2-羥丙基-β-環(huán)糊精/阿魏酸包合物對熏馬腸中陰溝腸桿菌產(chǎn)酪胺的影響機制

黃亞麗，李亞倬，李蕊婷，于紅紅，盧士玲

（石河子大學食品學院，新疆 石河子 832003）

新疆熏馬腸是一種自然發(fā)酵香腸，具有高蛋白水解活性和較長的成熟期，因此有利于微生物積累生物胺。酪胺是一種廣泛存在于發(fā)酵肉制品中的生物胺[1]，攝入過量可能會引起偏頭痛、惡心、心血管疾病等[2-3]。歐洲食品安全局建議健康人群對酪胺的每日最大攝取量為600 mg，但服用經(jīng)典單胺氧化酶抑制劑的人群每日最多可攝取酪胺6 mg[4]。食品中細菌通過酶解酪氨酸生成酪胺，已知腸桿菌、腸道球菌、乳酸桿菌等細菌在食品發(fā)酵過程中產(chǎn)生酪胺[5-6]。研究人員發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生酪胺的基因由編碼酪氨酸脫羧酶（tyrosine decarboxylase，tdcA）、酪氨酸/酪胺逆向轉(zhuǎn)運體（tyrosine/tyramine antiporter，tyrP）、酪氨酸t(yī)-RNA合成酶（tyrosine t-RNA synthetases，tyrS）和Na＋/H＋逆向轉(zhuǎn)運體（Na＋/H＋antiporter，nhaC）4 個基因組成[7]，nhaC在酪胺生物合成中的作用仍未知[8]。

多酚作為一種抗菌劑具有潛在的應用價值，可提高肉制品的質(zhì)量和安全性[9]。阿魏酸（ferulic acid，F(xiàn)A）是肉桂酸衍生物之一，是一種普遍存在于植物界的酚酸。Lemos等[10]證實，F(xiàn)A可以破壞蠟樣芽孢桿菌的生物膜結(jié)構(gòu)，從而抑制其生長。但FA水溶性差、光穩(wěn)定性低從而影響其利用率[11]。研究表明包封技術(shù)能夠有效保持多酚穩(wěn)定性和利用率。Kfoury等[12]使用2-羥丙基-β-環(huán)糊精（2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin，HP-β-CD）包埋苯丙烷類化合物，顯著提高了其溶解度和光穩(wěn)定性，分別為未包埋組的14 倍和44 倍。此外，Gong Liang等[13]研究HP-β-CD包埋丁香酚的抗真菌作用模式，發(fā)現(xiàn)包埋能夠提高丁香酚在食品應用中的穩(wěn)定性。然而，目前關(guān)于FA包合物HP-β-CD/FA對熏馬腸產(chǎn)酪胺的抑制作用，及其對產(chǎn)酪胺基因表達影響的研究鮮見報道。

本實驗研究HP-β-CD/FA包合物對陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）L63生長、基因表達和酪胺積累的影響，明確HP-β-CD/FA包合物對新疆熏馬腸中產(chǎn)酪胺途徑機制的影響，以期提高熏馬腸等發(fā)酵肉制品的安全性，為HP-β-CD/FA包合物應用于熏馬腸及其他發(fā)酵肉制品提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

陰溝腸桿菌L63（GenBank登錄號：MW386397）由石河子大學食品學院畜產(chǎn)品加工與安全控制中心實驗室分離。

FA（反-4-羥基-3-甲氧基肉桂酸≥98%） 北京博鰲科技有限公司；HP-β-CD 上海麥克林生化試劑有限公司；丹磺酰氯、甲醇（色譜純） 美國Sigma公司；乙腈（色譜純） 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；腦心浸液（brain heart infusion，BHI）、紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂（violet red bile glucose agar，VRBGA）、甘露醇鹽瓊脂（mannitol salt agar，MSA）和MRS（Man Rogosa Sharpe）瓊脂培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司；TRIzol試劑（MagZolTMReagent） 美國Invitrogen公司；cDNA合成試劑盒 加拿大Applied Biological Materials公司；2×S6 Universal SYBR qPCR Mix 新貝（上海）生物科技有限公司；馬肉、天然腸衣 新疆伊犁市伊卡孜有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Beta 2-8 LD plus冷凍干燥機 德國Christ公司；IX71倒置熒光顯微鏡 日本奧林巴斯株式會社；Nicolet IS10傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR）儀、ND-2000C超微量核酸測定儀 美國賽默飛世爾公司；H1M多功能酶標儀美國伯騰儀器有限公司；PHS-3C pH計 上海儀電有限公司；MX3000P實時熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國安捷倫科技公司；LC-20AT高效液相色譜（high-performance liquid chromatography，HPLC）儀 日本島津制作所；高速冷凍離心機 美國貝克曼公司；T25均質(zhì)機 德國艾卡設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 HP-β-CD/FA包合物和物理混合物的制備

