玉米赤霉烯酮熒光定量快速檢測試紙卡及儀器技術性能優(yōu)化的研究報告

鞏性濤，田憲璽，趙 瑩，黃熙榮，王春霞，黃 偉，劉珊珊，李雅健，宋永泉，趙 皖，丁 麗，肖理文

（1.山東省糧油檢測中心，濟南 250101；2.江蘇省糧油質量監(jiān)測中心，南京 210000；3.山東省中儲糧糧油質監(jiān)中心有限公司，濟南 250199；4.南京微測生物科技有限公司，南京 210000；5.上海飛測生物科技有限公司，上海 201400）

玉米赤霉烯酮（Zearalenone）又稱F-2毒素，它首先從有赤霉病玉米中分離得到，1980年李季倫教授發(fā)現(xiàn)其它植物體內也存在玉米赤霉烯酮，如小麥、大豆等植物。玉米赤霉烯酮其產毒菌主要是鐮刀菌屬（Fμsariμm）菌株，如禾谷鐮刀菌、三線鐮刀菌、黃色菌孢、木賊菌孢、半裸菌孢及茄病鐮孢等菌種[1-2]。

玉米赤霉烯酮主要污染玉米、小麥、大米、大麥、小米和燕麥等谷物，新版食品安全標準中規(guī)定，糧食谷物及其制品中，小麥、小麥粉中玉米赤霉烯酮最高限量不得超過60 μg/kg，玉米、玉米面（渣、片）中玉米赤霉烯酮最高限量不得超過60 μg/kg[7-8]。其中玉米的陽性檢出率為45%，最高含毒量可達2 909 mg/kg，小麥的陽性檢出率為20%，含毒量為0.364~11.05 mg/kg。玉米赤霉烯酮的耐熱性較強，110℃下處理1 h才能被完全破壞。

玉米赤霉烯酮具有雌性激素作用，能造成動物急慢性中毒，引起動物繁殖機能異常甚至死亡，會對畜牧業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失。妊娠期的動物食用含有玉米赤霉烯酮的食物可引發(fā)流產、死胎和畸胎，食用含有赤霉病麥面粉制作的各種面食也可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)的中毒癥狀，如惡心、發(fā)冷、頭痛、神智抑郁和共濟失調等。

目前，一般都采用液相和氣相色譜的方法測定玉米赤霉烯酮，測定結果準確，但是測定的方法較為復雜，對儀器的要求高，且無法在現(xiàn)場和基層小型實驗室使用[3]；膠體金快速定量法檢測糧食中玉米赤霉烯酮的含量，檢測限為5 μg/kg[4]，根據(jù)顏色深淺和儀器內置曲線自動計算樣品中玉米赤霉烯酮的含量，步驟簡單，檢測快速，但檢測準確度與重復性較差，容易造成假陽性或假陰性；因此針對快速檢測試紙卡存在的不足，山東省糧油檢測中心與南京微測生物科技有限公司基于熒光定量免疫層析平臺的玉米赤霉烯酮熒光定量快速檢測試紙卡進行了產品優(yōu)化升級，使之操作簡單快速，準確度和重復性較高，且整體使用成本較進口快檢產品降低30%左右，能更好滿足不同客戶的日常檢測需求，確保糧食和食品的安全。

1 實驗材料和方法

1.1 試劑和材料

除注明外，均為分析純，試驗用水均為國標一級蒸餾水。

玉米赤霉烯酮熒光定量快速檢測試紙卡由乳膠墊、NC膜、樣品墊及吸收墊組成，乳膠墊上包裹有熒光微球標記玉米赤霉烯酮抗體；NC膜上噴涂有玉米赤霉烯酮抗原檢測線和羊抗兔二抗控制線。樣品提取液、樣品稀釋液、標準曲線ID卡及標準曲線條形碼均由上海飛測生物科技有限公司提供。

玉米赤霉烯酮的標準品：購自Sigma公司；大米、玉米、小麥等樣品從超市購得或從企業(yè)取樣；麩皮，小麥、面粉等飼料樣品從飼料廠、面粉加工廠和小麥收儲企業(yè)取樣。

1.2 儀器與設備

FD-600型熒光免疫定量分析儀和FD-2000型試紙卡恒溫孵育器，由上海飛測生物科技有限公司提供生產；低速離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司；漩渦混勻器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；電子天平，Sartoriμs賽多利斯公司。

