新疆栽培與野生一枝蒿粗多糖對口蹄疫疫苗免疫小鼠的佐劑活性比較

如孜萬古麗·依馬木，張愛蓮*，翁 翔，肖 鵬，曹 輝，吳道澄

(1.新疆大學生命科學與技術學院 新疆生物資源與基因工程重點實驗，室烏魯木齊 830046；2.天康生物股份有限公司，烏魯木齊 830000； 3.西安交通大學生命科學與技術學院，西安 710000)

口蹄疫(food-and-mouth disease，F(xiàn)MD)是嚴重危害動物健康的病毒性疾病。廣泛接種含有油乳劑ISA-206、ISA-201的口蹄疫滅活疫苗(foot-and-mouth disease inactivated vaccine, FMDV)是預防和控制FMD的有效策略。但是，F(xiàn)MDV誘導的細胞免疫反應較弱，且疫苗中的油乳劑伴有較高的毒性，易造成注射部位膿腫、肉芽腫等不良反應[1-2]。因此，研制能夠激發(fā)Th1/Th2免疫應答的高效、低毒新型佐劑對于提高FMDV效力至為關鍵[3]。

中草藥及其活性成分具有良好的免疫調(diào)節(jié)作用，例如菊粉、香菇、黨參、人參等多糖作為流感、COVID-19、艾滋病、乙肝、新城疫及禽流感等疫苗佐劑通過促進樹突狀細胞成熟、促進T/B淋巴細胞增殖及CTL反應等增強體液和細胞免疫反應從而提高疫苗效力。中草藥因其具有低毒性、資源豐富等優(yōu)點而成為了新型疫苗佐劑的候選物[4-5]。同時，中草藥多糖成分也用于FMDV新型佐劑的研究中，例如川明參、馬齒莧等通過有效激活B細胞，促進脾淋巴細胞增殖，誘導CTL反應而提高FMDV效力，并具有良好的安全性[6-7]，在FMD預防中展現(xiàn)出應用的潛力。

新疆一枝蒿(ArtemisiarupestrisL.)為菊科蒿屬植物，主要包括多糖、黃酮、生物堿等化學成分，多糖作為主要免疫活性成分具有抗病毒、抗炎等免疫調(diào)節(jié)作用，毒副作用少，臨床上常應用于流感、過敏、蕁麻疹等疾病的治療[8]。本課題組前期發(fā)現(xiàn)野生一枝蒿水提物作為流感疫苗和FMDV的佐劑可以提高小鼠血清中IgG抗體水平，促進脾中T細胞亞群的增殖及Th1/Th2型細胞因子的分泌[9-10]；栽培一枝蒿粗多糖配伍卵清白蛋白免疫小鼠能增強Th1/Th2反應而表現(xiàn)出良好的佐劑活性[11]。中草藥的免疫調(diào)節(jié)活性受多種因素影響，如種類、來源和提取條件等。一枝蒿的化學成分分析表明，野生和栽培品種均含有黃酮、多糖、生物堿、揮發(fā)油等成分，在野生和栽培品種中這些化學成分的含量有所差異，例如，野生品種黃酮含量高于栽培品種，栽培品種多糖含量高于野生品種[12-13]。由于野生一枝蒿資源稀缺，栽培一枝蒿已經(jīng)成功種植并應用于臨床。為進一步探討栽培一枝蒿粗多糖作為疫苗佐劑的可行性，本試驗通過肌肉途徑免疫ICR小鼠，比較栽培/野生一枝蒿粗多糖(cultivated/wildArtemisiarupestrisL. crude polysaccharides，CARCP/WARCP)作為FMDV佐劑對小鼠體液和細胞免疫的影響，探究CARCP/WARCP的佐劑活性和安全性，為栽培一枝蒿粗多糖作為FMDV新型佐劑的有效開發(fā)利用提供重要的依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料及試劑

CARCP/WARCP(多糖含量分別為32.53%、30.94%)[13]?？谔阋邷缁羁乖?foot-and-mouth disease antigen, FMD-Ag 146S 5.63 μg·mL-1)O3/My098株、ISA-206油乳劑購自天康生物股份有限公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG、IgG1、IgG2a與IgE購自Southbiotech公司；N-四甲基聯(lián)苯胺(Tetramethyl-benzidine, TMB)購自Sigma公司；CD3-PE、CD4-APC、CD8-FITC、CD8-APC、CD44-PE、CD62L-FITC等流式抗體均購自BD公司，其余試劑為國產(chǎn)純試劑。

