基于蛋白質(zhì)組學(xué)探究西蘭花抗氧化系統(tǒng)對(duì)高氧脅迫的響應(yīng)機(jī)制

張玉笑，陳 穎，郭衍銀，馬陽(yáng)歷，楊 梅，付瑞青，孫玉芃

（山東理工大學(xué)農(nóng)業(yè)工程與食品科學(xué)學(xué)院，山東 淄博 255049）

西蘭花含有豐富的抗氧化物質(zhì)，如硫代葡萄糖苷（glucosinolate，GLS）、抗壞血酸（ascorbic acid，AsA）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）等[1]。GLS是目前發(fā)現(xiàn)抗癌能力最強(qiáng)的異硫氰酸酯類[2]。AsA、GSH形成的AsA-GSH循環(huán)在機(jī)體抵御外界脅迫、平衡氧化還原環(huán)境、延緩衰老等方面均發(fā)揮重要作用[3]。同時(shí)，西蘭花中還含有大量的酚類物質(zhì)、類黃酮和花色苷等，對(duì)于清除機(jī)體自由基、抑制細(xì)胞癌變和腫瘤發(fā)生均具有重要作用[1]。

西蘭花采后極易衰老，常溫下貯藏2～3 d便會(huì)因嚴(yán)重黃化而喪失商品價(jià)值。研究表明，西蘭花黃化衰老與抗氧化物質(zhì)代謝有直接關(guān)系[4]。因此，維持抗氧化系統(tǒng)的穩(wěn)定對(duì)延緩西蘭花采后衰老至關(guān)重要[5]。但西蘭花保鮮研究大多局限于個(gè)別抗氧化酶及抗氧化物質(zhì)的分析，很少通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)整體分析西蘭花抗氧化系統(tǒng)應(yīng)對(duì)逆境的響應(yīng)機(jī)制。

目前，針對(duì)CO2處理的保鮮研究較為廣泛[6]，而關(guān)于高氧脅迫與抗氧化代謝之間的關(guān)系少有研究。前期研究發(fā)現(xiàn)，40% O2處理加速了西蘭花黃化衰老[6]，但具體機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

蛋白質(zhì)組學(xué)是一種在分子水平上檢測(cè)生物體全部蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能和含量的高效分析技術(shù)，已成功應(yīng)用于多種果蔬貯藏期間品質(zhì)變化機(jī)制的研究。本實(shí)驗(yàn)以西蘭花為材料，通過(guò)同位素相對(duì)與絕對(duì)定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)結(jié)合相應(yīng)生理生化指標(biāo)，系統(tǒng)揭示高氧脅迫下西蘭花抗氧化物質(zhì)和抗氧化酶在蛋白水平上的代謝變化及其響應(yīng)機(jī)制，為高氧脅迫調(diào)控措施的制定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘優(yōu)秀’（Brassica oleraceaL. var.italica）西蘭花采自山東省濰坊市劉家茅坨村，選取花球直徑12～14 cm、色澤一致、無(wú)機(jī)械傷和病蟲(chóng)害的西蘭花作為實(shí)驗(yàn)樣品。

8-plex試劑盒 美國(guó)Applied Biosystems公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、二甲基亞砜、三氯乙酸、三羥甲基氨基甲烷、尿素、碘乙酰胺 美國(guó)Sigma公司；胰蛋白酶（2 500 U/mg） 上海普洛麥格生物產(chǎn)品有限公司；乙腈 美國(guó)Thermo Fisher公司；還原型GSH試劑盒、偏磷酸、醋酸、2,4-二硝基苯肼（2,4-dinitrophenylhydrazine，DNPH）、2,6-二氯酚靛酚、福林-酚 北京索萊寶科技有限公司；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1750型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津有限公司；FA1204B型分析天平 上海賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；5810/5810R冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；DDS-307A電導(dǎo)率儀 上海精密科學(xué)儀器有限公司；DW-HL218超低溫冰箱 合肥中科美菱低溫科技有限公司；CR-400全自動(dòng)測(cè)色色差計(jì) 日本Konica Minolta公司；1260半制備型液相色譜儀 美國(guó)Agilent公司；Triple TOF 5600 plus串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)Sciex公司；Nano LC-Ultra 1Dplus液相色譜儀 美國(guó)Eksigent公司；氣調(diào)箱（80 cm×40 cm×30 cm） 山東大有泡塑股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 采后西蘭花預(yù)處理

