地參多糖分離提取及含量測(cè)定研究進(jìn)展

李倩倩 ，陳貴元 ，2*

（1.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南 大理 671000；2.云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 大理 671000）

地參為唇形科地筍屬多年生草本植物，別名蟲草參、銀條菜、地蠶子，主要分布于云南西北部的大理州和麗江市，屬藥食兩用植物，地下根莖為白族傳統(tǒng)草藥。地參具有通經(jīng)活血、益氣生津的功效，常用于治療熱病傷津、心煩口渴、產(chǎn)后瘀血、水腫等癥[1]。地參中至少含有17 種氨基酸（7 種為人體必需的氨基酸）及礦質(zhì)元素、維生素等多種營養(yǎng)成分[2]，還含有多糖類、酚酸類、三萜類、黃酮類、皂苷、揮發(fā)油等豐富的化學(xué)成分[3]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，地參多糖具有抗腫瘤、抗氧化、抗凝血、免疫調(diào)節(jié)以及調(diào)節(jié)腸道菌群等多種生物學(xué)活性[4]。目前，以多糖為重點(diǎn)的糖工程研究是生物化學(xué)和分子生物學(xué)研究領(lǐng)域中的科技前沿，地參多糖的分離提取及生物學(xué)活性研究引起了人們的廣泛關(guān)注。本文對(duì)地參多糖的分離提取、純化工藝及含量測(cè)定方法的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，旨在為地參多糖在醫(yī)療衛(wèi)生、化工制藥、飲食保健等領(lǐng)域的綜合利用提供理論依據(jù)。

1 地參多糖的提取工藝

1.1 地參預(yù)處理

正式提取地參多糖前需對(duì)地參原料進(jìn)行預(yù)處理，以提高多糖得率和純度。預(yù)處理一般包括清洗、除雜、粉碎和脫脂等工藝技術(shù)[5]。用超純水清洗地參干料，目的是去除地參原料中的灰塵、泥沙、微生物及部分殘留的化學(xué)農(nóng)藥，保證地參原料的清潔衛(wèi)生和食用安全。脫水冷凍干燥后將地參原料剪切成碎塊，粉碎、過篩得地參粉末，目的是增大原料在提取過程中與溶劑的接觸面積，從而提高提取率。

大部分植物多糖屬于脂多糖或高脂肪含量的原料，原料脫脂的目的是去除脂溶性雜質(zhì)，使水溶液試劑更容易滲入到原料內(nèi)部，原料中的多糖成分更容易析出，從而提高多糖提取率。脫脂劑對(duì)于油脂具有選擇性，不同的植物多糖應(yīng)選擇不同的脫脂劑，同時(shí)要注意脫脂劑配比、脫脂時(shí)間、脫脂溫度、料水比等的影響[5]。常見的脫酯方法有3 種[6-8]。石油醚脫脂：在42 ℃條件下，用石油醚浸泡回流2 h；乙醇脫脂：95%乙醇提取2～3 h；乙醇- 石油醚聯(lián)合脫脂：在38 ℃條件下將乙醇和石油醚按體積比2︰3混合作為脫脂劑，回流脫脂6 h。地參多糖一般選用石油醚脫脂法，多糖提取含量較高、脫脂效果最好。

1.2 地參多糖的提取方法

植物多糖的提取方法包括稀酸浸提法、稀堿浸提法、超聲波輔助提取法、酶解提取法、熱水浸提法、微波輔助提取法等[8]，為了得到更好的多糖得率，常采取2 種或2 種以上的方法聯(lián)合使用。多糖得率還受單因素的影響，如：不同的提取方法、不同產(chǎn)地的地參、地參的品種、采收地參的季節(jié)、浸提時(shí)間、提取溫度、不同水料比、提取次數(shù)等[9]。目前，國內(nèi)地參多糖的提取方法主要是熱水浸提法和超聲波輔助提取法。