采用Hsu等[14]方法，準確稱取0.58 g FA和4.6 g HP-β-CD分別溶解在10 mL無水乙醇和10 mL蒸餾水中，然后將FA溶液緩慢加入HP-β-CD溶液中，搖床室溫（22～26 ℃）振蕩24 h，將獲得的澄清溶液4 ℃放置12 h。置于-80 ℃冰箱冷凍24 h，真空冷凍干燥12 h獲得固體HP-β-CD/FA包合物。

物理混合物：FA和HP-β-CD按物質(zhì)的量比1∶1置于研缽中研磨2 min，獲得均勻的混合物。

1.3.2 HP-β-CD/FA包合物的表征

1.3.2.1 微觀結(jié)構(gòu)觀察

取少量FA、HP-β-CD、HP-β-CD/FA包合物及其物理混合物分別放置在載玻片上，蒸餾水分散制成懸濁液并將蓋玻片放置在頂部，使用倒置熒光顯微鏡觀察并記錄每個樣品。

1.3.2.2 FT-IR分析

采用溴化鉀壓片法，取FA、HP-β-CD、HP-β-CD/FA包合物及其物理混合物與光譜級溴化鉀混合（2 mg KBr/200 mg樣品），每個樣品粉末研磨5 min，在20 MPa下壓制40 s，以獲得1 mm透明顆粒，置于FT-IR光譜儀中掃描樣品測定紅外光譜吸收曲線。掃描范圍4 000～400 cm-1，分辨率2 cm-1。

1.3.2.3 HP-β-CD/FA包合物和FA最低抑菌濃度的測定

使用微量肉湯稀釋法[15]，采用無菌96 孔板，每孔中加入100 μL BHI肉湯，同時制備質(zhì)量濃度為100 mg/mL的HP-β-CD/FA包合物原液。將100 μL原液添加到第1行每孔中，然后從第1行每孔取100 μL與第2行相應孔中肉湯混合，再從第2行取100 μL與第3行相應孔肉湯混合，依次倍增稀釋至第7行（第7行每孔中取100 μL棄用）。然后每孔中加入100 μL 106CFU/mL菌液，每組3 個復孔。使用僅含菌液培養(yǎng)基、僅含HP-β-CD/FA包合物原液培養(yǎng)基以及不含HP-β-CD/FA包合物和菌液培養(yǎng)基作為對照。96 孔板在37 ℃培養(yǎng)持續(xù)24 h。目測96 孔板孔中肉湯濁度未改變的質(zhì)量濃度為最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）。按相同方法測定FA的MIC。

1.3.2.4 陰溝腸桿菌L63生長量和pH值的測定

制備3 組菌液：L組：培養(yǎng)液中添加酪氨酸；L＋MIC包合物組：培養(yǎng)液中添加酪氨酸和質(zhì)量濃度為MIC的HP-β-CD/FA；L＋FA組：培養(yǎng)液中添加酪氨酸和質(zhì)量濃度為MIC的HP-β-CD/FA包合物中相同質(zhì)量的FA；酪氨酸添加量均為0.2 g/100 mL。每組3 個重復，接入200 μL供試菌液在37 ℃下恒溫培養(yǎng)，每組不添加供試菌作為陰性對照，48 h內(nèi)每4 h采集樣品一次（2 mL），測定OD600nm和pH值。

