血漿和腦脊液中自身抗tau 抗體的自然發(fā)生規(guī)律及對(duì)阿爾茨海默病的啟示

陳偉明，周麗華，徐武華

1廣州市紅十字會(huì)醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科（神內(nèi)二區(qū)），廣東 廣州 510220；2廣東三九腦科醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東 廣州 510510

隨著Aβ疫苗研究的紛紛失敗，阿爾茨海默?。ˋD）的病因和發(fā)病機(jī)制變得更加撲朔迷離［1］，但免疫療法依然保留在最有潛力的AD防治選項(xiàng)之中［2-4］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，自然發(fā)生的抗β淀粉樣蛋白抗體（nAb-Aβ）高頻率、無差別地出現(xiàn)在AD患者和正常人群的外周血中［5］，且可能先于腦內(nèi)Aβ斑塊的形成，并在自然衰老過程中呈現(xiàn)出"U"型的年齡相關(guān)性變化［6］。另一方面，既往研究采用雙抗原夾心的ELISA方法也先后證實(shí)nAb-tau存在于AD患者、其他類型癡呆患者及正常人外周血及腦脊液（CSF）中［7-8］，但因樣本量較小且均未針對(duì)該抗體的免疫特性進(jìn)行更深入的研究并未引起足夠的重視，其臨床價(jià)值也迄今未明。本研究將分別采用Western blot和IHC兩種方法分別論證nAb-tau在AD型癡呆、其他類型癡呆患者以及不同年齡段認(rèn)知正常者外周血和CSF中的發(fā)生率以及免疫特性，以期從腦內(nèi)tau免疫應(yīng)答的角度洞悉AD的病理機(jī)制，并探討其作為AD生物學(xué)診斷標(biāo)志物的科學(xué)性和可行性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2006～2018年于廣州市紅十字會(huì)醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科住院的95名癡呆患者及93名NC受試者中，選取5例AD患者、5例OD患者和10例NC受試者。同時(shí)獲得血漿和CSF標(biāo)本，并進(jìn)一步行Western blot檢測(cè)，20例NC組患者血漿進(jìn)行IHC，其中OD組包括3例血管性癡呆、1例額顳葉癡呆及1例帕金森病癡呆。AD組納入標(biāo)準(zhǔn)：AD診斷符合美國國立神經(jīng)病學(xué)與語言障礙、卒中和阿爾茨海默病及相關(guān)疾病協(xié)會(huì)規(guī)定［9］；OD組納入標(biāo)準(zhǔn)：符合美國國立神經(jīng)疾病與腦卒中研究所制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)，血管性癡呆、額顳葉癡呆及帕金森病癡呆分別符合其相應(yīng)診斷標(biāo)準(zhǔn)［9-11］；NC組納入標(biāo)準(zhǔn)：體格查體和神經(jīng)心理學(xué)檢查均排除癡呆的診斷。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有嚴(yán)重的肝腎功能損傷、急性心肌梗死、惡性腫瘤及其他危及生命的疾病者。本研究得到廣州市紅十字會(huì)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意，所有的研究對(duì)象入組前均得到充分告知并簽署了知情同意書。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集 收集部分患者在凍存的入院48 h內(nèi)行腰椎穿刺術(shù)留取CSF 2.5 mL，4 ℃，3000 r/min 離心20 min，分離上清，置于-80℃冰箱保存，待測(cè)。收集患者在凍存的入院48 h內(nèi)全血5.0 mL，4 ℃，3000 r/min離心20 min，分離上清制備成血漿，置于-80℃冰箱保存，待測(cè)。

1.2.2 Western blot法檢測(cè)血漿和CSF中的nAb-tau 將人工合成的全氨基酸序列的Tau441 蛋白（Abcam，0.2 μg/L）配置成20 μL定量上樣量加入SDS-PAGE凝膠，140V電泳分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，2%牛奶液（BIO-RAD）封閉非特異性結(jié)合后，分別置于AT-8（ThermoFisher Sci.，1∶1000）、CSF（1∶5000）、血漿（1∶1000）稀釋液和PBS中，4 ℃孵育過夜。洗膜后，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（碧云天，1∶2000），室溫孵育1 h，光化學(xué)顯色法檢測(cè)免疫反應(yīng)帶，采用Image lab6.0軟件測(cè)量灰度值。

1.2.3 IHC檢測(cè)nAb-tau的組織免疫學(xué)特性（1）Tg2576小鼠（雄性，體質(zhì)量20～25 g，SPF級(jí)）腦組織切片制備：Tg2576小鼠處死后取一側(cè)大腦半球制備成石蠟標(biāo)本，切成5 μm厚的連續(xù)切片，4 ℃保存?zhèn)溆?；?）5 μm厚的Tg2576小鼠腦組織連續(xù)石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，微波修復(fù)抗原。分別采用AT-8（ThermoFisher Sci.，1∶400）、血漿（1∶100）、CSF（1∶100）和PBS 作為一抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（碧云天，1∶50）作為二抗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，顯微鏡下肉眼判斷染色結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

1.3.1 樣本量估計(jì) 本研究欲探討血漿和/或CSF 中nAb-tau與AD發(fā)病的相關(guān)性，采取分層抽樣的方法，根據(jù)以往資料發(fā)現(xiàn)AD患者血漿/CSF中nAb-tau的檢出率約為95%［7-8］，以95%的可信度，要求結(jié)果落實(shí)在總體真實(shí)率的10%以內(nèi)，根據(jù)公式：N=Z1-α/22(1-p)/ε2p估算樣本量。該研究中，p=0.95，ε=0.1，α=0.05，則Z1-α/22=1.96，計(jì)算結(jié)果如下：N=1.962×(1-0.95)/0.12×0.95=20.21，因此共需20例，在實(shí)際研究中心最初共納入20名研究對(duì)象。