1.2.1 熱水浸提法 多糖類物質(zhì)是由C、H、O 3 種元素組成的含有多羥基醛類或酮類的生物有機(jī)大分子化合物，具有溶于水又易溶于乙醇、溶解度低的特性。鑒于此，采用熱水浸提法[10]。當(dāng)選用浙江寧波產(chǎn)地地參時(shí)，料水比1︰300（g/mL）、浸提溫度100 ℃、浸提時(shí)間1.5 h、循環(huán)提取3 次，地參多糖的得率為3.64%[9]。陳貴元等[11]選用云南大理產(chǎn)地地參干料，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法優(yōu)化地參多糖的最佳浸提工藝，得到最佳最取工藝為提取溫度80 ℃、料水比1︰15（g/mL）、浸提時(shí)間 3 h、提取 1 次，在該工藝條件下測(cè)得地參多糖得率為16.8%。

1.2.2 超聲波輔助提取法 超聲輔助提取技術(shù)利用超聲波的機(jī)械化學(xué)作用破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，提高了多糖的提取速度，但超聲波屬于機(jī)械波，在一定強(qiáng)度的沖擊波和微電流條件下會(huì)導(dǎo)致多糖結(jié)構(gòu)遭到破壞、生物學(xué)活性大幅度降低，同時(shí)超聲時(shí)間、超聲功率、超聲波強(qiáng)度、固液比、提取次數(shù)、浸提時(shí)間等也會(huì)影響多糖得率，需嚴(yán)格控制[12]。朱苗等[13]通過正交試驗(yàn)優(yōu)化的地參多糖超聲輔助提取的最佳工藝為料液比1︰48（g/mL）、超聲功率 280 W、浸提溫度 80 ℃、浸提時(shí)間90 min，此時(shí)地參多糖的得率為7.2%，多糖含量為6.18%。研究證實(shí)超聲輔助提取法具有提取時(shí)間短、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)，具有良好的應(yīng)用前景。

1.3 地參多糖去除蛋白質(zhì)的方法

為最大限度提高多糖得率、降低多糖損失量、提高檢測(cè)效率，需將所需要的蛋白質(zhì)與其他雜蛋白質(zhì)分離開。除去多糖中雜蛋白質(zhì)的方法有Sevag 法、酶法、酶 -Sevag 法、三氯乙酸法（TCA 法）、鹽析法（NaOH-CaCl2法、NaOH-NaCl 法）、蛋白質(zhì)等電點(diǎn)法、聚酰胺法等[14]。目前地參多糖最常用的是三氯乙酸-正丁醇法脫蛋白，蛋白質(zhì)去除率可達(dá)80.28%±0.98%，多糖損失率僅為9.67±0.97%[15]。

1.4 地參多糖脫色

提取得到的地參粗多糖含有色素，顏色較深。色素嚴(yán)重影響地參多糖的純度、理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)表征以及生物學(xué)活性。植物多糖的脫色方法主要有活性炭吸附法、氧化脫色法、殼聚糖法、樹脂脫色法等[16]。近年來，活性炭吸附法和氧化脫色法逐漸受到人們的廣泛關(guān)注，活性炭吸附主要是將植物多糖上的色素經(jīng)范德華力作用吸附到活性炭表面，活性炭對(duì)不帶電物質(zhì)的吸附力比帶電物質(zhì)的吸附力強(qiáng)，易于吸附含有芳香族或3 個(gè)碳原子以上的有機(jī)物。氧化脫色法主要通過氧化劑將多糖提取物中的還原性有色物質(zhì)氧化脫色[16]。李巖等[15]比較了活性炭脫色和過氧化氫脫色2 種方法對(duì)大理州劍川縣產(chǎn)地地參多糖色素的脫色效果，結(jié)果表明質(zhì)量濃度為1.5%的活性炭對(duì)地參多糖水溶液中的色素具有良好的去除作用，去除率可達(dá)93.42%±0.84%，多糖損失率為18.18%±1.31%；濃度為1.5%的過氧化氫脫色率僅為62.73%±1.43%，多糖損失率高達(dá)69.38%±1.22%，表明活性炭脫除地參多糖色素的脫色效果優(yōu)于過氧化氫。經(jīng)脫色后的地參多糖呈灰白色。