1.3.3 酪氨酸脫羧酶相關(guān)基因表達量的測定

1.3.3.1 RNA提取和cDNA合成

按照1.3.2.4節(jié)方法制備3 組培養(yǎng)物，接入供試菌后在37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h。根據(jù)于紅紅等[16]的方法激活酪氨酸脫羧酶（tyrosine decarboxylase，TDC）基因簇的轉(zhuǎn)錄，用MagZol試劑法從陰溝腸桿菌L63中提取總RNA。純化的RNA樣品在無RNA酶的水中重浮，分別在260 nm和280 nm波長處測定吸光度，以確定RNA濃度。采用1%瓊脂糖凝膠電泳觀察條帶，以檢測RNA完整性。然后根據(jù)cDNA合成試劑盒進行cDNA的合成。取2 μg符合要求的RNA加入2 μL AccuRT Reaction Mix（4×），加無酶水至終體積為8 μL，42 ℃孵育2 min，去除gDNA后加入2 μL AccuRT Reaction Stopper（5×），隨后加入4 μL 5×All-in-One RT MasterMix和6 μL無酶水，反應終體積20 μL。20 ℃孵育10 min，42 ℃孵育15 min，85 ℃孵育5 min后終止反應，于冰上冷卻。

1.3.3.2 實時熒光定量PCR檢測基因表達

使用表1所列引物通過PCR分析cDNA樣本。以引物對recA-F/recA-R和tuf-F/tuf-R作為參考。反應體系（總體積20 μL）：2×S6 Universal SYBR qPCR Mix 10 μL，上、下游引物各0.4 μL和cDNA模板2 μL，加入無酶水補至20 μL。每次實驗中未加cDNA模板作為陰性對照。根據(jù)公式R＝2?ΔΔCt計算基因相對表達量[17]。

表1 實時熒光定量PCR所用引物Table 1 Primers used for real-time PCR

1.3.4 酪胺質(zhì)量濃度的測定

參考Lu Shiling等[21]的方法并作修改，采用HPLC法測定樣品中的酪胺質(zhì)量濃度。準確稱取酪胺標準品10 mg，加入0.4 mol/L高氯酸溶液定容至5 mL，分別稀釋成質(zhì)量濃度10、20、50、100、200、400 μg/mL的標準溶液備用。按照1.3.2.4節(jié)方法制備3 組菌液樣品，并在48 h內(nèi)每4 h采集2 mL菌液，然后12 000×g離心10 min，取1 mL上清液加入200 μL 2 mol/L NaOH溶液、300 μL飽和NaHCO3溶液和2 mL 5 mg/mL丹磺酰氯溶液，35 ℃暗反應45 min后加入100 μL氨水終止反應，然后乙腈定容至5 mL。過0.22 μm過濾器后進行HPLC分析。檢測條件：Agilent C18柱（4.6 mm×250 mm），柱溫30 ℃，上樣體積20 μL，流動相A超純水、流動相B乙腈；按照黃笠原等[22]的程序進行梯度洗脫。

1.3.5 HP-β-CD/FA包合物對熏馬腸中酪胺積累影響的研究

1.3.5.1 熏馬腸的制備

原料肉去除淋巴、血管、筋膜等組織，優(yōu)質(zhì)瘦肉、肥肉質(zhì)量比80∶20。在肉塊表面噴涂體積分數(shù)75%乙醇溶液灼燒，紫外燈照射30 min滅菌。將原料肉切成邊長1～2 cm塊狀，以肉質(zhì)量計，加入2.0%食鹽、2.0%白糖、0.1%味精、0.2%姜粉、0.1%八角、0.1%胡椒粉、0.15%花椒粉、0.1%五香粉和0.01%亞硝酸鈉充分混勻，再加入1%煙熏液攪拌均勻。4 ℃下腌制1 h，用灌腸機將已調(diào)味的肉粒灌入天然腸衣內(nèi)，灌腸要求飽滿，過程中用牙簽扎孔，保證腸內(nèi)無空氣。

制備5 組熏馬腸：A組：空白；B組：添加質(zhì)量濃度為MIC的HP-β-CD/FA；C組：接種103CFU/mL陰溝腸桿菌L63；D組：接種103CFU/mL陰溝腸桿菌L63和質(zhì)量濃度為MIC的HP-β-CD/FA；E組：接種103CFU/mL陰溝腸桿菌L63和質(zhì)量濃度為MIC的HP-β-CD/FA包合物中相同質(zhì)量的FA。以上菌株接種量均為3%（以熏馬腸質(zhì)量計），每組3 個重復。制作完成后于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中發(fā)酵，分別在0、3、7、14、21、28 d取樣進行指標測定，每個處理平行測定3 次。發(fā)酵條件如表2所示。