1.2 動物及免疫分組

雌性ICR小鼠(體重 20～30 g)購于新疆醫(yī)科大學動物實驗中心。30只ICR小鼠隨機分為6組，每組5只，分組如下：1)0.9% NaCl組(空白對照組)；2)FMDV組(146S 0.3 μg·只-1)；3)FMDV/CARCP1組(146S 0.3 μg·只-1，CARCP1 總物質(zhì)150 μg·只-1)；4)FMDV/WARCP1組(146S 0.3 μg·只-1，WARCP1總物質(zhì)150 μg·只-1)；5)FMDV/CARCP2組(146S 0.3 μg·只-1，CARCP2多糖含量150 μg·只-1)；6)FMDV/WARCP2組(146S 0.3 μg·只-1，WARCP2多糖含量150 μg·只-1)。根據(jù)文獻[10]制備疫苗，簡述如下：將FMD-Ag分別與CARCP/WARCP水劑和ISA-206油乳劑乳化制備成水包油包水(W/O/W)疫苗，經(jīng)肌肉途徑，于0、14 d免疫小鼠2次(120 μL·只-1)。

1.3 抗體及亞型水平檢測

ELISA檢測小鼠初次免疫后14～28 d血清中IgG及28 d IgG1和IgG2a水平[10]。簡述如下：FMD-Ag(1 μg·mL-1)包被于96孔板中4 ℃過夜。用含PBST(0.05%吐溫20)洗板后加入5%脫脂奶粉在37 ℃封閉60 min。加入檢測血清(1∶1 000)37 ℃孵育60 min后PBST洗板。加入辣根過氧化物酶標記的IgG、IgG1和IgG2a二抗(1∶10 000)37 ℃孵育60 min。TMB避光顯色10～20 min后終止顯色，酶標儀450 nm檢測吸光度(Optimal density, OD)。

1.4 T細胞亞群檢測

加強免疫后14 d收集各組小鼠脾組織，裂解紅細胞后獲得脾單細胞懸浮液，細胞濃度調(diào)到每毫升1×106個，離心7 min后，分別用CD3-PE/CD4-APC/CD8-FITC、CD4-APC/CD44-PE、CD8-APC/CD44-PE、CD62L-FITC/CD44-PE的熒光抗體進行表面避光染色30 min，終止染色用流式細胞儀檢測，F(xiàn)lowJo軟件進行數(shù)據(jù)分析。

1.5 安全性檢測

CARCP/WARCP免疫后定期稱量初次免疫后0、14、28 d小鼠體重，監(jiān)測臨床癥狀，觀察注射部位反應，并進行初次免疫后28 d血清中IgE水平檢測，進行CARCP/WARCP對小鼠的安全性的初步評價。

1.6 統(tǒng)計學分析

試驗數(shù)據(jù)以“平均值±標準差”展示，統(tǒng)計學分析采用GraphPad Prism 5.0軟件進行單因素方差分析和Tukey’s多重比較，P<0.05表示差異顯著。

2 結 果

2.1 CARCP/WARCP對IgG抗體水平的影響

為了比較CARCP/WARCP對小鼠體液免疫的影響，ELISA檢測初次免疫后14～28 d小鼠血清中FMDV特異性IgG水平，結果如圖1所示，總物質(zhì)量一致時，CARCP1/WARCP1均能極顯著提高初次免疫后14～28 d小鼠血清IgG水平(P<0.01)。在14 和21 d時，CARCP1的增強效果顯著高于WARCP1(P<0.05)，在28 d時CARCP1/WARCP1 IgG水平之間差異不顯著(P>0.05)。多糖含量一致時，在14 d 時，與FMDV相比，CARCP2/WARCP2差異不顯著(P>0.05)，且CARCP2/WARCP2 IgG水平之間差異不顯著(P>0.05)。在21和28 d時，CARCP2/WARCP2均顯著增強了IgG水平(P<0.05)，且CARCP2和WARCP2之間差異不顯著(P>0.05)。

與FMDV相比，*.P<0.05，**.P<0.01，***.P<0.001；CARCP1與WARCP1相比，CARCP2與WARCP2相比，#.P<0.05，ns. P>0.05。下同

