納米銀和納米氧化鐵對甜瓜白粉病防治研究

董玉昕，鄭植，王文康，王志恒，陳曉峰

（中國農(nóng)業(yè)大學煙臺研究院，山東 煙臺 264670）

甜瓜（Cucumas meloL.）是葫蘆科甜瓜屬作物，作為重要的暢銷水果之一，具有味美香甜、多汁爽口的特點[1]。據(jù)2020年聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織(Food and Agriculture Organization)統(tǒng)計，我國甜瓜年種植面積接近4萬hm2，年總產(chǎn)量3.5萬t，是栽培面積最大、產(chǎn)量最高的國家。由于薄皮甜瓜營養(yǎng)價值高、適用性好、經(jīng)濟效益可觀，有巨大的市場前景和發(fā)展空間[2]。隨著我國甜瓜栽培技術(shù)的發(fā)展，專業(yè)化的種植基地和溫室大棚使甜瓜生產(chǎn)能滿足人們?nèi)找嬖鲩L的需求[3]。甜瓜白粉病是甜瓜的主要病害之一，主要為害葉片，田間病株率一般在5%~20%，嚴重時可達到80%，尤其在生長中后期發(fā)生嚴重，發(fā)病嚴重時，葉片枯萎、蜷縮，光合能力下降、喪失，植株停止生長甚至死亡，嚴重影響甜瓜產(chǎn)量和品質(zhì)[4-5]，給甜瓜生產(chǎn)帶來嚴重威脅。引起甜瓜白粉病的病原菌主要是單囊殼白粉菌（Sphaerotheca fuliginea）和二孢白粉菌（Golovinomyces cichoracearum）。目前生產(chǎn)中主要通過化學農(nóng)藥防治白粉病，但化學農(nóng)藥使用不規(guī)范導致病原菌產(chǎn)生抗藥性，單一成分藥劑防治愈發(fā)困難，同時化學農(nóng)藥的大量使用引發(fā)質(zhì)量安全、環(huán)境污染等一系列問題[6-7]，因而尋找一種新型材料成為植物病害防治中的研究熱點。

納米材料是指三維空間中至少有一維結(jié)構(gòu)特征小于100 nm的物質(zhì)，由于其本身具備的量子尺寸效應、表面界面效應等物理化學特性，在各個領(lǐng)域都表現(xiàn)出重要的研究價值和廣泛的應用前景。從20世紀80年代發(fā)現(xiàn)納米材料后，便因其良好的抑菌能力、不產(chǎn)生耐藥性、安全無污染特性，被廣泛應用于生物、醫(yī)藥、工業(yè)和航空航天等領(lǐng)域[8-9]。近幾年納米技術(shù)已經(jīng)應用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、植物保護和植物營養(yǎng)等領(lǐng)域，成為解決農(nóng)作物病害防治難題的有效工具。納米材料按材質(zhì)可分為金屬納米材料、非金屬納米材料、高分子納米材料和復合納米材料，其中金屬和金屬氧化物納米材料、非金屬氧化物納米材料對病害抑菌效果或減輕病情指數(shù)較為明顯[10-14]。納米材料的抗菌機理主要包括與致病菌代謝酶中的巰基結(jié)合使酶失活；與暴露的細菌細胞壁發(fā)生肽聚糖反應形成可逆復合物，使細菌不能將氧和能量轉(zhuǎn)運進細胞；與致病微生物的DNA結(jié)合，導致DNA結(jié)構(gòu)變性，抑制DNA復制；增加細菌細胞膜通透性，使蛋白質(zhì)變性的同時釋放銀離子[15-18]。納米材料對甜瓜病害有一定的抑制效果，Guo等[19]研究了納米氧化硅對甜瓜白粉病的抑制機理，結(jié)果表明納米氧化硅處理能顯著降低甜瓜白粉病的嚴重度，適宜的施用濃度對甜瓜白粉病防效達到36.2%。王虎軍等[20]報道納米氧化鋅直接抑制病原菌孢子萌發(fā)、減緩菌絲生長，對Trichothecium roseum、Fusarium sulphureum、Alternaria alternate分別引起的甜瓜粉霉病、白霉病、黑斑病均具有明顯的抑制作用，在一定濃度范圍內(nèi)隨著濃度增大抑制作用增強。姚薇等[21]研究發(fā)現(xiàn)，納米銀粒子對尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporium）有較高的抑制作用，200 mg·L-1納米銀抑菌率可達36.08%。