表2 熏馬腸的發(fā)酵條件Table 2 Fermentation conditions of smoked horsemeat sausage

1.3.5.2 微生物計數(shù)

在無菌條件下稱取10 g熏馬腸樣品加入90 mL生理鹽水，拍打機拍打20 min直至樣液在無菌生理鹽水中完全渾濁，按照Yu Honghong等[23]的方法采用平板計數(shù)法，連續(xù)稀釋后在選擇培養(yǎng)基上涂布，分別對腸桿菌科、腸球菌、乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）計數(shù)。

1.3.5.3 熏馬腸pH值的測定

采用無菌拍打袋稱取熏馬腸樣品10 g，加入90 mL生理鹽水，拍打機拍打20 min使樣液在無菌生理鹽水中完全渾濁，靜置沉淀后用pH計測定上清液pH值。

1.3.5.4 熏馬腸生物胺質(zhì)量濃度的測定

取5 g熏馬腸樣品加入0.4 mol/mL 20 mL高氯酸溶液后均質(zhì)，于10 ℃、5 000 r/min均質(zhì)10 min，取上清液；再次重復上述操作，將上清液用乙腈定容到50 mL。取1 mL處理好的樣品液按1.3.4節(jié)方法測定酪胺質(zhì)量濃度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實驗均重復3 次，結(jié)果以平均值±標準差表示。使用GraphPad Prism 9.0.0軟件采用單因素方差分析和鄧肯多范圍檢驗進行組間顯著性差異比較，P＜0.05被認為具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 FA、HP-β-CD、HP-β-CD/FA包合物和物理混合物的微觀形貌觀察結(jié)果

經(jīng)冷凍干燥法制備的HP-β-CD/FA包合物外觀為淡粉色粉末，略有FA氣味。如圖1所示，F(xiàn)A為短柱狀晶體，而HP-β-CD呈球形結(jié)構(gòu)；FA和HP-β-CD的物理混合物保留了二者原始形態(tài)，物理混合后沒有發(fā)生形態(tài)變化，表明物理混合僅為疊加；而HP-β-CD/FA包合物的表面形貌與FA和HP-β-CD均不同，呈不規(guī)則塊狀結(jié)構(gòu)且變化明顯，表明包合物形成。Zhong Yuanyuan等[24]也報道了類似結(jié)果，進一步證實HP-β-CD/FA包合物的形成。

圖1 FA（A）、HP-β-CD（B）、物理混合物（C）和HP-β-CD/FA包合物（D）的微觀圖像Fig. 1 Micrographs of FA (A), HP-β-CD (B), physical mixture (C), and HP-β-CD/FA inclusion complex (D)

2.2 FA、HP-β-CD、HP-β-CD/FA包合物和物理混合物的FT-IR分析結(jié)果

如圖2所示，F(xiàn)A在3 436 cm-1處存在O—H鍵的伸縮振動、1 620～1 433 cm-1處存在C—C鍵的伸縮振動[25]；此外，1 691cm-1處為芳香共軛羰基特征峰，804 cm-1和851 cm-1處的銳帶是由FA苯環(huán)上兩個相鄰氫原子引起[26]。HP-β-CD在2 931 cm-1處表現(xiàn)出明顯的C—H伸縮振動吸收峰[27]，在1 155 cm-1和1 033 cm-1處表現(xiàn)出顯著的C—O伸縮振動吸收峰[24]。與單組分相比，物理混合物的FT-IR光譜沒有顯著變化，表現(xiàn)為FA和HP-β-CD特征峰的疊加。然而，HP-β-CD/FA包合物的FT-IR光譜與FA顯著不同，由于羥基數(shù)量改變，HP-β-CD/FA包合物在3 436 cm-1附近的寬峰強度增加[28]，位于FA上1 691、1 620、1 516 cm-1和851 cm-1的特征峰發(fā)生位移且強度減小，而位于1 433 cm-1和804 cm-1處的峰則完全被HP-β-CD的峰掩蓋。表明FA成功進入HP-β-CD形成包合物，這與顯微觀察結(jié)果一致。