采收后的西蘭花在4 ℃下預(yù)冷3 h后隨機(jī)分成3 個(gè)處理組，每組24 個(gè)。將3 組西蘭花分別置于氣調(diào)箱內(nèi)，并轉(zhuǎn)移到（20.0±0.5）℃的冷庫(kù)內(nèi)，分別持續(xù)充入5%（體積分?jǐn)?shù)，下同）O2＋5% CO2、20% O2＋5% CO2和40% O2＋5% CO2的混合氣體，以N2為平衡氣體。貯藏期間每天取樣，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測(cè)定，并將0 d和4 d時(shí)的西蘭花樣品用液氮冷凍后存放在-80 ℃冰箱內(nèi)，用于蛋白質(zhì)組學(xué)分析。

1.3.2 生理指標(biāo)測(cè)定

1.3.2.1 色度測(cè)定

色度值（a*、b*和H值）使用CR-400全自動(dòng)測(cè)色色差計(jì)測(cè)定，每組選取3 個(gè)西蘭花，在花球邊緣位置選取5 個(gè)等距位置進(jìn)行測(cè)定，記錄a*和b*值。當(dāng)a*＞0且b*＞0時(shí)，H值計(jì)算如公式（1）所示；當(dāng)a*＜0且b*＞0時(shí)，H值計(jì)算如公式（2）所示。

1.3.2.2 AsA含量測(cè)定

AsA含量采用DNPH比色法[6]測(cè)定。結(jié)果以鮮樣品質(zhì)量計(jì)，單位為g/kg。

1.3.2.3 GSH含量測(cè)定

GSH含量通過(guò)還原型GSH試劑盒測(cè)定。取1 g西蘭花樣品，加入5 mL 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）研磨成漿，隨后在4 ℃、10 000 r/min條件下離心15 min，取上清液后按照還原型GSH試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定GSH含量。

1.3.2.4 GLS含量測(cè)定

GLS含量測(cè)定參考Miao Huiying等[2]的方法并略作修改。取0.5 g西蘭花樣品，用5 mL體積分?jǐn)?shù)90%甲醇溶液提取后，室溫靜置1 h。隨后在12 000 r/min條件下離心20 min，收集上清液用于GLS含量測(cè)定。采用苯酚硫酸法測(cè)定葡萄糖含量，并通過(guò)葡萄糖含量計(jì)算樣品中GLS含量，單位為mmol/kg。

1.3.2.5 多酚和類黃酮含量測(cè)定

多酚含量采用福林-酚法[7]測(cè)定；類黃酮含量參照Li Shiping等[8]方法測(cè)定。

1.3.3 蛋白質(zhì)組學(xué)分析

1.3.3.1 蛋白質(zhì)提取

將西蘭花樣品冷凍干燥后，取3 g樣品加入5 mL裂解緩沖液（pH 7.6，內(nèi)含1 mmol DTT和質(zhì)量濃度0.04 mg/mL SDS）裂解蛋白，120 W超聲處理15 min后，15 000 r/min離心20 min。向上清液中加入5 倍體積的10%（體積分?jǐn)?shù)，下同）三氯乙酸溶液，再次離心后收集沉淀。使用預(yù)冷丙酮洗滌兩次沉淀后，向蛋白質(zhì)沉淀中加入0.5 mL Tris-HCl緩沖液（pH 8.0，內(nèi)含8 mol/L尿素），振蕩至完全溶解。再加入0.2 mL DTT溶液（內(nèi)含50 mmol/L DTT和8 mol/L尿素），37 ℃水浴1 h。隨后加入0.1 mL 50 mmol/L碘乙酰胺溶液，靜置1 h后15 000 r/min離心20 min，上清液即為蛋白提取液。按照Bradford[9]的方法測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度。

