以番茄為寄主的香蕉穿孔線蟲不同群體的致病性差異

楊思華，趙立榮，唐世僑，楊帥，謝輝，徐春玲

1.植物檢疫線蟲檢測與防疫研究中心/華南農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，廣州 510642；2.廣州海關(guān)技術(shù)中心，廣州 510623

香蕉穿孔線蟲（Radopholus similis（Cobb，1893）Thorne，1949）是全球十大植物病原線蟲之一[1］，是一種毀滅性的遷移性內(nèi)寄生植物線蟲，其寄主多達350 多種，包括香蕉、柑橘、番茄等多種經(jīng)濟作物[2］和天南星科、棕櫚科[3］及竹芋科[4］等觀賞花卉植物，被90 多個國家、地區(qū)或組織列為檢疫性植物有害生物[5］。該線蟲主要通過口針刺入寄主細胞中取食，造成植物細胞結(jié)構(gòu)的破壞，使受侵染的根組織產(chǎn)生空腔，隨著病害的加重，根組織變黑腐爛[6］。其在寄主植物根的韌皮部和皮層取食、發(fā)育和繁殖后代，但不進入根的中柱，在病根橫切面的韌皮部和形成層中可見空腔[7］。此外，其他病原物也能隨香蕉穿孔線蟲侵染造成的傷口而侵入，使根系病害加重[8］。

番茄（Lycopersicon esculentum）具有生命周期短、容易被高效轉(zhuǎn)化、易于自交留種、相對較小的基因組等這些生物學性狀，使其成為功能基因組學研究的理想模式植物之一[9］。目前，番茄作為模式植物應用于植物線蟲和寄主互作或植物線蟲和其他病原微生物互作的研究主要集中在根結(jié)線蟲（Meloido?gynespp.），如枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）與爪哇根結(jié)線蟲（M. javanica）的互作[10］、木霉菌（Tricho?derma）與南方根結(jié)線蟲（M.incognita）的互作[11］、南方根結(jié)線蟲效應子MjTTL5 的研究[12］及番茄對根結(jié)線蟲的自身抗病基因的相關(guān)研究[13］等，在香蕉穿孔線蟲中尚無相關(guān)報道。Kaplan 等[14］證實番茄為香蕉穿孔線蟲的寄主植物，但目前尚未發(fā)現(xiàn)以番茄為寄主的香蕉穿孔線蟲不同種群致病性強弱評估的報道以及相關(guān)的組織病理學研究。本研究在實驗室沙培試管條件下對不同香蕉穿孔種群進行接種測試，以期建立一種室內(nèi)簡單易操作的香蕉穿孔線蟲侵染寄主的致病性測定體系，為進一步利用番茄作為模式寄主研究香蕉穿孔線蟲的致病機制和防治方法提供重要科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究用于致病性測定的8 個供試香蕉穿孔線蟲種群及其來源見表1，所有種群由華南農(nóng)業(yè)大學植物線蟲研究室采集、分離和鑒定，在（25±1）℃黑暗培養(yǎng)箱的胡蘿卜愈傷組織中培養(yǎng)和保存[15］。對HN6、SZ-FZ、GJ-LY323和DBSR 種群進行不同接種蟲量處理并在接種后的4個時間段進行調(diào)查，篩選最佳接種模式。對HN6、SZ-FZ、GJ-LY323、DBSR、SZ-SWK、HL-XY、ML-HG 和HaiN-YJ 種群進行番茄致病性差異測定。

表1 供試香蕉穿孔線蟲的種群信息Table 1 Population information of Radopholus similis

供試的番茄品種為金豐1 號番茄，番茄種子購于廣州長合種子有限公司。種植番茄的介質(zhì)為石英砂（直徑1~1.5 mm），購于先科聯(lián)園林花卉有限公司。