白粉病對甜瓜產(chǎn)量和品質(zhì)的為害極大，納米材料是一種優(yōu)良的抗菌材料，有助于解決化學藥劑防治甜瓜白粉病效果不佳的問題。納米銀具有廣譜抗菌、高效持久、不易產(chǎn)生耐藥性等特點，已經(jīng)在醫(yī)療衛(wèi)生、食品保鮮等領(lǐng)域廣泛應用[22]；Fe作為植物必需的微量元素之一，同時納米氧化鐵具有較高的抗菌潛力，可用作抗病原菌的抗菌劑[23]，國內(nèi)對其報道較為少見。過氧化物酶（peroxidase，POD）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（hydrogen peroxidase，CAT）是植物抗病相關(guān)的抗氧化酶，其活性高低與植物的抗性反應密切相關(guān)，細胞中SOD、POD、CAT 3種保護酶相互協(xié)調(diào)，以防止過多的自由基對細胞造成毒害。POD與CAT催化H2O2分解從而緩解H2O2對植物造成的傷害[24]，POD活性直接反映了植物組織或植物細胞受脅迫的程度。SOD是重要的超氧陰離子清除劑，在細胞受到外界刺激時通過作用線粒體基質(zhì)將超氧陰離子歧化為H2O2，以降低植物體活性氧的傷害。丙二醛（malondialdehyde，MDA）的含量可反映細胞脂質(zhì)過氧化的水平以及生物膜受損傷的程度，是判斷膜脂過氧化作用的一個重要指標[25]。本研究選擇納米銀和納米氧化鐵作為試驗材料，對比不同濃度納米材料的抗菌活性。但是相同組成成分的納米材料在不同濃度下表現(xiàn)出不同的抗菌活性，同時有研究表明過量施用納米金屬材料會對植物產(chǎn)生逆境脅迫，本研究比較了納米銀和納米氧化鐵不同濃度下對甜瓜白粉病抗性影響，同時測定甜瓜葉片POD、SOD、CAT活性和MDA含量，比較了不同濃度納米銀和納米氧化鐵對葉片保護酶活性的影響，以期為納米銀和納米氧化鐵在薄皮甜瓜防治的廣泛應用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以薄皮甜瓜品種“銀豐超甜”為試驗材料，由中國農(nóng)業(yè)大學煙臺研究院提供，該品種易感染白粉病，但對其他真菌病害具有一定抗性。采用溫湯浸種進行催芽。將種子放入55~60℃的溫水中浸種4 h后用0.2%的高錳酸鉀溶液浸種20 min，沖洗干凈后在28~30℃條件下催芽，種子大部分露白即可播種。基質(zhì)采用經(jīng)過消毒的草炭、蛭石、珍珠巖混合基質(zhì)（體積比5∶1∶1），將處理過的種子播入已裝填基質(zhì)的育苗盤中，基質(zhì)覆種1~1.5 cm，澆透水，白天保持溫度28~32℃，夜間保持17~20℃進行發(fā)芽。參考繆學田[26]的方法進行甜瓜栽培管理。于2021年4月10日定植于中國農(nóng)業(yè)大學煙臺研究院試驗田。

納米銀，平均粒徑20 nm，純度99.9%，購自上海攀田粉體材料有限公司。納米氧化鐵，平均粒徑20 nm，99.9%純度，購自廣州金屬冶金有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1Sphaerotheca fuliginea接種液的制備采用山東省海陽市日光溫室內(nèi)自然發(fā)病的網(wǎng)紋甜瓜葉片，經(jīng)光學顯微鏡（XSZ-2）鏡檢確認為單囊殼白粉病Sphaerotheca fuliginea生理小種1，將采集的新鮮病葉樣品用無菌水沖洗表面灰塵，用軟毛刷把病原菌刷入無菌水中，通過血球計數(shù)板鏡檢計數(shù)，配成1×105cfu·mL?1孢子囊懸浮接種液[27]。

1.2.2 試驗處理試驗設(shè)納米銀處理（T1處理）和納米氧化鐵處理（T2處理），其中T1處理共分4個濃度處理，分別為1.25（T1-1）、2.50（T1-2）、5.00（T1-3）、10.00μmol·mL?1（T1-4）；T2處理也分為4個濃度處理，分別為1.25（T2-1）、2.50（T2-2）、5.00（T2-3）、10.00μmol·mL?1（T2-4）。以純水為對照組，每個處理設(shè)置3個重復，每個處理20株。

1.2.3 納米材料的制備、噴施和病原菌的接種配制不同濃度梯度的納米金屬溶液，為防止納米材料在溶液中產(chǎn)生團聚，噴施前需置于超聲波清洗器中超聲30 min。