1.3.3.2 iTRAQ標(biāo)記和多肽分離

在蛋白溶液中按照蛋白質(zhì)與酶質(zhì)量比30∶1加入胰蛋白酶，37 ℃酶解4 h，立即加入2 μL 0.2%三氟乙酸來(lái)終止酶解。通過(guò)固相萃取柱Sep-Pak C18進(jìn)行脫鹽后，將多肽經(jīng)離心濃縮儀脫水干燥。通過(guò)8-plex試劑盒對(duì)酶解后的肽段進(jìn)行iTRAQ標(biāo)記。標(biāo)記后的多肽使用1260半制備型高效液相色譜儀進(jìn)行分離，最終合并成20 個(gè)組分。色譜柱為Tech Mate C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）。流動(dòng)相A為20 mmol/L甲氨酸溶液（氨水調(diào)pH值至10），流動(dòng)相B為20 mmol/L甲氨酸-乙腈溶液；進(jìn)樣量為100 μL；流速為0.2 mL/min；柱溫為25 ℃；運(yùn)行時(shí)間為60 min；檢測(cè)波長(zhǎng)為216 nm。

1.3.3.3 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析

通過(guò)四極桿飛行時(shí)間液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)樣品進(jìn)行液相色譜-二級(jí)質(zhì)譜分析。色譜柱為Eksigent C18（75 μm×150 mm，3 μm）。流動(dòng)相A為含0.1%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸和3%（體積分?jǐn)?shù)）二甲基亞砜的水溶液，流動(dòng)相B為含0.1%甲酸和3%二甲基亞砜的乙腈溶液。洗脫梯度為0 min，5% B；0～65 min，5%～23% B；65～85 min，23%～52% B；85～86 min，52%～80% B；86～90 min，80% B；90～90.1 min，80%～5% B；90.1～100 min，5% B，流速為300 nL/min。

按照質(zhì)譜數(shù)據(jù)依賴型掃描模式掃描，每個(gè)掃描循環(huán)中包含1 個(gè)MS全掃描（質(zhì)量掃描范圍為m/z350～1 500，離子累積時(shí)間為250 ms）和40 個(gè)MS/MS掃描（質(zhì)量掃描范圍為m/z100～1 500，離子累積時(shí)間為50 ms）。

1.3.3.4 生物信息學(xué)分析

差異表達(dá)蛋白的篩選以表達(dá)差異倍數(shù)≥1.20或≤0.83為標(biāo)準(zhǔn)。鑒定后的差異表達(dá)蛋白通過(guò)Genome蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.rosaceae.org/node/355）進(jìn)行基因本體論（gene ontology，GO）注釋。通過(guò)同源蛋白簇（clusters of orthologous groups，COG）數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/）和京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.genome.jp/kegg/）對(duì)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行注釋和分類。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

生理指標(biāo)或蛋白質(zhì)組學(xué)分析中所有樣品的測(cè)定均重復(fù)3 次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS Statistics 26軟件，通過(guò)單因素方差分析進(jìn)行Duncan多重檢驗(yàn)（以P＜0.05表示差異顯著）。

2 結(jié)果與分析

2.1 高氧脅迫對(duì)西蘭花的生理指標(biāo)的影響

2.1.1 高氧脅迫對(duì)西蘭花色度的影響

黃化是西蘭花品質(zhì)劣變的重要表觀評(píng)價(jià)指標(biāo)，而色度值能直接反映出西蘭花的顏色變化。b*值代表黃藍(lán)度，其越高顏色越黃。H值代表色相，其與成熟度成反比。如圖1A、B所示，西蘭花的b*值和H值在整體上分別呈上升和先上升后下降的趨勢(shì)，且40% O2＋5% CO2處理維持了更高的b*值和更低的H值。貯藏4 d時(shí)，40% O2＋5% CO2處理西蘭花的b*值比5% O2＋5% CO2和20% O2＋5% CO2處理分別增加70.86%和15.14%，這說(shuō)明高氧脅迫顯著加劇了西蘭花黃化。

