氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法測定白酒中4類風味物質(zhì)

徐志飛 吳宇伉 蔣瑜宏 周 閏

(無錫市疾病預防控制中心，江蘇 無錫 214023)

白酒復雜酒體體系中的某些微量成分不僅影響其風味、口感、品質(zhì)，還有益于健康，探究白酒中微量成分對白酒品質(zhì)和風味的影響是近年來白酒領(lǐng)域研究的熱點[1-3]。

影響白酒風味的微量物質(zhì)主要包括酯類、醇類、酸類、醛類、酮類、酚類、縮醛類等[4-6]。在白酒生產(chǎn)過程中，酸類通過酶催化與乙醇反應形成酯[7]。而酯化是一種可逆的化學反應，在白酒發(fā)酵后期以及貯存過程中，酯類又會分解成醇和酸，對白酒風味的形成起決定性作用[8]。醇類、酸類、醛類作為白酒風味的骨架成分，各類微量物質(zhì)的不同造成不同香型白酒中風味物質(zhì)的差異，研究白酒中各種風味物質(zhì)對于提高白酒風味品質(zhì)具有重要意義[9-11]。

現(xiàn)有白酒中風味物質(zhì)分析檢測的方法主要有氣相色譜(GC)法[12-13]、氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)法[14-15]、全二維氣相色譜—飛行時間質(zhì)譜(GC×GCTOFMS)[5]、氣相色譜—嗅聞(GC-O)法[16]和電子鼻[17]等。GC法的靈敏度較低，特異性不高，只憑保留時間難以對復雜化合物中微量組分做出可靠的定性鑒定；GC×GC/TOFMS可對白酒中上百種成分進行定性分析，但普及度不高，暫且無法作為白酒分析的常規(guī)技術(shù)手段進行推廣。GC-MS法靈敏度高、特異性強，應用范圍較廣，適用于常規(guī)的日常檢測工作。目前白酒風味物質(zhì)最常用的預處理方法有：直接進樣(DI)、固相微萃取(SPME)、液液萃取(LLE)和固相萃取(SPE)、超臨界流體萃取(SFE)[18-19]、同時蒸餾萃取(SDE)[20]等。LLE方法樣品及萃取劑用量大、選擇性差、對低沸點揮發(fā)性成分存在一定的損失；SPE方法所需萃取柱的成本較高、需要進行反復的試驗優(yōu)化、樣品吸附量少、耗時長；傳統(tǒng)的SPME具有萃取量不足和吸附競爭等缺點[13,21]。DI法操作簡單、分析快速、可避免有機溶劑的污染和微量成分的損失，故研究擬建立直接進樣聯(lián)合GC-MS的方法測定白酒中風味物質(zhì)，運用該方法測定市售3種不同香型白酒中的4類風味物質(zhì)，探究不同香型白酒風味成分組成規(guī)律與差異，以期為白酒風味物質(zhì)的進一步研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白酒(清香型、濃香型、醬香型各2份)：市售；

無水乙醇：純度≥99.8%，上海安譜實驗科技股份有限公司；

乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、丙醇、異丁醇、正丁醇、異戊醇：純度≥99.0%，天津市康科德科技有限公司；

乙酸、丁酸、戊酸、己酸：純度≥99.5%，德國Dr. Ehrenstorfer公司；

壬醛、癸醛：純度≥99.1%，上海安譜實驗科技股份有限公司；

AgilentFFAP、DB-1、DB-5、DB-624毛細管色譜柱(30 m×250 μm，0.25 μm)：安捷倫科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀：Agilent 7890B-7000C型，美國安捷倫公司；

超純水系統(tǒng)：Milli-Q Reference型，美國Millipore公司；

電子天平：XS105DU型，梅特勒托利多科技(中國)有限公司；

渦旋混勻器：IKA KS260型，德國IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液制備 稱取14種風味物質(zhì)各500 mg分別置于10 mL容量瓶中，加乙醇溶液(60%)定容，配制成質(zhì)量濃度為50.0 g/L的標準物質(zhì)儲備液。分別移取一定量的單標儲備液配制酯類質(zhì)量濃度為5 g/L，酸類質(zhì)量濃度為2.5 g/L，醇類和醛類質(zhì)量濃度為0.5 g/L的混合標準溶液，再逐級稀釋成標準曲線，使用前配制，混勻后上機測定。