2.2 CARCP/WARCP配伍FMDV對抗體亞型的影響

ELISA檢測初次免疫后28 d血清中抗體亞型水平，結果如圖2所示，總物質(zhì)量一致時，與FMDV相比，CARCP1/WARCP1均能顯著提高FMDV特異性IgG1水平(P<0.05)，且CARCP1/WARCP1之間差異不顯著(P>0.05)。CARCP1/WARCP1均能極顯著提高IgG2a水平(P<0.01)，且CARCP1組IgG2a水平高于WARCP1(P<0.05)。CARCP1/WARCP1均能顯著提高IgG2a/IgG1比值(P<0.01)，且CARCP1 IgG2a/IgG1比值顯著高于WARCP1(P<0.05)。多糖含量一致時，CARCP2/WARCP2均能顯著增強IgG2a水平(P<0.05)，極顯著提高IgG2a/IgG1比值(P<0.01)，CARCP2/WARCP2 IgG1水平與FMDV相比差異不顯著(P>0.05)，且CARCP2/WARCP2之間差異不顯著(P>0.05)。

A. 28 d血清中IgG1水平；B. 28 d IgG2a水平；C. IgG2a/IgG1比值

2.3 CARCP/WARCP配伍FMDV免疫對CD3+CD4+和CD3+CD8+T細胞的影響

加強免疫后14 d用流式細胞術檢測小鼠脾T細胞亞群的百分比，結果如圖3所示，總物質(zhì)量一致時，CARCP1/WARCP1均能極顯著促進脾T細胞亞群CD3+CD4+百分比(P<0.01)，顯著促進CD3+CD8+比例(P<0.05)，且CARCP1的增強效果顯著高于WARCP1(P<0.05)。多糖含量一致時，CARCP2/WARCP2對CD3+CD4+和CD3+CD8+T細胞的作用與FMDV相比差異不顯著(P>0.05)，且CARCP2/WARCP2之間差異不顯著(P>0.05)。

A. 脾CD3+CD4+T細胞百分比；B. 脾CD3+CD8+T細胞百分比

2.4 CARCP/WARCP配伍FMDV對CD4+CD44+和CD8+CD44+效應T細胞的影響

加強免疫后14 d，流式細胞術檢測小鼠脾效應T細胞亞群比例結果如圖4所示，總物質(zhì)量一致時，CARCP1/WARCP1均能極顯著提高CD4+CD44+(P<0.01)，顯著提高CD8+CD44+T細胞亞群比例(P<0.05)，且CARCP1增強效果高于WARCP1(P<0.05)。多糖含量一致時，CARCP2/WARCP2均能顯著提高CD4+CD44+比例(P<0.05)，且CARCP2/WARCP2之間差異不顯著(P>0.05)。CARCP2/WARCP2對CD8+CD44+比例與FMDV相比差異不顯著(P>0.05)，且CARCP2/WARCP2之間差異不顯著(P>0.05)。

A. 脾CD4+CD44+效應T細胞百分比；B. 脾CD8+CD44+效應T細胞百分比

2.5 CARCP/WARCP配伍FMDV對記憶T細胞CD8+CD44+CD62L+/CD62L-的影響

加強免疫后14 d小鼠脾記憶T細胞亞群水平檢測結果如圖5所示，總物質(zhì)量一致時，CARCP1/WARCP1均極顯著提高CD8+CD44+CD62L+比例(P<0.01)，顯著增強記憶T細胞CD8+CD44+CD62L-(P<0.05)比例，且CARCP1增強效果顯著高于WARCP1(P<0.05)。多糖含量一致時，CARCP2/WARCP2對CD8+CD44+CD62L-/CD62L+T細胞的作用與FMDV相比差異不顯著(P>0.05)，且CARCP2/WARCP2之間差異不顯著(P>0.05)。

A. 脾CD8+CD44+CD62L-記憶T細胞百分比；B. 脾CD8+CD44+CD62L+記憶T細胞百分比

2.6 CARCP/WARCP配伍FMDV對小鼠的安全性分析

小鼠免疫后每天觀察其臨床癥狀，整個免疫過程中沒有出現(xiàn)皮毛褶皺、肌肉抽搐、呼吸窘迫等癥狀。CARCP/WARCP佐劑FMDV免疫0、14、28 d后，同一時間點各組小鼠體重差異不顯著(圖6A，P>0.05)。初免后28 d，CARCP1/WARCP1配伍FMDV免疫組小鼠IgE抗體之間差異不顯著(P>0.05)。CARCP2/WARCP2之間差異不顯著(圖6B，P>0.05)。