圖2 FA、HP-β-CD、物理混合物和HP-β-CD/FA包合物FT-IR圖Fig. 2 FT-IR spectra of FA, HP-β-CD, physical mixture and HP-β-CD/FA inclusion complex

2.3 HP-β-CD/FA包合物和FA對陰溝腸桿菌L63的MIC

研究表明FA對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和酵母菌具有較強的抗菌活性[29]，并對一些人體胃腸道菌群表現(xiàn)出強烈的抑制作用，如大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、產(chǎn)氣腸桿菌、銅綠假單胞菌和幽門螺桿菌等[30]。如表3所示，HP-β-CD/FA包合物質(zhì)量濃度不同對供試菌的抑制效果不同。FA對陰溝腸桿菌L63的MIC為0.781 mg/mL。此前，趙利利等[31]報道FA對大腸桿菌和蠟狀芽孢桿菌的MIC分別為0.31 mg/mL和0.63 mg/mL，表明大腸桿菌和蠟狀芽孢桿菌對FA的敏感度要高于陰溝腸桿菌L63。王麗平[32]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)A包合物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和蠟狀芽孢桿菌的MIC分別為1.25、5 mg/mL和2.5 mg/mL。本研究中HP-β-CD/FA包合物對陰溝腸桿菌L63的MIC為3.125 mg/mL。Chan等[33]研究發(fā)現(xiàn)，6 種酚類植物提取物對5 種常見食源性致病菌的MIC范圍在0.31～2.5 mg/mL之間，低于本研究結(jié)果，這可能是因為酚類和供試菌的不同，也可能由于FA被β-CD包埋。

表3 HP-β-CD/FA包合物和FA對陰溝腸桿菌L63的MICTable 3 MICs of HP-β-CD/FA inclusion complex and FA against E. cloacae L63

2.4 HP-β-CD/FA包合物對陰溝腸桿菌L63生長量和pH值的影響

如圖3A所示，供試菌OD600nm為L組＞L＋FA組＞L＋MIC包合物組，說明HP-β-CD/FA包合物對陰溝腸桿菌L63生長有一定的抑制作用。FA包埋后抑制效果更明顯，這可能是因為FA包埋后釋放緩慢，同時在介質(zhì)中擴散性增強[10]。添加HP-β-CD/FA包合物延緩了供試菌的生長期和對數(shù)期，整個時期生長趨勢沒有改變，培養(yǎng)48 h，L＋MIC包合物組OD600nm較L組降低了63.67%，這與Hsu等[14]的研究結(jié)果類似。

如圖3B所示，培養(yǎng)48 h期間，L組pH值逐漸升高，這可能是由于酪氨酸在TDC作用下脫羧產(chǎn)生酪胺；L＋FA和L＋MIC包合物組的pH值先略下降，隨后逐漸升高，這表明初期酸性物質(zhì)的產(chǎn)生速率略高于酪胺的產(chǎn)生速率，與于紅紅等[16]研究結(jié)果一致。L＋FA和L＋MIC包合物組的pH值均低于L組，表明FA和HP-β-CD/FA包合物均抑制了陰溝腸桿菌L63的生長，進而減緩了酪胺積累，添加HP-β-CD/FA包合物的抑制效果更明顯。Hu Yongjin等[34]報道混合發(fā)酵劑培養(yǎng)可快速降低pH值，并抑制酪胺的累積。部分學者認為，快速降低pH值有利于控制生物胺的產(chǎn)生[35]。

圖3 HP-β-CD/FA包合物在48 h內(nèi)對陰溝腸桿菌L63 OD600 nm（A）和pH值（B）的影響Fig. 3 Effects of HP-β-CD/FA inclusion complex on OD600 nm (A) and pH (B) of E. cloacae L63 during 48 h of culture