圖1 不同氧氣體積分?jǐn)?shù)對(duì)西蘭花b*值（A）和H值（B）的影響Fig. 1 Effects of different O2 concentrations on b* (A) and H (B) values of broccoli heads

2.1.2 高氧脅迫對(duì)西蘭花抗氧化物質(zhì)含量的影響

西蘭花抗氧化物質(zhì)的降解，既反映了自身自由基清除能力的降低，又反映了其營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的損失。貯藏期間，西蘭花GLS、AsA含量和GSH含量均呈下降趨勢(shì)，且40% O2＋5% CO2處理組的GLS、AsA含量和GSH含量明顯低于5% O2＋5% CO2處理組和20% O2＋5% CO2處理組（圖2A～C）。40% O2＋5% CO2處理組西蘭花GLS、AsA和GSH含量在4 d時(shí)僅分別為5% O2＋5% CO2處理組的62.20%、60.32%和79.91%，這表明高氧脅迫嚴(yán)重加劇了西蘭花抗氧化物質(zhì)的降解，并降低了西蘭花對(duì)脅迫的抵御能力。

圖2 不同氧氣體積分?jǐn)?shù)對(duì)西蘭花GLS（A）、AsA（B）、GSH（C）、多酚（D）和類黃酮（E）含量的影響Fig. 2 Effects of different O2 concentrations on the contents of GLS (A),AsA (B), GSH (C), polyphenols (D) and flavonoids (E) in broccoli heads

各組西蘭花的多酚含量和類黃酮含量均呈先升高后降低的趨勢(shì)（圖2D、E）。在貯藏1 d時(shí)，40% O2＋5% CO2處理的西蘭花多酚含量和類黃酮含量顯著高于低O2處理組（P＜0.05），2 d后迅速降低，貯藏結(jié)束時(shí)則顯著低于5% O2＋5% CO2處理組（P＜0.05），這可能與高氧脅迫在貯藏前期激活了西蘭花中多酚和類黃酮的生物合成途徑有關(guān)。

綜上所述，高氧脅迫加速了西蘭花的黃化和抗氧化物質(zhì)的整體降解，嚴(yán)重降低了西蘭花的抗氧化能力。另外研究發(fā)現(xiàn)，在貯藏4 d時(shí)西蘭花的色度值與抗氧化物質(zhì)含量均發(fā)生了較為明顯的變化，尤其是40% O2＋5% CO2處理組。因此，選擇貯藏0 d與4 d時(shí)各處理的西蘭花樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，進(jìn)一步探究高氧脅迫下西蘭花抗氧化系統(tǒng)變化及其響應(yīng)機(jī)制。

2.2 蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果

通過(guò)西蘭花iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)分析共鑒定了7 000 個(gè)可信蛋白質(zhì)（至少含有一個(gè)特異性肽段，且在99%置信區(qū)間上的蛋白評(píng)分≥20），以貯藏0 d時(shí)的西蘭花為相對(duì)定量參照標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)貯藏4 d后各組西蘭花中的蛋白質(zhì)以表達(dá)差異倍數(shù)≥1.2（或≤0.83）為標(biāo)準(zhǔn)篩選（P＜0.05），共獲得1 523 個(gè)差異表達(dá)蛋白。為了有針對(duì)性分析高氧脅迫下西蘭花抗氧化系統(tǒng)變化，通過(guò)已有文獻(xiàn)結(jié)果結(jié)合KEGG通路分析，對(duì)與抗氧化系統(tǒng)相關(guān)的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行進(jìn)一步篩選，共篩選出76 個(gè)差異表達(dá)蛋白，涉及到AsA-GSH循環(huán)、GLS、多酚及類黃酮、抗氧化酶代謝、其他抗氧化物質(zhì)（包括葉酸、核黃素、類胡蘿卜素等）等通路（表1）。

表1 不同處理組間抗氧化系統(tǒng)中差異表達(dá)蛋白的詳細(xì)信息Table 1 Detailed information of differentially expressed proteins related to antioxidant system between different treatments