1.3 試驗方法

1.3.1樣品的前處理

取具有代表性的待測樣品500 g，用粉碎機粉碎1 min后過20目篩，收集過篩后的均勻細小樣品。稱取過篩后的樣品5.0±0.02 g于50 mL離心管中，加入25 mL提取液，用漩渦混勻器振蕩3 min(或者搖床振蕩3 min）后，4 000 r/min離心2 min，取上清液。

1.3.2檢測過程

100 μL離心上清液加入400 μL樣品稀釋液中，用漩渦混勻器混勻3~5 s，然后取100 μL待測液加入到玉米赤霉烯酮熒光定量試紙卡的加樣孔中，置于37℃恒溫孵育器中孵育8 min，8 min后將試紙卡插入熒光定量免疫分析儀中讀數(shù)，讀數(shù)值即為樣品的實際檢測濃度。當檢測值大于5 000 μg/kg時，可用提取液將離心上清液稀釋5倍后再按照后續(xù)步驟進行檢測，所得讀數(shù)值乘以5即為樣本最終的檢測濃度。

1.3.3試紙卡原理

當將待測樣品滴加在試紙卡加樣區(qū)時，樣品中的玉米赤霉烯酮與結合墊中熒光微球標記的玉米赤霉烯酮抗體結合并通過毛細作用向前層析，到達檢測區(qū)后，檢測線T線上固定的玉米赤霉烯酮抗原與剩余未結合的熒光微球標記玉米赤霉烯酮抗體結合。檢測線T線上結合的熒光微球標記抗體的量與樣品中待測物的量成反比，質控線C線結合的熒光標記物與樣品中待測物的量無關，剩余或其它熒光標記物繼續(xù)層析達到吸收區(qū)。反應結束后，使用熒光定量免疫分析儀讀取T線和C線的熒光強度并計算T/C值，通過儀器內置的標準曲線即可計算出樣品中玉米赤霉烯酮的含量。

1.3.4試紙卡優(yōu)化

在單T線的基礎上，增加一條矯正T線，形成一條質控線C線、兩條檢測線T線。

1.3.5稀釋液優(yōu)化在原有稀釋液緩沖體系離子濃度的基礎上，增加緩沖體系離子濃度，拓寬對樣品pH值調節(jié)范圍。

2 檢測結果分析

2.1 玉米赤霉烯酮試紙卡檢測線數(shù)量由兩線優(yōu)化成三線的實驗結果

選用國標法測定玉米赤霉烯酮，在濃度值為空白的樣本中分別添加濃度為10、25、50、100、250、500、1 000 μg/kg的玉米赤霉烯酮，然后按照玉米赤霉烯酮試紙卡檢測方法同時進行兩線及三線試紙卡檢測，每個加標樣本各檢測2個平行樣，對比試紙卡的靈敏度，檢測結果見表1；選取高中低3個加標濃度點，每個加標樣本檢測6個平行樣，對比試紙卡的重復性，檢測結果見表2。

從表1可知，玉米赤霉烯酮三線試紙卡的25μg/kg檢測靈敏度為32.52%；兩線試紙卡的25μg/kg檢測靈敏度為26.53%；從單一25 μg/kg濃度點檢測靈敏度對比，三線試紙卡靈敏度更高；且綜合對比不同濃度點的檢測靈敏度，也得出玉米赤霉烯酮三線試紙卡靈敏度較兩線試紙卡更高。

表1 玉米赤霉烯酮兩線與三線試紙卡的靈敏度 （濃度單位：μg/kg）

從表2可知，篩選高中低三個濃度點進行重復性檢測，玉米赤霉烯酮三線試紙卡檢測變異系數(shù)CV范圍為6.10%~8.72%；兩線試紙卡檢測變異系數(shù)CV范圍為8.27%~11.08%；對比三線試紙卡與兩線試紙卡的檢測變異系數(shù)CV范圍，三線試紙卡檢測變異系數(shù)CV更小，重復性更高。

表2 玉米赤霉烯酮兩線與三線試紙卡的重復性 （濃度單位：μg/kg）

綜合對比玉米赤霉烯酮三線試紙卡與兩線試紙卡的靈敏度與重復性，玉米赤霉烯酮三線試紙卡比兩線試紙卡靈敏度、重復性更高。

2.2 玉米赤霉烯酮試紙卡稀釋液緩沖體系從50 mM改為100 mM的實驗結果

選用玉米加工副產物中pH值為中性的樣本上清液，分別調節(jié)樣品上清液的pH值為2、4、6、8、10、12，然后按照玉米赤霉烯酮試紙卡檢測方法同時進行50 mM及100 mM離子濃度樣品稀釋液的檢測，每個pH值樣品上清液各檢測2個平行樣，對比試紙卡的準確度，檢測結果見表3。