1.2 供試番茄的種植

在玻璃培養(yǎng)試管（直徑2.5 cm，高15 cm）中裝入約1/3 高度的干燥石英砂，在125 ℃20 p.s. i（約137.8 kPa）高溫高壓下滅菌2次，每次滅菌1 h，2次滅菌間隔8 h。番茄種子放到無菌水中浸泡1 d（促進發(fā)芽）后，用無菌水洗滌3 次，75%的乙醇處理1 min、12.5% NaClO 消毒30 min，再用無菌水洗滌7 次，每次2 min，將番茄種子放在鋪有濕潤濾紙的9 cm 直徑培養(yǎng)皿上，在（25±1）℃條件萌發(fā)7 d 后，挑選長勢相同的幼苗移栽到裝砂的玻璃培養(yǎng)試管中，在（25±1）℃、光照強度為1 200 lx、16 h 光照和8 h 黑暗交替的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，期間以每2 d澆水1次，濕度維持在約3%（w/w），培養(yǎng)23 d（4葉齡）后接種線蟲。

1.3 線蟲的接種

挑取香蕉穿孔線蟲雌蟲至一離心管中，制備線蟲接種懸浮液，用無菌水洗3 次，參考丁莎等[15］的線蟲消毒方法。將線蟲懸浮液用滴管接入到供試番茄苗根部深1 cm處，然后將試管放置于（25±1）℃（16 h光照，8 h 黑暗）及光照強度為1 200 lx 的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 供試線蟲對番茄的致病性測定

將香蕉穿孔線蟲雌蟲（SZ-FZ、GJ-LY323、DBSR和HN6）以200條/株的數(shù)量接種到植株根部，分別于接種后9、16、23 和30 d 對接種的根系進行觀察和拍照，選取有病害癥狀的根組織進行染色并觀察根內(nèi)線蟲，初步確定供試香蕉穿孔線蟲侵染番茄根系后，再選取相同處理的根組織，制作石蠟切片，觀察根系的組織病理學變化。植物根系染色方法參考馮志新[16］的染色方法進行，常規(guī)石蠟切片。使用尼康Eclipse 90i顯微鏡對玻片進行鏡檢和拍照。

1.5 供試線蟲接種量和接種時間對番茄發(fā)病的影響

將香蕉穿孔線蟲雌線蟲（SZ-FZ、GJ-LY323、DB?SR 和HN6）分別以50、100、150 和200 條/株的接種量，接種于番茄植株根部，于侵染9、16、23和30 d后，觀察和拍照記錄植株表現(xiàn)的癥狀，測量植株高度、根系鮮質(zhì)量，分離統(tǒng)計線蟲數(shù)量并調(diào)查統(tǒng)計病害嚴重度。病害嚴重度分級參照文獻[17］中的標準進行改進，根據(jù)根部的病斑面積或病根數(shù)量占整個根系的比例將病害嚴重程度分為6個等級：0級，根部沒有病害癥狀；1 級，根部有零星病斑，病根數(shù)量小于整個根系的5%；2 級，根部病斑較多，病根數(shù)量大于整個根系5%且小于25%；3 級，根部開始壞死腐爛，病根數(shù)量大于整個根系25%且小于50%；4 級，根部腐爛加重，病根數(shù)量大于整個根系50%且小于75%；5 級，根部腐爛嚴重，病根數(shù)量大于整個根系75%。每個處理設(shè)10 次重復，以接種清水植株為空白對照。根據(jù)此試驗結(jié)果初步確定測定香蕉穿孔線蟲種群致病性差異的最佳接種模式。

1.6 香蕉穿孔線蟲致病性測定方法的適用性檢測

選取寄主來源不同的香蕉穿孔線蟲HN6、SZFZ、GJ-LY323、DBSR、SZ-SWK、HL-XY、ML-HG和HaiN-YJ 8 個種群，以150 條/株的接種量接種于番茄植株根部，23 d后統(tǒng)計植株高、根系鮮質(zhì)量、植株根系病害嚴重度、根際線蟲數(shù)量和根內(nèi)線蟲數(shù)量，結(jié)合各參數(shù)分析不同種群的致病性差異，檢測所采用接種方法和條件的適用性。