2.5 HP-β-CD/FA包合物對TDC簇中相關(guān)基因表達的影響

酪胺產(chǎn)生基因的排列順序依次為tyrS、tdcA、tyrP、nhaC[36]。由圖4A可知，與L組相比，添加L＋MIC包合物顯著抑制tdcA和tyrP基因在陰溝腸桿菌L63中的表達。相反，tyrS和nhaC的轉(zhuǎn)錄不受HP-β-CD/FA包合物的調(diào)控。L組中tdcA、tyrP和nhaC表達水平較高，tyrS的轉(zhuǎn)錄未顯著表達。Linares等[37]觀察到在大腸桿菌的TDC基因簇中tyrS表達取決于酸性pH和酪氨酸缺乏，tyrS的過表達不影響tdcA的表達。此外，tdcA和nhaC起始密碼子的上游存在假定的啟動子和終止子[38]，tdcA和tyrP之間沒有假定的啟動子和終止子[39]。這表明tdcA和tyrP的表達可能是獨立的，tyrS和nhaC在酪氨酸脫羧途徑中不是必需的[40]。酪胺由tdcA和tyrP蛋白相互作用形成，tdcA依賴磷酸吡哆醛催化酪氨酸脫羧生成酪胺并釋放CO2[41]；tyrP作為一種特殊的膜逆向轉(zhuǎn)運蛋白，不僅促進酪氨酸的攝取和酪胺的釋放，還可以在沒有酪胺交換的情況下將酪氨酸轉(zhuǎn)運到細胞中，但速率較慢[18]。本研究中，與FA相比，HP-β-CD/FA包合物較FA更顯著地抑制了陰溝腸桿菌L63中tdcA和tyrP的表達。通過降低pH值，HP-β-CD/FA包合物也可以間接影響tdcA和tyrp基因的轉(zhuǎn)錄表達，從而減少酪胺積累。

圖4 HP-β-CD/FA包合物對陰溝腸桿菌L63中TDC相關(guān)基因表達（A）和酪胺積累（B）的影響Fig. 4 Effects of HP-β-CD/FA inclusion complex on the expression of TDC-related genes (A) and tyramine accumulation (B) in E. cloacae L63

2.6 HP-β-CD/FA包合物對陰溝腸桿菌L63酪胺積累的影響

如圖4B所示，在8～20 h，酪胺質(zhì)量濃度明顯增加；穩(wěn)定期酪胺積累速率明顯減慢，質(zhì)量濃度逐漸趨于穩(wěn)定，48 h時L組中酪胺質(zhì)量濃度為471.414 μg/mL。Zhang Qiuqin等[9]證明玫瑰多酚可抑制生物胺的形成和細菌腐敗生長。于紅紅等[16]報道百里香微膠囊可以抑制摩根氏菌ND和變形桿菌R3的生長，分別有效減少了61.08%和55.89%的組胺積累。相同培養(yǎng)時間下，L＋MIC包合物組酪胺質(zhì)量濃度明顯低于L＋FA組，這說明FA包埋后抑制效果更好，培養(yǎng)48 h時，與L組相比，L＋MIC包合物組酪胺積累減少了64.46%，優(yōu)于之前研究中添加發(fā)酵劑的抑制效果[42-43]。結(jié)果證實HP-β-CD/FA包合物能顯著抑制陰溝腸桿菌L63的生長和tdcA、tyrP基因的轉(zhuǎn)錄，有效減少酪胺的積累。

2.7 HP-β-CD/FA包合物對熏馬腸中酪胺積累的影響

2.7.1 微生物分析

如表4所示，0～7 d腸球菌和LAB數(shù)量逐漸增加，第14天時略有降低。LAB為整個發(fā)酵期間的優(yōu)勢菌。第28天時，A、D、E組的LAB數(shù)量沒有顯著差異，B組的LAB數(shù)量顯著高于A組（P＜0.05），這說明HP-β-CD/FA包合物對LAB的生長可能有促進作用。此前，Zhao Danyue等[44]研究表明葡萄多酚可以促進LAB的生長。此外，HP-β-CD/FA包合物抑制了腸桿菌科的生長，但沒有表現(xiàn)出明顯的殺菌活性，Lu Shiling等[45]在不同植物提取物對熏馬腸影響的研究中得到了類似結(jié)果。在第28天發(fā)酵成熟時，B、D組中腸桿菌科數(shù)量較A、C組顯著降低，表明HP-β-CD/FA包合物能夠抑制腸桿菌科微生物的生長。D組中腸桿菌科數(shù)量低于E組，表明HP-β-CD/FA包合物對腸桿菌的抑制效果較FA更顯著。HP-β-CD/FA包合物通過干擾細胞膜磷脂，破壞其生物膜結(jié)構(gòu)，導致細胞膜通透性增強，細胞質(zhì)滲出，從而達到抑菌效果[46]。因此，HP-β-CD/FA包合物的高抗菌性能歸因于FA的緩慢釋放和更好的溶解性，使其具有更穩(wěn)定的抑菌作用。