續(xù)表1

如圖3A所示，各比較組中上調(diào)差異表達(dá)蛋白數(shù)量遠(yuǎn)多于下調(diào)差異表達(dá)蛋白數(shù)量，且40% O2＋5% CO2處理4 d/0 d的差異表達(dá)蛋白數(shù)量遠(yuǎn)多于其他兩個(gè)處理組，表明在高氧脅迫下西蘭花內(nèi)更多差異表達(dá)蛋白的表達(dá)被激活。維恩圖分析結(jié)果表明，31 個(gè)蛋白僅在40% O2＋5% CO2處理組中存在差異表達(dá)，而在5% O2＋5% CO2處理組和20% O2＋5% CO2處理組中未出現(xiàn)差異表達(dá)（圖3B），這說(shuō)明高氧處理可能通過(guò)調(diào)控這些抗氧化蛋白的表達(dá)，進(jìn)而加速西蘭花黃化衰老。

圖3 差異表達(dá)蛋白質(zhì)上調(diào)/下調(diào)情況（A）與維恩圖（B）Fig. 3 Numbers of up-regulated and down-regulated differentially expressed proteins (A) and Veen plot (B)

2.3 生物信息學(xué)分析

2.3.1 GO注釋分析

為了進(jìn)一步了解西蘭花在高氧脅迫下差異表達(dá)蛋白的生物學(xué)功能，對(duì)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行了GO注釋分析，從分子功能、細(xì)胞成分和生物學(xué)過(guò)程方面進(jìn)行富集分析，結(jié)果如圖4所示。在分子功能方面，不同O2處理下的西蘭花差異表達(dá)蛋白主要體現(xiàn)在催化活性、結(jié)合以及抗氧化活性等；細(xì)胞成分方面主要定位在細(xì)胞、細(xì)胞組分、細(xì)胞器和膜等；參與調(diào)控的生物學(xué)過(guò)程主要包括代謝過(guò)程、細(xì)胞過(guò)程以及應(yīng)激反應(yīng)等。另外，在幾乎所有GO分析類別中，40% O2＋5% CO2處理下西蘭花的差異表達(dá)蛋白數(shù)量都遠(yuǎn)多于5% O2＋5% CO2處理組和20% O2＋5% CO2處理組，這也證明高氧脅迫對(duì)這些抗氧化系統(tǒng)相關(guān)蛋白的調(diào)控很可能與西蘭花黃化與衰老有關(guān)。各類別中，5% O2＋5% CO2處理組的差異表達(dá)蛋白同樣略少于20% O2＋5% CO2處理組，表明西蘭花貯藏期間的抗氧化系統(tǒng)差異表達(dá)蛋白的表達(dá)水平隨著O2體積分?jǐn)?shù)的增加而增加。

圖4 西蘭花響應(yīng)O2脅迫差異表達(dá)蛋白GO分析Fig. 4 GO analysis of differentially expressed proteins of broccoli in response to O2 stress

2.3.2 COG分析

COG富集分析結(jié)果表明，西蘭花響應(yīng)O2脅迫的差異表達(dá)蛋白涉及了15 類COG功能（圖5）。其主要參與了碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、次生代謝產(chǎn)物生物合成、運(yùn)輸和分解代謝、翻譯后修飾、蛋白轉(zhuǎn)換和分子伴侶、一般功能預(yù)測(cè)和無(wú)機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝。在這些COG功能類別中，40% O2＋5% CO2處理組的西蘭花差異表達(dá)蛋白數(shù)量遠(yuǎn)超過(guò)低O2處理組，這說(shuō)明西蘭花響應(yīng)高氧脅迫下抗氧化代謝的差異表達(dá)蛋白參與了更多的生理代謝途徑，同時(shí)也證明這些主要的功能途徑與西蘭花抗氧化系統(tǒng)的調(diào)控具有互作關(guān)系。

圖5 西蘭花響應(yīng)O2脅迫差異表達(dá)蛋白的COG分析Fig. 5 COG analysis of differentially expressed proteins of broccoli in response to O2 stress