于甜瓜4葉1心時選取長勢一致的瓜苗，用小型手持噴霧器將納米銀溶液和納米氧化鐵溶液分別對供試幼苗心葉進行噴霧，以葉片濕潤為宜。24 h后將配置好的甜瓜白粉病病原菌接種液噴到展平的甜瓜葉片上，接種后植株置于人工氣候箱中黑暗保濕24 h，然后進行正常的12 h/12 h光暗周期培養(yǎng)，控制溫度范圍為20~25℃，相對濕度控制85%±5%，接種7 d后調(diào)查發(fā)病情況[28-29]。

1.3 測定項目

分別在接種病原菌后0、24、48、72、96 h采集葉片，測定POD、SOD、CAT活性以及MDA含量[30]。

1.4 病情分級標準

接種7 d后待病情充分發(fā)生且穩(wěn)定后調(diào)查病情級數(shù)和病情指數(shù)，分級標準[31]見表1，并按照公式（1）計算病情指數(shù)[32]。

表1 室內(nèi)苗期抗病性鑒定病情分級標準Table 1 Grading criteria for identifying disease resistance of seedlings indoors

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Office Excel 2016，SPSS 26.0對數(shù)據(jù)進行多重比較和顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 納米材料對甜瓜葉片白粉病病情指數(shù)影響

由表2可知，納米銀和納米氧化鐵對甜瓜葉片白粉病均有一定的抑制作用，減少了葉片病情指數(shù)，除T2-1外，所有處理均顯著降低了甜瓜葉片白粉病病情指數(shù)。不同濃度處理導致病情指數(shù)差別明顯，其中，T2-4處理白粉病病情指數(shù)減少最多，比對照減少34.96%；其次為T1-4處理，減少32.52%；然后是T1-3處理，病情指數(shù)減少31.39%；T2-3處理病情指數(shù)減少27.07%。不同濃度的納米材料對甜瓜白粉病的抑制效果有差異，隨著濃度的增加，處理后甜瓜葉片病情指數(shù)均有所降低。T1-4處理甜瓜葉片出現(xiàn)發(fā)黃、萎蔫的情況，可能是由于高濃度納米金屬材料對植物的影響[33]。

表2 納米銀和納米氧化鐵處理后的甜瓜葉片白粉病病情指數(shù)Table 2 Disease index of powdery mildew on melon leaves treated with Nano-silver and Nano-iron oxide

2.2 納米材料對葉片POD活性的影響

由圖1可知，納米銀噴施+病原菌接種處理后，葉片POD活性顯著高于對照，2組處理POD活性呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢。T1-2、T1-3、T1-4處理葉片POD活性在接種24 h后顯著升高，72 h達到峰值，且與對照存在顯著差異（P<0.05）；T1-3處理POD活性始終高于其他處理，接種72 h后，T1-3處理比對照高156.6%；T1-4處理由于較高的納米銀濃度導致葉片出現(xiàn)發(fā)黃、萎蔫現(xiàn)象。由此可知，適宜濃度的納米銀噴施處理能顯著提高甜瓜葉片中的POD活性，但使用高濃度噴施處理，POD提升與較低濃度相比不顯著，會造成一定的毒害作用。

圖1 不同處理下甜瓜葉片的POD活性Fig.1 POD activity of melon leaves under different treatments

納米氧化鐵噴施+病原菌接種處理后，葉片POD活性顯著高于對照，接種24 h后處理組與對照組存在顯著差異（P<0.05）。隨處理時間增加，甜瓜葉片中POD活性均呈現(xiàn)上升趨勢，72 h達到最大值，此時處理組比對照提高了123.0%~160.1%；處理96 h后，對照和處理組葉片POD活性都出現(xiàn)下降趨勢。由試驗結(jié)果可知，濃度為10μmol·mL-1以下的納米氧化鐵噴施處理顯著提高甜瓜葉片POD活性。

2.3 納米材料對葉片SOD活性的影響

由圖2可知，納米銀噴施+病原菌接種處理后，處理組葉片SOD活性整體呈先升后降趨勢，在處理72 h達到頂峰，在96 h出現(xiàn)小幅度下降，對照組呈緩慢上升的趨勢；處理組在24 h以后酶活性顯著高于對照，在處理24~96 h時間段，T1-2、T1-3、T1-4處理組酶活性比對照組增加明顯，T1-3處理72 h酶活性最高，為376.0 U·g-1FW，比對照高99.3%，T1-1處理在72~96 h酶活性與對照相差不大。由此可知，適宜濃度的納米銀噴施處理能顯著提高甜瓜葉片SOD活性，但使用高濃度噴施處理可能會出現(xiàn)抑制效果減弱的情況。