1.7 供試線蟲的分離和計數(shù)

線蟲的分離方法參照改良的貝曼漏斗分離法和Kaplan[14］的方法進行改進，具體如下：試管中加入自來水使砂子懸浮，將根系和砂子輕輕地從管中取出并分離。砂子懸浮液置于貝曼漏斗上進行線蟲分離，在體視鏡下統(tǒng)計線蟲數(shù)量并標記為N1；將分離出來的根系切成1 cm 長的小段然后放置于10 mL 帶蓋試管中，將試管直立置于（25±1）℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)7 d，以孵化根部的蟲卵。取出根系并用攪拌機搗碎，加入適量無菌蒸餾水，在渦旋震蕩機上振蕩，使線蟲從根系中分離出來，然后進一步用孔徑為0.15 mm 和0.03 mm 的套篩淘洗，沖洗收集0.03 mm 孔徑篩上的線蟲，在體視鏡下統(tǒng)計線蟲數(shù)量并標記為N2。每株根際總蟲量為N1+N2。

1.8 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計、繪圖采用SPSS 14.0 和Excel 2013 軟件進行，結(jié)果以“平均值±標準誤”表示，采用One-Way ANOVA 進行方差分析，采用鄧肯氏新復極差法（Duncan’s multiple ranger test，DMRT）進行多重比較，顯著性水平設(shè)為α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 香蕉穿孔線蟲侵染番茄引起的癥狀和根系組織病理學

香蕉穿孔線蟲4 個不同寄主來源的種群（SZFZ、GJ-LY323、DBSR 和HN6）接種番茄植株后，番茄根系均表現(xiàn)出明顯的癥狀，但發(fā)病程度有差異（圖1）。接種后9 d 的番茄根系開始出現(xiàn)病斑，根系病斑和壞死根數(shù)隨接種時間的增加而逐漸增多，到接種后30 d 時，整個根系已明顯變褐壞死和腐爛。因此，4 個供試香蕉穿孔線蟲種群均能侵染番茄根系，并引起植物根系數(shù)量減少和形成褐色病斑為主的受害癥狀，同時隨著接種時間的增加，已發(fā)病根系癥狀逐漸加重直至壞死腐爛。

圖1 香蕉穿孔線蟲對番茄根系的危害癥狀Fig.1 Symptoms of Lycopersicon esculentum roots in?fected by Radopholus similis

香蕉穿孔線蟲侵染發(fā)病的根系經(jīng)品紅染色制片（圖2A-D）顯示，在接種后9 d，就有大量線蟲侵入根系皮層（圖2A），在接種后23 d，根系內(nèi)觀察到線蟲的蟲卵（圖2C）。接種后30 d的處理根系石蠟切片結(jié)果（圖2E-G）顯示，被線蟲侵染的根系皮層細胞明顯被破壞分解并產(chǎn)生空腔，其中有線蟲存在；中柱細胞沒有明顯崩潰分解，其中也沒有線蟲，但與健康對照根系中柱相比，線蟲侵染的根系中柱細胞膨大松散，外圍細胞被明顯破壞。因此香蕉穿孔線蟲侵染番茄根系，主要在根系皮層寄生，并產(chǎn)卵繁殖，導致皮層細胞幾乎完全分解、組織腐爛，線蟲不侵入中柱，但中柱細胞也受到一定程度的破壞。病根數(shù)量小于整個根系的5%；在接種16 d 后，各種群和接種量處理的根系均能觀察到病害癥狀，GJLY323種群在150、200條/株接種量處理的病害嚴重度最大并顯著大于其余種群，病害癥狀明顯。在接種23 d 后，各種群和接種量處理的根系均能觀察到明顯病害癥狀，在150 條/株接種量處理中，除了DB?SR 與HN6種群處理間的病害嚴重度無顯著差異外，其余種群間病害嚴重度均存在顯著差異，在200條/株接種量處理中，SZ-FZ、GJ-LY323 和DBSR 種群處