1.3.2 樣品處理 采集市場上不同香型不同品牌的6個白酒樣品，移液器直接移取1 mL酒樣于進樣小瓶中，與標準曲線在相同色譜條件下直接進樣檢測，重復測定2次，以均值作為樣品結(jié)果進行計算。另取60%乙醇溶液做基質(zhì)，分別添加3種不同濃度的標準溶液進行加標回收試驗的分析，每個加標水平重復6次。

1.3.3 色譜條件 進口樣溫度250 ℃，進樣量1 μL，分流比20∶1；載氣流量1.5 mL/min；FFAP色譜柱(30 m×250 μm，0.25 μm)；采用程序升溫模式：80 ℃(1 min)→10 ℃/min→180 ℃(1 min)→ 30 ℃/min→240 ℃(1 min)。

1.3.4 質(zhì)譜條件 電子轟擊電離源(EI)，電離能量70 eV；離子源溫度230 ℃；傳輸線溫度250 ℃；選擇離子掃描(SIM)，參數(shù)如表1所示；溶劑延遲1.5 min。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理 采用安捷倫Mass Hunter workstation軟件提取保留時間和色譜峰面積，每組試驗重復測定回收率和相對標準偏差，用Microsoft Office Excel 2017軟件進行數(shù)據(jù)處理。使用Origin 8.0繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱的選擇

用同一份白酒樣品分別使用不同極性的色譜柱(DB-1、DB-5、DB-624、FFAP)測試后發(fā)現(xiàn)，各待測物在非極性至中極性的柱子上雖能分離，但峰形較差，影響定量結(jié)果的準確性；而在FFAP柱上，各峰峰形尖銳，可獲得滿意的分離較果。故選用FFAP毛細管柱。14種目標物的定性離子、定量離子(見表1)色譜峰均獲得良好分離，其中丁酸乙酯與正丙醇保留時間相近，但兩種物質(zhì)的定量離子不同，在定量計算中不受影響，標準色譜圖(質(zhì)量濃度為1.0 g/L的標準溶液)如圖1所示。

表1 白酒中4類風味物質(zhì)的SIM參數(shù)

1. 乙酸乙酯 2. 正丙醇 3. 丁酸乙酯 4. 異丁醇 5. 正丁醇 6. 異戊醇 7. 己酸乙酯 8. 乳酸乙酯 9. 壬醛 10. 乙酸 11. 癸醛 12. 丁酸 13. 戊酸 14. 己酸

2.2 分流比的選擇

選擇適當?shù)姆至鞅瓤筛纳品逍危貏e是可顯著改善醇類的峰形。試驗設(shè)置分流比分別為1∶1，5∶1，10∶1，20∶1，30∶1，進樣后發(fā)現(xiàn)隨著分流比的增加，幾種待測物色譜峰拖尾現(xiàn)象明顯好轉(zhuǎn)，但分流比較大時，檢測器響應信號也變低(見圖2)，綜合考慮，選擇分流比為20∶1。

圖2 不同分流比下的色譜圖Figure 2 Chromatograms under different split ratios

2.3 方法學考察

2.3.1 線性方程、檢出限和定量限 根據(jù)實際樣品中目標物的可能濃度范圍，用乙醇溶液(60%)配制了不同濃度范圍的混合標準溶液，其中酯類0.005～5.0 g/L，酸類0.002 5～2.5 g/L，醇類和醛類0.000 5～0.5 g/L，14種化合物線性良好，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.998 5。將最低點混合標準溶液逐級稀釋，取稀釋后的溶液注入儀器，進樣分析，選擇3倍信噪比(S/N)對應的濃度即為檢出限，10倍(S/N)對應的濃度即為定量限，根據(jù)結(jié)果可知，14種風味物質(zhì)的檢出限為0.007～0.07 mg/L，定量限為0.02～0.20 mg/L。線性方程、檢出限和定量限詳見表2。