A. 小鼠體重；B. 小鼠血清IgE水平

3 討 論

中草藥多糖作為新型疫苗佐劑在傳染病治療和預防方面具有良好的應用前景[14]。安全有效的佐劑對于FMDV發(fā)揮免疫增強效應具有重要的輔助作用，然而也會伴隨著一些副作用，如鋁佐劑能夠增強抗體產(chǎn)生，但是細胞反應較弱且伴隨疼痛、腫脹等限制了其在FMDV中應用[2]。前期研究表明，CARCP/WARCP具有良好佐劑活性[9-11]，為此，本研究選用CARCP/WARCP作為FMDV候選佐劑，基于總物質(zhì)量和多糖含量比較CARCP/WARCP對體液免疫及細胞免疫反應的影響，觀察CARCP/WARCP的免疫增強作用和安全性的異同。

CARCP/WARCP配伍FMDV免疫后小鼠注射部位沒有出現(xiàn)肉芽腫、膿腫等不良反應，沒有出現(xiàn)食欲不振、脫毛、肌肉抽搐等癥狀，對各組小鼠生長沒有影響，也沒有引起過敏反應，提示CARCP/WARCP作為FMDV佐劑具有較好的安全性。

有效的體液免疫反應在抵御FMD病毒感染及提供長期保護中起至關重要的作用，IgG水平的高低是評價疫苗效力的間接指標。菊粉多糖作為H1N1佐劑能夠提高體液免疫反應[15]。因此，本研究以總物質(zhì)量和多糖含量為標準，比較CARCP/WARCP對FMDV免疫小鼠IgG水平的增強效果。初次免疫后14～28 d IgG結果表明，總物質(zhì)量一致時，CARCP1/WARCP1均能增強FMDV特異性IgG水平，且CARCP1效果高于WARCP1，這與CARCP多糖含量高于WARCP相關。多糖含量一致時，CARCP2/WARCP2均能提高IgG水平，且CARCP2/WARCP2增強作用相當，這與CARCP2/WARCP2多糖含量相同相關。

有研究表明，馬齒莧、川明參等中草藥多糖作為FMDV佐劑可以誘導Th1/Th2反應，尤其激發(fā)Th1反應而增強了FMDV效力[6-7]。本研究中，初次免疫后28 d IgG1、IgG2a結果表明，總物質(zhì)量一致時，CARCP1/WARCP1均能提高FMDV特異性IgG2a(Th1)、IgG1(Th2)以及IgG2a/IgG1比值，且CARCP1增強效果高于WARCP1。多糖含量一致時，CARCP2/WARCP2均能增強IgG2a水平及IgG2a/IgG1比值，且CARCP2/WARCP2增強效果相當。這些結果顯示，CARCP/WARCP均能促進Th1/Th2反應，尤其是Th1反應，激發(fā)針對FMD的有效體液和細胞免疫反應。

效應及記憶T細胞活化對FMD防治具有重要意義[16-17]，黃芪等中草藥多糖能夠促進效應及記憶T細胞而增強了針對FMD的細胞免疫應答[18]。為此，本研究為評估CARCP/WARCP對細胞免疫的影響，加強免疫后14 d檢測了脾中T細胞亞群，結果表明總物質(zhì)量一致時，CARCP1/WARCP1均能增強CD3+CD4+和CD3+CD8+及CD4+CD44+和CD8+CD44+效應T細胞及CD8+CD44+CD62L-/CD62L+記憶T細胞比例，且CARCP1增強效果優(yōu)于WARCP1，這與CARCP1的多糖含量高于WARCP1相關。多糖含量一致時，CARCP2/WARCP2均能增強效應T細胞及記憶T細胞比例，且CARCP2/WARCP2的作用沒有差異，表明CARCP2/WARCP2促進效應及記憶T細胞活化與多糖含量相同相關。

4 結 論

綜上所述，總物質(zhì)量一致時，CARCP1/WARCP1均能增強FMDV特異性體液和細胞免疫水平，尤其是Th1反應，CARCP1效果優(yōu)于WARCP1，這與CARCP1的多糖含量高于WARCP1相關；多糖含量一致時，CARCP2/WARCP2佐劑效應并無差異，表明CARCP2/WARCP2促進FMDV特異性免疫反應與多糖含量相同相關。這些研究結果提示，CARCP作為FMDV新型佐劑的有效性和安全性，也為探索中草藥多糖作為新型佐劑預防和控制其他傳染病提供試驗借鑒。