圖2 感染香蕉穿孔線蟲（SZ-FZ）的番茄根的品紅染色和石蠟切片（橫切面）Fig.2 Fuchsin staining and paraffin section of Lycopersicon esculentum roots（cross section）infected by Radopholus similis（SZ-FZ）

2.2 接種蟲量和時間對根系癥狀和線蟲繁殖率的影響

在（25±1）℃條件下，將SZ-FZ、GJ-LY323、DB?SR和HN6 種群分別以50、100、150和200條/株的接種量接種于番茄植株根際，于接種9、16、23和30 d后觀察其根系病害癥狀。接種處理后的番茄根系病害嚴重度隨接種時間和接種量的增加而增加（圖3），在接種9 d后，除以50條/株接種量接種的GJ-LY323和HN6 種群處理無病害癥狀、病害嚴重度為0 外，其余接種量和種群處理均能觀察到輕微的病害癥狀，病害嚴重度均小于2，即根部有零星病斑，大部分處理理的根系病根數(shù)量占整個根系的50%以上，病害嚴重度顯著大于HN6 種群；在接種30 d 后，除了100條/株接種量處理外，其余接種量處理中均有3 個或以上種群的病害嚴重度無顯著差異，200 條/株接種量處理中SZ-FZ、GJ-LY323 和DBSR 種群處理的根系病害嚴重，病害嚴重度達到5 級根系，病根數(shù)量大于整個根系的75%。因此，在（25±1）℃條件下，結(jié)合番茄的病害癥狀和病害嚴重度，評估香蕉穿孔線蟲對番茄致病的嚴重程度較優(yōu)的接種條件為150條/株23 d后調(diào)查。

圖3 香蕉穿孔線蟲侵染番茄后番茄根系病害嚴重度Fig.3 The disease severity of Lycopersicon esculentum roots infected by Radopholus similiss

線蟲的繁殖量隨接種時間的增加而增加，然而不同接種量條件下，線蟲的繁殖量存在差異（圖4）。在接種后9、16 d 時，各接種量處理的繁殖率均小于1。在接 種后23 d 時，以100、150 和200 條/株接種量的處理中各種群間的繁殖率存在顯著差異（P<0.05）。在接種后30 d 時，各種群和各接種量處理的線蟲繁殖率均大于1，但SZ-FZ、GJ-LY323 和DBSR 種群處理的100、150 和200 條/株處理的繁殖量增長不明顯。因此，在（25±1）℃條件下，測定香蕉穿孔線蟲以番茄為寄主時其繁殖量變化的較優(yōu)的接種條件是150、200 條/株于接種后23 d 調(diào)查或50、100條/株接種后30 d調(diào)查。

圖4 香蕉穿孔線蟲接種番茄后線蟲繁殖率Fig.4 The nematode reproductive rate of Radopholus similis after inoculated Lycopersicon esculentum

2.3 接種蟲量和時間對番茄生長量的影響

植株株高測量統(tǒng)計結(jié)果顯示，與對照組相比，接種9 d 后，株高具有顯著性差異（P<0.05）（圖5）。在同一接種量處理中，株高隨接種時間的增加而增加，但增長速率逐漸減少。在同一接種時間后，株高隨著接種量的增加而減小，但每個接種量處理中，均有3 個或以上的種群處理株高差異不顯著。因此，株高因素能反映香蕉穿孔線蟲對番茄具有一定的致病性，但不適合用于區(qū)分和評估香蕉穿孔線蟲不同種群對番茄的致病力差異。

圖5 香蕉穿孔線蟲接種番茄后植株株高Fig.5 Plant height of Lycopersicon esculentum after infected by Radopholus similis