3 討 論

有研究發(fā)現(xiàn)，高氧脅迫可影響西蘭花抗氧化酶、抗氧化物質(zhì)代謝等相關(guān)生物學(xué)過(guò)程[6,10-11]。本研究通過(guò)生理生化指標(biāo)分析結(jié)合iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)，綜合分析了高氧脅迫下西蘭花抗氧化物質(zhì)含量并量化了響應(yīng)高氧脅迫的蛋白質(zhì)，通過(guò)KEGG通路分析篩選出76 個(gè)與抗氧化代謝相關(guān)的差異表達(dá)蛋白。在KEGG通路分析的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步分析與AsA-GSH循環(huán)、GLS代謝、多酚和類黃酮代謝、抗氧化酶代謝及其他抗氧化物質(zhì)代謝等代謝通路相關(guān)的差異表達(dá)蛋白（表1），旨在揭示高氧脅迫破壞西蘭花抗氧化系統(tǒng)機(jī)理，為進(jìn)一步研究高O2脅迫的調(diào)控措施提供理論依據(jù)。

3.1 與AsA-GSH循環(huán)相關(guān)的差異表達(dá)蛋白

AsA-GSH循環(huán)是植物體清除自由基、緩解氧化損傷的重要代謝途徑[12]。GR、MDAR、APX和GPX是維持AsA-GSH循環(huán)的主要酶[13]。APX和GPX不僅是植物體內(nèi)重要的抗氧化酶，同時(shí)在AsA-GSH循環(huán)中重新合成脫氫抗壞血酸和氧化型GSH起到不可替代的作用[14]。蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明，相比于5% O2＋5% CO2處理組和20% O2＋5% CO2處理組，40% O2＋5% CO2處理組上調(diào)了GR和MDAR的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)了APX和GPX的表達(dá)，表明脫氫抗壞血酸和氧化型GSH的合成能力降低，進(jìn)而影響到AsA-GSH循環(huán)的順利進(jìn)行（表1）。GGT、OXP會(huì)導(dǎo)致植物體GSH降解，40% O2＋5% CO2處理同時(shí)上調(diào)了GGT和OXP的表達(dá)，表明高氧脅迫促進(jìn)了西蘭花GSH的降解，這與圖2C中GSH含量降低的結(jié)果相印證。因此，高氧脅迫下APX和GPX下調(diào)與GGT和OXP上調(diào)影響了西蘭花的AsA-GSH循環(huán)，進(jìn)而加速了西蘭花抗氧化能力的下降。有研究發(fā)現(xiàn)，外源AsA和GSH處理能改善西蘭花的抗氧化能力，并延緩西蘭花的黃化衰老[15-16]，因此外源添加AsA和GSH可以作為緩解高O2脅迫破壞西蘭花AsAGSH循環(huán)的有效措施。

3.2 與GLS代謝相關(guān)的差異表達(dá)蛋白

在西蘭花中含有極其豐富的GLS，尤其是蘿卜硫素，是西蘭花重要的抗氧化物質(zhì)。MYS是已發(fā)現(xiàn)的一類最重要的GLS降解酶，在GLS降解中發(fā)揮著不可替代的作用[17]。高氧脅迫下，本研究共鑒定出16 種差異表達(dá)MYS，且40% O2＋5% CO2處理組中16 種MYS的表達(dá)均被上調(diào)，進(jìn)而促進(jìn)了西蘭花GLS降解，圖2A的結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)，而MYS表達(dá)上調(diào)可能是促進(jìn)西蘭花黃化衰老的重要原因。

3.3 多酚和類黃酮代謝相關(guān)的差異表達(dá)蛋白

莽草酸途徑及苯丙烷類代謝途徑是調(diào)節(jié)植物體碳流量的重要途徑，也是多酚、類黃酮、類胡蘿卜素、葉酸等次級(jí)代謝產(chǎn)物合成的關(guān)鍵途徑[18]。4CL、CCR和CAD是多酚和木質(zhì)素合成的關(guān)鍵酶，而C4H和CHS是類黃酮合成的限速酶[19-20]。在40% O2＋5% CO2處理組中，以上蛋白質(zhì)的表達(dá)幾乎均被上調(diào)，這可能是貯藏初期40%O2＋5% CO2處理組的多酚和類黃酮含量高于其他處理組的原因（圖2D、E）。