由圖2可知，隨著納米氧化鐵噴施濃度的提高，處理和對照組SOD活性呈現(xiàn)增高趨勢，處理組SOD活性均高于對照，且T2-4處理SOD活性均大于其他處理，T2-4處理在96 h酶活性達到最大值，比對照高85.6%。

圖2 不同處理下甜瓜葉片SOD活性的變化Fig.2 SOD activity of melon leaves under different treatments

隨著處理時間增加，T2比T1處理對酶活性影響大，處理24 h后就始終高于同時間點T1處理。與納米銀處理不同的是，納米氧化鐵處理96 h酶活性依然表現(xiàn)出上升趨勢。試驗說明，納米氧化鐵噴施處理可以顯著提高甜瓜葉片SOD活性，隨濃度增加甜瓜葉片SOD活性呈上升趨勢。

2.4 納米材料對葉片CAT活性的影響

由圖3可知，納米銀噴施處理后甜瓜葉片CAT活性低于對照，且不同處理間葉片的CAT活性隨處理時間整體呈現(xiàn)下降趨勢。處理24 h，T1處理CAT活性較對照出現(xiàn)顯著下降，下降范圍為60.4%~84.2%，由此可知，適宜濃度的納米銀噴施處理長時間作用后能顯著降低甜瓜葉片中的CAT活性，尤其顯著降低接種病原菌初期的CAT活性。

圖3 不同處理下甜瓜葉片CAT活性Fig.3 CAT activity of melon leaves under different treatments

納米氧化鐵噴施處理使得接種病原菌后甜瓜葉片CAT活性呈上升趨勢，在處理96 h后酶活性達到頂峰，其中T2-4處理96 h酶活性最大，為80.4 U·g-1FW，較對照上升117.3%。T2-1、T2-2處理和CK無顯著差異（0~48 h），隨著處理時間增加，T2處理組CAT活性逐漸升高（72~96 h），在96 h處酶活性比對照高39.6%~125.8%。由此可知，在短時間內(nèi)納米氧化鐵處理對甜瓜葉片中的CAT活性影響不大，隨處理時間的增加，CAT活性與處理濃度才呈現(xiàn)一定正相關(guān)性。

2.5 納米材料對葉片MDA含量的影響

由圖4可知，噴施納米銀+病原菌接種處理后隨時間增加，各處理的葉片MDA含量整體呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，且均在接種后72 h達到頂峰，隨后迅速下降，同一處理時間點納米銀噴施處理MDA含量均低于對照，且隨納米銀濃度增加MDA含量下降，各處理間差異不顯著。T1-4處理48 h MDA含量為對照的83.5%，72 h為85.7%。由此可知，白粉病病原菌侵染后葉片MDA含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，噴施納米銀可以降低葉片MDA含量。

圖4 不同處理下甜瓜葉片MDA含量Fig.4 MDA content of melon leaves under different treatments

納米氧化鐵噴施處理后，MDA總體變化趨勢與納米銀處理一致，整體呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，但對照組MDA含量最高點出現(xiàn)在72 h，最大值為3.59 nmol·g-1FW，處理組則出現(xiàn)在48 h，MDA含量為對照的82.3%~100.6%。對照MDA含量在0、24 h處顯著低于處理組，72 h處顯著高于處理組，不同處理間在96 h處差異不顯著。

3 討論

在設(shè)施農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，由于處于密閉環(huán)境中，高溫高濕條件往往會導致作物病害加重[34]。白粉病作為甜瓜的主要病害，多年化學防治后極易導致病原菌產(chǎn)生一定的抗藥性，藥劑防治效果不佳[35]。近些年國內(nèi)外學者對納米材料在植物病害防控方面進行了大量研究，并取得顯著的效果。納米材料可提高植物對病害的抗性原因可能有兩方面，一方面是來自其本身的抗菌性，另一方面是可以誘導植物產(chǎn)生抗病性。Chen等[11]研究發(fā)現(xiàn)，GO/Ag-NPs復合材料的抗菌機理主要表現(xiàn)為物理損傷細胞結(jié)構(gòu)和誘導病原體產(chǎn)生相對活性氧的協(xié)同作用，從而造成菌體死亡。Imada等[36]用MgONP預處理番茄根部顯著抑制青枯病的發(fā)展，推測MgONP誘導了番茄植株對青枯病的抗性。本試驗著重研究納米銀和納米氧化鐵對甜瓜抗白粉病和甜瓜葉片酶活性的影響。