植株根系鮮質(zhì)量測量統(tǒng)計結(jié)果顯示，與對照組相比，接種9 d 后，番茄根系鮮質(zhì)量顯著減少（P<0.05）（圖6）。在所有接種條件處理中，50 條/株接種16 d 以及150 條/株接種16、23 和30 d 這4 個接種條件下，所有種群接種后的根系鮮質(zhì)量差異均顯著（P<0.05）。因此，依據(jù)根系鮮質(zhì)量的受影響情況，在（25±1）℃條件下，測定香蕉穿孔線蟲的侵染對番茄根系鮮質(zhì)量的影響較合適的接種條件為接種50條/株16 d后調(diào)查或接種150條/株16、23 d或30 d后調(diào)查。

圖6 香蕉穿孔線蟲接種番茄后植株根質(zhì)量Fig.6 Root fresh weight of Lycopersicon esculentum infected by Radopholus similis

綜合上述“2.2”、“2.3”結(jié)果，根據(jù)根系發(fā)病癥狀嚴重度、線蟲繁殖率和寄主生長量3 個因素，分析不同種群、接種量和接種時間對香蕉穿孔線蟲侵染番茄的影響，可以得出在（25±1）℃條件下，最佳接種量為150 條/株，最佳調(diào)查時間為接種后23 d。

2.4 香蕉穿孔線蟲不同種群致病性測定結(jié)果

（25±1）℃條件下，以150 條/株的接種量接種番茄23 d 后觀察結(jié)果，測定比較8 個不同寄主來源的香蕉穿孔線蟲種群對番茄致病性（表2），結(jié)果顯示，8 個種群在根內(nèi)線蟲數(shù)量上差異最大，除HaiNYJ 和HL-XY 種群、GJ-LY323 和SZ-FZ 種群、MLHG 和HN6 種群差異不顯著外，其余各種群處理間均顯著差異（P<0.05）。HaiN-YJ 種群在根際沙子中的線蟲數(shù)量顯著高于HL-XY 種群（P<0.05），因此認為HaiN-YJ 種群致病性強于HL-XY。HN6 種群在根系鮮質(zhì)量參數(shù)上顯著低于ML-HG 種群（P<0.05），因此認為HN6種群致病性強于ML-HG 種群。根據(jù)前期根系病害癥狀結(jié)果分析，認為SZ-FZ 種群的致病性稍強于GJ-LY323 種群。結(jié)合植株生長量參數(shù)、根際和根內(nèi)線蟲數(shù)量以及植株病害程度結(jié)果分析，8 個種群致病性由高到低為：SZ-SWK>HaiN-YJ>HL-XY>SZ-FZ≥GJ-LY323>DBSR>HN6>ML-HG。

表2 香蕉穿孔線蟲不同寄主來源種群對番茄的致病性Table 2 Pathogenicity of Radopholus similis populations to Lycopersicon esculentum

3 討 論

Blake[7］早期研究香蕉穿孔線蟲侵染香蕉根系時發(fā)現(xiàn)，該線蟲取食時可刺激取食部位鄰近細胞變大，線蟲直接取食細胞質(zhì)，導致細胞壁破裂，形成空腔。O’Bannon[18］推測香蕉穿孔線蟲侵入根系在表皮層內(nèi)遷移取食，導致根系表皮層產(chǎn)生淡紅棕色的病斑，隨著線蟲取食和鄰近細胞壁的破裂，皮層形成的病斑和空腔會向內(nèi)皮層擴展，從而阻止線蟲向中柱侵入。本研究發(fā)現(xiàn)該香蕉穿孔線蟲侵染番茄金豐1 號時，主要侵染番茄根系皮層，使細胞產(chǎn)生空腔，雖不侵入中柱，但會使中柱細胞受到一定程度的破壞，進一步確定香蕉穿孔線蟲侵染致病主要在根系皮層。目前雖未有香蕉穿孔線蟲危害番茄生產(chǎn)的報道，但番茄已被證實為香蕉穿孔線蟲的寄主[19］，而Ka?plan[14］在香蕉穿孔線蟲對柑橘的致病性研究中曾選擇番茄作為對照植物，接種200 條香蕉穿孔線蟲侵染番茄30 d 后，雖然線蟲數(shù)量增多，但比在柑橘上的線蟲數(shù)量少很多。Sarah 等[19］分別對來自非洲、亞洲、中美洲和加勒比海的6 個香蕉穿孔線蟲種群進行致病性研究，證實了香蕉穿孔線蟲致病性與線蟲的繁殖率和植物病害程度有關(guān)。香蕉穿孔線蟲在25~32 ℃時的生活史是20~25 d[20］。本研究中繁殖率在接種線蟲23和30 d后大于1，說明香蕉穿孔線蟲不僅可以侵染番茄并且可以繁殖，推測隨著接種后處理時間的延長，癥狀會越來越明顯，線蟲后代會越來越多。