表4 熏馬腸成熟過程中微生物計數(shù)Table 4 Microbial counts during ripening of smoked horsemeat sausage

2.7.2 熏馬腸的pH值

pH值是影響肉制品中生物胺生成的一個重要因素。pH值對細菌污染、酵母菌生長以及發(fā)酵速率有抑制作用[45]。正常情況下，新鮮馬肉的pH值為5.5～6.2。如圖5A所示，5 組熏馬腸的初始pH值在5.32～5.47之間。在0～3 d時pH值迅速下降，這是由于微生物分解碳水化合物為乳酸或發(fā)酵過程中氨基酸脫氨轉(zhuǎn)化為有機酸[47]。在發(fā)酵7 d開始pH值緩慢回升，這可能是因為微生物發(fā)生脫羧或脫氨反應積累生物胺從而抵抗酸性環(huán)境。此外，B、D和E組的pH值低于A、C組，說明加入FA和HP-β-CD/FA包合物均能夠有效降低熏馬腸pH值，抑制腐敗菌生長；此外，D組pH值低于E組，說明FA包埋后的抑制效果較FA更顯著。

圖5 熏馬腸發(fā)酵期間pH值（A）和酪胺質(zhì)量濃度（B）的變化Fig. 5 Changes in pH (A) and tyramine content (B) in smoked horsemeat sausage during fermentation

2.7.3 酪胺質(zhì)量濃度

如圖5B所示，在0～21 d酪胺質(zhì)量濃度明顯增加，第21天時A組和C組中檢測到較高質(zhì)量濃度的酪胺，第28天時略有下降，分別下降至315.94 μg/mL和384.19 μg/mL，這可能是因為熏馬腸中某些微生物產(chǎn)生了生物胺氧化酶，降低了生物胺含量[48]。Zhao Lili等[49]證明，在發(fā)酵和成熟過程中，F(xiàn)A可以減少熏馬肉中32.17%的組胺。薛林林等[50]報道FA分別減少了屎腸球菌和糞腸球菌中19.9%和27%的酪胺積累。第28天時，與C組相比，D組酪胺質(zhì)量濃度減少了63.27%，E組酪胺質(zhì)量濃度僅減少49.61%。這些結(jié)果表明，與FA相比，HP-β-CD/FA包合物在減少酪胺積累方面更有效。Li Lu[42]和Dias[51]等研究不同葡萄球菌和乳桿菌作為發(fā)酵劑對生物胺積累的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)酪胺積累量僅減少了7.45%～29.24%。本研究中，發(fā)酵結(jié)束時B組酪胺積累量較A組減少74.34%。HP-β-CD/FA包合物抑制產(chǎn)酪胺相關(guān)基因以及tdcA和tyrP表達的細菌生長，從而減少酪胺形成。因此，添加HP-β-CD/FA包合物是抑制腐敗菌（腸桿菌科）生長和減少酪胺積累的有效途徑，有助于提高熏馬腸的安全性。

3 結(jié) 論

添加HP-β-CD/FA包合物抑制腸桿菌效果好于FA，能夠明顯降低pH值，減少酪胺含量，以及TDC基因簇的表達。在純菌體系中HP-β-CD/FA包合物對tyrS和nhaC基因表達影響不顯著，但能顯著抑制tdcA和tyrP基因的轉(zhuǎn)錄。在熏馬腸中添加HP-β-CD/FA包合物能降低pH值，減少酪胺積累，添加MIC HP-β-CD/FA包合物與空白對照組相比酪胺積累減少74.34%。總之，HP-β-CD/FA包合物能夠有效抑制酪胺積累和tdcA和tyrP基因表達，本實驗可為提高傳統(tǒng)新疆熏馬腸和其他發(fā)酵肉制品的安全性提供一定理論依據(jù)。