2 地參多糖的分離純化工藝

植物多糖又稱植物多聚糖，是植物細(xì)胞代謝產(chǎn)生的聚合度超過10 個(gè)的聚糖，其純度的含義不同于小分子。純的植物多糖為均一組分多糖，即多糖分子具有連續(xù)、正態(tài)分布的分子質(zhì)量及確定的糖組分和糖殘基成分。目前，多糖的分離純化方法主要有有機(jī)溶劑分級(jí)沉淀法、季胺鹽沉淀法、生物酶純化法、酸純化法、超濾法、絮凝純化法、柱層析法等[17]，最常用的是柱層析法。柱層析法包括纖維素柱層析、離子交換柱層析、凝膠過濾柱層析等[17]。凝膠過濾柱層析具有操作簡(jiǎn)單，節(jié)省人力、物力、時(shí)間，準(zhǔn)確度高，多糖活性不受影響等優(yōu)點(diǎn)。黃小蘭等[18]將高效液相色譜法和PMP(1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮)衍生化方法相結(jié)合，全面優(yōu)化反應(yīng)時(shí)間、溫度、劑量等條件，對(duì)地參多糖進(jìn)行了分離純化研究，并測(cè)定出地參多糖由8 種單糖組成。

3 地參多糖含量測(cè)定

植物多糖含量的測(cè)定方法主要有硫酸- 苯酚法、蒽酮-硫酸法、酚-硫酸法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、離子色譜法、Somogy 比色法、3，5-二硝基水楊酸法、間羥基聯(lián)苯法等[19]，目前最常用的是硫酸-苯酚法。吳紅燕等[9]采用硫酸法-苯酚測(cè)定寧波本地產(chǎn)的地參多糖含量，量取2.0 ml 地參多糖溶液后加入5%苯酚溶液1.0 ml、濃硫酸5.0 ml，于40 ℃恒溫水浴箱中水浴12 min，測(cè)得地參多糖的含量為13.64%。楊勤等[20]采用硫酸-苯酚法測(cè)定大理州劍川縣的地參多糖含量，苯酚用量0.8 ml、硫酸用量3.5 ml、加熱時(shí)間9 min，測(cè)得地參多糖的含量為14.41%。姜峰等[21]采用苯酚-硫酸法測(cè)得種源地廣西欽州地區(qū)的地參在寧波種植后，多糖含量僅為8.58%。

4 結(jié)語與展望

在生命體中多糖不僅是構(gòu)成細(xì)胞和有機(jī)體的重要組成部分，還承載著多種生物學(xué)功能，是生物體內(nèi)一類重要的生物大分子，在細(xì)胞通訊、細(xì)胞增殖與分化、細(xì)胞凋亡、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等生命活動(dòng)中均發(fā)揮著重要作用。植物多糖因其安全、高效、低毒等優(yōu)勢(shì)已成為醫(yī)學(xué)和食品等領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[22]。植物多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)是其生物活性的基礎(chǔ)，多糖的組成和結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的多糖其生物活性具有較大的差異。目前對(duì)于地參多糖的結(jié)構(gòu)層次、鏈間空間構(gòu)象及序列分析的研究較少，因此研究地參多糖的一級(jí)結(jié)構(gòu)、高級(jí)結(jié)構(gòu)、單糖組成及闡明地參多糖作用機(jī)制將成為地參多糖研究的重點(diǎn)課題。此外，探究地參多糖生物學(xué)活性與結(jié)構(gòu)的構(gòu)效關(guān)系的研究也將對(duì)糖類新型藥物及糖類保健品的研究與開發(fā)具有重要的實(shí)踐指導(dǎo)意義。