SDH是莽草酸途徑唯一的雙功能酶，負(fù)責(zé)催化莽草酸和沒(méi)食子酸合成；而FLS是黃酮醇合成的關(guān)鍵酶[21-22]。蛋白組學(xué)結(jié)果表明，40% O2＋5% CO2處理組與5% O2＋5% CO2處理組SDH和FLS的表達(dá)差異倍數(shù)分別是0.77 倍和0.83 倍，表明高氧脅迫下調(diào)了西蘭花的莽草酸合成。莽草酸是多酚和類黃酮合成的關(guān)鍵前體物質(zhì)，莽草酸和黃酮醇合成減少可能是高氧脅迫下西蘭花貯藏后期多酚和類黃酮含量過(guò)低的主要原因（圖2D、E）。

3.4 與抗氧化酶代謝相關(guān)的差異表達(dá)蛋白

SOD、CAT、TrxR、APX和GPX等是植物體內(nèi)重要的抗氧化酶，負(fù)責(zé)體內(nèi)超氧陰離子、自由基、H2O2等活性氧的清除，以保護(hù)細(xì)胞器不受氧化損傷。蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果顯示，相比于5% O2＋5% CO2處理組，40% O2＋5% CO2處理組SOD、TrxR、APX和GPX表達(dá)下調(diào)，同時(shí)上調(diào)了CAT的表達(dá)，這說(shuō)明高氧脅迫在整體上削弱了西蘭花體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)。前期研究發(fā)現(xiàn)，適宜濃度的高H2O2反而可以通過(guò)下調(diào)葉綠素降解酶的基因表達(dá)而延緩西蘭花黃化[6,23]。因此，SOD活力降低以及CAT活力增加減少了西蘭花H2O2的積累，反而可能是造成西蘭花黃化和品質(zhì)降低的一個(gè)重要原因[24-25]。

3.5 與其他抗氧化物質(zhì)代謝相關(guān)的差異表達(dá)蛋白

類胡蘿卜素是西蘭花內(nèi)主要的抗氧化物質(zhì)，在葉綠體中起到保護(hù)葉綠素不被降解的作用，但同時(shí)也是一類導(dǎo)致西蘭花黃化的主要呈色色素[26]。PIM、LUT5和玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶（zeaxanthin epoxidase，ZEP）參與了類胡蘿卜素合成途徑的調(diào)控[27-28]。蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果表明，40% O2＋5% CO2處理明顯提高了PIM、LUT5和ZEP的表達(dá)水平，從而促進(jìn)了類胡蘿卜素合成，這可能是高氧脅迫下加速西蘭花黃化的原因之一。HID是異黃酮合成的關(guān)鍵酶，異黃酮是重要的黃色呈色物質(zhì)[29]。40% O2＋5% CO2處理增加了HID的表達(dá)，這可能是高氧脅迫促進(jìn)西蘭花黃化的另一原因。

4 結(jié) 論

本研究通過(guò)生理生化指標(biāo)結(jié)合iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，研究了高氧脅迫下西蘭花貯藏期間的蛋白質(zhì)表達(dá)變化情況，在蛋白質(zhì)水平上探討了西蘭花的抗氧化響應(yīng)機(jī)制。結(jié)果表明，不同O2水平下共有76 個(gè)與抗氧化代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)出現(xiàn)差異表達(dá)。高氧脅迫通過(guò)下調(diào)西蘭花APX、GPX、GGT和OXP表達(dá)抑制了AsA-GSH循環(huán)，通過(guò)下調(diào)16 種MYS表達(dá)促進(jìn)GLS降解，通過(guò)抑制SOD、TrxR、APX和GPX等抗氧化酶活力降低西蘭花的抗氧化能力和貯藏品質(zhì)，通過(guò)上調(diào)類胡蘿卜素及異黃酮的合成促進(jìn)西蘭花黃化。本研究綜合分析了高氧脅迫下西蘭花抗氧化代謝系統(tǒng)的變化情況和應(yīng)對(duì)機(jī)制，可為高氧脅迫緩解措施的制定提供理論依據(jù)。