，故其不足時(shí)去溶劑化效果較差，影響納米粒形成[17]，但過多時(shí)又會(huì)導(dǎo)致白蛋白直接沉淀，結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定該參數(shù)優(yōu)化區(qū)間為5～10 mL。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，原料藥未能全部釋放，可能與體外釋藥實(shí)驗(yàn)時(shí)間不夠長、本身顆粒較大等原因有關(guān)；將其制成白蛋白納米粒后可增加親水性[9-11]、溶解度、比表面積，從而加快藥物釋放。白蛋白納米?？纱蟠筇岣咚幬锶芙舛龋赡芘c后者比表面積激增有關(guān)[13]，并且文獻(xiàn)[9-10, 17-18]報(bào)道，藥物在白蛋白納米粒中以無定形形式存在，故可能也會(huì)對其溶解度提高產(chǎn)生積極影響。

藥動(dòng)學(xué)研究結(jié)果顯示，物理混合物對蛇床子素的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)有一定改變，但程度遠(yuǎn)小于白蛋白納米粒，而白蛋白納米粒tmax縮短，可能是由于在復(fù)雜胃腸道環(huán)境中酶解對其產(chǎn)生破壞作用，從而使藥物快速釋放所致[19-20]；Cmax、AUC0～t升高，可能是因?yàn)樵搫┬涂稍黾铀幬镉H水性，提高溶解度、溶出度，從而解決了吸收瓶頸，最終口服吸收生物利用度增加至3.29倍。今后，可研究蛇床子素白蛋白納米粒的注射藥動(dòng)學(xué)、藥效[21]、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等，以期為其進(jìn)一步開發(fā)利用提供更全面的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及參考資料。