從表3可知，50 mM離子濃度樣品稀釋液檢測回收率范圍99.82%~155.52%，100 mM離子濃度樣品稀釋液檢測樣品回收率范圍97.43%~112.05%，尤其在樣品上清液為酸性條件下，100 mM離子濃度樣品稀釋液檢測結果更穩(wěn)定，所以增加緩沖體系離子濃度，可以拓寬對樣品pH值的檢測范圍。

表3 相同樣本不同pH上清液檢測結果

2.3 選用檢測線數(shù)量為三線、100 mM離子濃度樣品

稀釋液玉米赤霉烯酮試紙卡進行產品性能檢測

2.3.1玉米赤霉烯酮試紙卡的檢出限及定量限的實驗結果

選用國標法測定玉米赤霉烯酮，取濃度值為空白樣本20份，按照玉米赤霉烯酮試紙卡檢測方法進行檢測，每個樣本檢測1個試紙卡。結果見表4。

由表4中檢測數(shù)據(jù)分析可知：玉米赤霉烯酮試紙卡檢出限為5.097 μg/kg；定量限為14.291 μg/kg。

表4 玉米赤霉烯酮試紙卡的檢出限及定量限 （濃度單位：μg/kg）

2.3.2玉米赤霉烯酮試紙卡檢測范圍的實驗結果

選用國標法測定玉米赤霉烯酮，在濃度值為空白的樣本中分別添加濃度為25、50、100、250、500、1 000 μg/kg的玉米赤霉烯酮，然后按照玉米赤霉烯酮試紙卡檢測方法進行檢測，每個加標樣本各檢測2個平行樣。檢測結果見表5。

通過表5的檢測數(shù)據(jù)可知，在空白樣本中添加玉米赤霉烯酮的濃度為25 μg/kg時，檢測靈敏度為33.08%，與空白樣本檢測存在梯度差；陰性樣本加標濃度從25~1 000 μg/kg時，檢測靈敏度范圍為33.08%~96.22%，且不同濃度點檢測抑制率分散率較好，故玉米赤霉烯酮可定量檢測范圍為25~1 000 μg/kg。

表5 玉米赤霉烯酮試紙卡的檢測范圍 （濃度單位：μg/kg）

2.3.3玉米赤霉烯酮試紙卡的準確度和重復性的實

驗結果

選用國標法測定玉米赤霉烯酮，在濃度值為空白的玉米、小麥樣本中分別添加濃度為25、50、100、250、500、1 000 μg/kg的玉米赤霉烯酮，然后按照玉米赤霉烯酮熒光定量試紙卡的檢測方法進行檢測，每個加標樣本各檢測5個平行樣。檢測結果見表6。以添加的標準品濃度為橫坐標，玉米赤霉烯酮熒光定量試紙卡的檢測結果為縱坐標，擬合曲線并計算線性相關系數(shù)，結果如圖1、圖2所示。

通過表6可知，小麥樣本的加標回收率為91.67%~116.51%；玉米樣本的加標回收率為93.01%~115.67%；綜合兩種不同基質樣本加標檢測回收率范圍為91.67%~116.51%，說明樣本加標檢測回收率高，玉米赤霉烯酮試紙卡檢測準確度較高；小麥樣本的變異系數(shù)CV范圍為3.42%~10.63%；玉米樣本的重變異系數(shù)CV范圍為2.15%~8.32%；綜合兩種不同基質樣本加標檢測變異系數(shù)CV范圍為2.15%~10.63%，說明玉米赤霉烯酮試紙卡整體變異系數(shù)CV較小，試紙卡重復性較好。

表6 玉米赤霉烯酮試紙卡的準確度和重復性

如圖1、圖2可知，計算得出小麥的線性范圍25~1 000 μg/kg(6點），回 歸 方 程：y=0.9172x+13.872，相關系數(shù)R2=0.9981；玉米的線性范圍：25~1 000 μg/kg(6點），回歸方程：y=0.999x+10.792，相關系數(shù)R2=0.995。

圖1 小麥中玉米赤霉烯酮毒素添加與玉米赤霉烯酮試紙卡的線性關系

圖2 玉米中玉米赤霉烯酮毒素添加與玉米赤霉烯酮試紙卡的線性關系

2.3.4玉米赤霉烯酮試紙卡的穩(wěn)定性的實驗結果

將玉米赤霉烯酮檢測試紙卡放在2~10℃環(huán)境下保存，并在每個月固定日期進行樣本檢測，篩選固定濃度玉米赤霉烯酮標準品用于試紙卡穩(wěn)定性檢測，每個樣本檢測1個試紙卡，檢測結果見表7。