已有研究證明，納米銀具有抑制病原菌的作用，其對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌表現(xiàn)出強烈的殺菌性，可以作為潛在的抗真菌藥劑[37-38]。Ali等[39]報道了納米銀對疫霉菌屬（Phytophthora）100%有效抑制菌絲生長。納米銀的抑菌機理主要存在2種解釋，一種是通過吸附并穿透病菌細胞壁，致使病菌蛋白質(zhì)凝固而喪失分裂能力死亡，另一種是Ag+與周圍的水或空氣作用，產(chǎn)生活性氧物質(zhì)進而攻擊細胞膜，導致細菌死亡[40]。甘林等[41]發(fā)現(xiàn)，納米銀會顯著抑制甘藍黑腐病病原菌（Xanthomonas.campestris pv.campestris）的呼吸強度，抑制細菌生長，這與本研究田間試驗中甜瓜葉片病情指數(shù)隨納米銀濃度增加，病情指數(shù)呈下降趨勢結(jié)果一致。同時，納米銀還具有影響酶活性的作用[42]，納米銀能提高植物體內(nèi)的POD、SOD和可溶性蛋白含量。本研究中不同濃度納米銀處理甜瓜葉片后，甜瓜葉片POD、SOD活性在一定時期內(nèi)顯著升高，同時一定濃度范圍內(nèi)，隨濃度的提高處理酶活性、酶活性增幅更高；經(jīng)納米銀處理后CAT活性低于對照，這與Hu等[43]發(fā)現(xiàn)納米顆粒能引起植物體細胞的氧化脅迫效應一致。本試驗發(fā)現(xiàn)在濃度為10μmol·mL-1時，甜瓜葉片表現(xiàn)出發(fā)黃、萎蔫的情況，有研究[44]表明，高濃度納米金屬材料會抑制植物的蒸騰作用，植物處于逆境脅迫時需要抗氧化酶在一定程度上減輕或抵御脅迫傷害，通過減少過量的活性氧并維持正常的代謝平衡、保護膜結(jié)構(gòu)等。本研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度納米銀噴施處理后，甜瓜葉片MDA含量增幅明顯小于對照，表明在病原菌侵害后，納米銀噴施處理的甜瓜葉片中積累的自由基較少，細胞膜系統(tǒng)受損程度相較于對照要小。納米銀粒子釋放到自然界后是否會造成環(huán)境污染等還需要進一步研究。綜上所述，本研究認為濃度為5μmol·mL-1的納米銀抗甜瓜白粉病效果較優(yōu)。

鐵是植物生長發(fā)育過程中不可缺少的元素之一，具備成為良好無機抑菌材料的條件，Tyagi等[23]研究發(fā)現(xiàn)FeNPs可以作為抗病原體的抗菌劑。在低濃度時納米氧化鐵材料與納米銀對于白粉病病情指數(shù)的影響無差異，高濃度處理時較同濃度納米銀有較好的抗病效果，本研究中納米氧化鐵濃度為10μmol·mL-1的抗病效果較優(yōu)，能顯著降低甜瓜葉片的病情指數(shù)。納米氧化鐵在試驗中尚未表現(xiàn)出使甜瓜葉片發(fā)黃、萎蔫的情況，本研究認為10μmol·mL-1的納米氧化鐵具有較好抗甜瓜白粉病的效果。納米氧化鐵對于植物同樣具有脅迫作用[45]，在試驗中并未表現(xiàn)出脅迫作用，可能是濃度較低并未引起嚴重的脅迫效應。低濃度納米銀和納米氧化鐵對甜瓜葉片病情指數(shù)和酶活性的影響無差異，10μmol·mL-1時納米氧化鐵對甜瓜白粉病的防治效果優(yōu)于同濃度的納米銀。納米氧化鐵處理后，甜瓜葉片POD、CAT活性顯著高于對照，其中納米氧化鐵脅迫產(chǎn)生的氧自由基破壞了植物體細胞功能膜及酶系統(tǒng)，持續(xù)的氧化應激反應促進POD、CAT活性顯著增強；MDA含量先上升，96 h后急速下降，與趙銘等[46]發(fā)現(xiàn)植物體內(nèi)的SOD、POD、CAT聯(lián)合作用清除了植物體內(nèi)過多的活性氧的研究結(jié)果一致。

綜上所述，甜瓜白粉病原菌對于傳統(tǒng)藥劑防治有一定的抗性，防治效果不明顯，而納米銀和納米氧化鐵對于其有較好的防治效果，在植物病害防治應用方面具有良好的前景。同時需要注意的是，高濃度納米銀對植物體有一定的損傷，在實際生產(chǎn)中要合理施用納米銀溶液，按照生產(chǎn)條件和發(fā)病情況靈活施用以降低甜瓜白粉病帶來的經(jīng)濟損失，使甜瓜生產(chǎn)達到最佳的經(jīng)濟效益。