植物線蟲對寄主的致病性測定或植物對線蟲的抗病性測定主要受接種蟲量、接種時間和接種環(huán)境條件的影響，處理不當，會對評估結(jié)果帶來困難。Opoku-Asiama 等[21］研究番茄品種對根結(jié)線蟲不同接種量的影響，證實了接種量過高會造成抗病性弱的植物在試驗結(jié)束前已死亡，不利于研究線蟲致病性，隨著線蟲接種后處理時間的延長，接種處理的株高與健康對照株高的差異越大。根質(zhì)量常被認為是研究線蟲致病性差異的最佳指標[22］，Hahn等[23］在對10 個不同寄主來源的香蕉穿孔線蟲種群在不同品質(zhì)的香蕉上的繁殖率和致病性的研究中認為根質(zhì)量是反映不同種群致病性的最有用指標。本研究通過將4 個不同寄主和地理來源的種群接種番茄后，分析不同接種量和接種時間對番茄生長量的影響，包括株高和根質(zhì)量兩個方面，發(fā)現(xiàn)在不同種群處理中，均有3 個種群株高差異不顯著。因此，我們認為株高因素能反映香蕉穿孔線蟲對番茄具有致病性，但不適合作為分析種群致病性差異的指標。本研究結(jié)合根系病害癥狀和線蟲繁殖率因素，認為香蕉穿孔線蟲侵染番茄最佳的接種條件為150 條/株接種量，于接種23 d后觀察。

目前，普遍認為香蕉穿孔線蟲不同寄主和地理來源種群的致病力差異，有可能是由于線蟲為適應不同的環(huán)境而長期不斷進化的結(jié)果[24］。同一香蕉穿孔線蟲不同寄主或地理來源種群在同一寄主植物上的致病力有差異[25］。Pinochet[26］報道，來自巴拿馬和哥斯達黎加的香蕉穿孔線蟲種群的致病力明顯高于來自洪都拉斯的種群。Sarah 等[19］報道來自斯里蘭卡和馬提尼克島的香蕉穿孔線蟲種群對香蕉的致病力明顯強于自瓜德羅普島、哥斯達黎加、肯尼亞、象牙海岸的種群。秦丹等[27］對傳入中國的6 個香蕉穿孔線蟲觀賞植物種群進行了寄主研究，發(fā)現(xiàn)來源于竹芋和紅果的2 個種群與來自孔雀竹芋、天鵝絨竹芋和紅掌的種群相比，對巴西蕉具有更強的致病力。

本研究在實驗室沙培試管條件下對不同香蕉穿孔種群進行接種測試，明確了該線蟲在實驗室條件下對番茄的致病性，建立了在實驗室條件下香蕉穿孔線蟲侵染番茄的致病性接種體系，這可為進一步利用番茄作為模式寄主研究香蕉穿孔線蟲的致病機理和防治方法提供重要科學依據(jù)，但在大田條件下香蕉穿孔線蟲對番茄的致病性有待進一步研究。