表2 白酒中4類風味物質(zhì)的線性范圍、檢出限和定量限

2.3.2 準確度與精密度 在白酒的風味構(gòu)成中以酯類含量最多，酸類及醇類其次，根據(jù)樣品的實際情況以60%乙醇溶液為基質(zhì)進行低、中、高濃度水平的加標試驗，酯類加標質(zhì)量濃度為0.10，0.50，1.0 g/L；醇類及醛類加標質(zhì)量濃度為0.01，0.05，0.1 g/L；酸類加標質(zhì)量濃度為0.05，0.25，0.50 g/L，每個濃度水平重復檢測6次。由表3可知，14種風味物質(zhì)的加標回收率為87.8%～107.4%，相對標準偏差(RSDs)為2.0%～7.4%。GB/T 10345—2022《白酒分析方法》中規(guī)定在重復性條件測定下4種酯類的精密度不超過5%，乙酸和己酸不超過10%，研究結(jié)果符合國家標準的規(guī)定，說明試驗測定結(jié)果準確，能滿足酒樣直接測定的需要。

表3 加標回收率和精密度

2.4 與已知方法比較

現(xiàn)有白酒中風味物質(zhì)分析檢測方法研究見表4。GC作為白酒中風味物質(zhì)常用的定量技術(shù)，適用于白酒中常規(guī)化合物的測定，而對于風味物質(zhì)中微量成分則無法準確定性，在胡瑾等[22]的研究中，雖然測定了白酒中多達57種風味物質(zhì)，但未進行酸類物質(zhì)定量檢測。GC×GC/TOFMS可對白酒中上百種成分進行定性，但均未進行準確定量分析，且該類儀器的普及度遠不如常規(guī)的色譜分析。

表4 與已知的白酒中微量物質(zhì)測定方法的比較

2.5 實際樣品檢測

研究采集江蘇無錫市場上3種最常見香型(醬香型、濃香型、清香型)6個不同品牌白酒樣品進行檢測，結(jié)果見表5。6個酒樣中4類風味物質(zhì)均可檢測到，酯類相對含量在55.39%～75.41%，醇類相對含量在0.56%～9.23%，酸類相對含量在22.02%～37.67%，醛類相對含量在0.02%～0.07%。3種不同香型白酒中酯類、醇類和酸類物質(zhì)占比較高，而醛類含量較低。酯類含量在不同香型白酒中差異較大，相較于濃香型和醬香型白酒，清香型酒樣中酯類和酸類的總量最低，醇類和醛類無明顯差異。

濃香型白酒中主要呈香物質(zhì)為酯類和酸類，兩類物質(zhì)占總數(shù)的97%左右，其中己酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸貢獻最大，相對含量高達86%，己酸乙酯是其中占比最高的，其特殊的氣味，賦予濃香型白酒香味，成為影響濃香型白酒風味的主要化合物。清香型白酒中酯類物質(zhì)為主要的呈香成分，占比為67%左右，但低于濃香型白酒中酯類的相對含量74%，其中乙酸乙酯、己酸乙酯、乙酸貢獻最大，相對含量高達70%左右，是清香型白酒的主要風味成分。2種醬香型白酒中酯類物質(zhì)相對含量最高，但占比差異較大，其中樣品5酯類物質(zhì)為55%，樣品6酯類含量為70%，因為“醬香”是由多種風味物質(zhì)共同作用的結(jié)果，該結(jié)果與Liu等[20]的發(fā)現(xiàn)一致。白酒中的醇類不僅能呈香，而且能呈味，在6個酒樣的醇類物質(zhì)中，異戊醇含量最高。白酒中的酸類物質(zhì)能起協(xié)調(diào)風味的作用，也是形成酯的前體物質(zhì)，其中乙酸和己酸的含量相對較高，與李俊剛等[15]的研究結(jié)果一致。

3 結(jié)論

該研究利用氣相色譜質(zhì)譜技術(shù)分析了白酒中4類風味物質(zhì)，建立了一個快速、穩(wěn)定、靈敏的可有效分離4類風味物質(zhì)并準確測定的方法。該方法分離效果好，可在15 min內(nèi)完成白酒中4類風味物質(zhì)的同時測定與定量分析，具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2≥0.998 5，加標回收率在87.8%～107.4%，精密度在2.0%～7.4%，檢出限為0.007～0.070 mg/L。酒樣無需處理，直接進樣，一定程度上消除了操作條件等的變化所引起的誤差，測定結(jié)果干擾少，使白酒樣品的測定更加簡便，因此4類微量物質(zhì)的實測結(jié)果即為最終報告結(jié)果。后期可嘗試將不同預處理方法有機結(jié)合，進一步開展更多風味成分的檢測分析。

表5 實際樣品的檢測結(jié)果