通過表7數(shù)據(jù)可知，玉米赤霉烯酮試紙卡在2~10℃保存12個月，不同基質樣本的檢測偏差范圍為-9.62%~9.04%，說明玉米赤霉烯酮試紙卡在2~10℃溫度12個月的保存整體偏差在10%以內，說明產品穩(wěn)定性較好。

表7 玉米赤霉烯酮試紙卡的穩(wěn)定性 （濃度單位：μg/kg）

2.4 設備與產品優(yōu)化后進行玉米粉中玉米赤霉烯酮不同單位驗證檢測

通過表8~表16的計算分析可知，三家驗證單位檢測結果平均值也符合國家標準適用性要求，說明設備與產品穩(wěn)定性較好。

表8 檢出限與定量限（單位：μg/kg）：玉米基質

表16 儀器穩(wěn)定性結果（單位：μg/kg）：玉米基質

驗證單位1：山東省糧油檢測中心；驗證單位2：中儲糧山東分公司質檢中心實驗室；驗證單位3：江蘇省糧油質量監(jiān)測中心。

表9 濃度水平1準確性結果（單位：μg/kg）：玉米基質

2.5 優(yōu)化試紙卡與其它產品檢測對比

通過表17中優(yōu)化產品同國外知名品牌產品對同一樣本檢測數(shù)據(jù)對比，優(yōu)化產品回收率為99.67%，國外知名品牌產品回收率為90.72%；優(yōu)化產品變異系數(shù)CV為3.68%，國外知名品牌產品回收率為11.04%，從樣本值檢測回收率與變異系數(shù)CV數(shù)據(jù)分析，優(yōu)化產品的檢測效果優(yōu)于進口產品，說明可以替代進口產品。

表17 優(yōu)化產品與進口產品玉米赤霉烯酮質控品檢測結果 （單位：μg/kg）：玉米基質

表10 濃度水平2準確性結果（單位：μg/kg）：玉米基質

表11 濃度水平3準確性結果（單位：μg/kg）：玉米基質

表12 濃度水平1臺間差結果（單位：μg/kg）：玉米基質

表13 濃度水平2臺間差結果（單位：μg/kg）：玉米基質

表14 濃度水平3臺間差結果（單位：μg/kg）：玉米基質

3 結論

從玉米赤霉烯酮熒光定量試紙卡三線與兩線的靈敏度、不同濃度點梯度與重復性等的檢測數(shù)據(jù)對比可知，三線試紙卡靈敏度更高；不同濃度點分布更合理，且三線試紙卡檢測變異系數(shù)CV范圍更小，重復性更高；從增加樣品稀釋液中緩沖體系的離子濃度對不同pH值樣本上清液檢測數(shù)據(jù)影響對比可知，緩沖體系離子濃度增加時，檢測結果符合度更高，會明顯降低不同pH值對樣本檢測結果的影響。且通過對選用高離子濃度緩沖體系樣品稀釋液的三線試紙卡其檢測限、檢測范圍、不同基質樣本重復、穩(wěn)定性等檢測驗證實驗可知，優(yōu)化后三線試紙卡的準確度、重復性、穩(wěn)定性等均達到更優(yōu)的效果，更能滿足快速定量檢測需求。另外根據(jù)熒光定量免疫分析儀穩(wěn)定性要求檢測鑒定結果可知，儀器穩(wěn)定性好且兩臺設備的測定結果之間不存在顯著性差異，完全可以替代同類進口儀器。

表15 濃度水平2重復性結果 （單位：μg/kg）：玉米基質

從產品性能上綜合評價，普通免疫層析快檢產品通常采用單檢測線（T線）定量方法，產品研發(fā)周期更短，生產工藝更為簡單，成本也更低，但檢測結果的精密度難以控制，導致結果的重復性較差。玉米赤霉烯酮熒光定量快速檢測試紙卡在單T線的基礎上，增加一條矯正T線，與質控線（C線）一起，形成“雙保險”，大大提升了檢測結果的準確度、精密度和重復性。通過對產品樣品稀釋液的優(yōu)化，進一步降低了樣品pH值對最終產品檢測的干擾，進一步提升了樣本檢測的準確度，為構建國家糧食安全體系提供有力的技術支撐。