1.3.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，各組計(jì)量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用n(%)表示采用χ2檢驗(yàn)（樣本量≥40且理論頻數(shù)≥5）或校正χ2檢驗(yàn)（樣本量≥40且1≤理論頻數(shù)＜5）或Fisher確切概率法（樣本量＜40）；定量數(shù)據(jù)的多組間比較采用單因素方差分析方法，隨后兩組間差異的比較采用SNK-q和LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Western blot檢測(cè)血漿或CSF中nAb-tau蛋白表達(dá)

2.1.1 受試者臨床資料的比較 3 組患者的性別、年齡、病程、CSF蛋白、CSF葡萄糖的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；MMSE 平均得分AD、OD 組較NC 組降低（P＜0.001），而AD組與OD組MMSE評(píng)分的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.938），AD、OD組受試者顱腦MRI可見腦萎縮，NC組患者則不明顯。3組臨床特征（表1）及頭顱MRI結(jié)果圖示（圖1）。

圖1 3組患者頭顱MRI結(jié)果Fig.1 MRI results of three groups.

表1 3組患者的臨床資料比較Tab.1 Comparison of clinical data of three groups(Mean±SD)

2.1.2 Western blot檢測(cè)結(jié)果及其與MMSE分值的相關(guān)性 20份CSF標(biāo)本及血漿標(biāo)本分別來自AD、OD和NC組，其中19份（95%）CSF標(biāo)本、2份（10%）血漿標(biāo)本檢出與AT-8相似的免疫陽性帶（圖2）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，3組CSF中nAb-tau檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.158，P=0.206，表2）。另外，2例陽性血漿均出現(xiàn)在NC組（2/10，20%），3組血漿中nAb-tau檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=2.222，P=0.329，表3），nAb-tau檢出率在CSF中較血漿增高（P＜0.001），血漿和CSF的nAb-tau檢出率與MMSE均分的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表4）。

表2 3組受試者CSFnAb-tau檢出率的比較Tab.2 Comparison of detection rate of nAb-tau in CSF of three groups(n)

表3 3組受試者血漿nAb-tau檢出率的比較Tab.3 Comparison of detection rate of nAb-tau in plasma of three groups(n)

表4 3組受試者血漿/CSFnAb-tau檢出率與MMSE均分相關(guān)性Tab.4 Correlation between the detection rate of nAb-tau in plasma/CSF and the average scores of MMSE in three groups

圖2 血漿和CSFnAb-tau蛋白Western blot條帶Fig.2 Western blot bands of nAb-tau protein in plasma and CSF.

3.2 IHC結(jié)果

為了解血漿nAb-tau在自然衰老過程中的發(fā)生規(guī)律，將20例0～80歲NC組患者血漿標(biāo)本按～10歲一個(gè)年齡段分為7組（表5），鑒于61～70歲和71～80歲兩個(gè)年齡段組僅有3例，故將其合并為61～80歲組。結(jié)果共檢出11例（55%）陽性血漿，但各年齡組的陽性率的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.512，P=0.608）。

表5 不同年齡段NC組患者血漿免疫染色Tg2576小鼠腦組織切片的結(jié)果Tab.5 The results of plasma from different-aged normal controls immunostaining Tg2576 mice brain tissue sections[n(%)]

為進(jìn)一步分析nAb-tau的免疫特性，分別隨機(jī)選取Western blot（+）的CSF和血漿各1例、Western blot（-）的CSF和血漿各1例，進(jìn)行IHC。結(jié)果顯示W(wǎng)estern blot（+）的CSF/血漿標(biāo)本顯示出與單克隆抗tau抗體AT-8相似的組織免疫特性，可清晰地識(shí)別Tg2576小鼠腦組織切片中的退變神經(jīng)軸索（圖3B、C），而Western blot（-）CSF/血漿則未見任何染色陽性的退變軸索。

圖3 血漿/CSF免疫染色Tg2576小鼠腦組織切片結(jié)果（IHC染色,×400）Fig.3 The results ofplasma/CSF immunostaining Tg2576 mice brain tissue sections(IHC staining,×400).

3 討論

在諸多AD病理機(jī)制假說中，異構(gòu)化的Aβ蛋白和tau蛋白可能是誘導(dǎo)腦內(nèi)免疫應(yīng)答異常和慢性遷延性炎癥的源頭［12-13］。課題組業(yè)已證實(shí)了外周血nAb-Aβ可能早于腦內(nèi)Aβ斑塊的形成，進(jìn)一步提示了這一針對(duì)異構(gòu)化生理蛋白的免疫應(yīng)答過程并非僅發(fā)生在AD患者，也同樣出現(xiàn)在各年齡段的正常人［6］。本研究采用了與前期研究相似的方法對(duì)nAb-tau的免疫特性和臨床價(jià)值進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)總陽性率（11/20，55%）略高于nAb-Aβ的35.6%［6］，且各年齡組陽性率的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.512，P=0.608）。免疫特性分析研究進(jìn)一步證實(shí)，3 組CSF 中的nAb-tau 均可同時(shí)識(shí)別人工合成的tau441以及Tg2576小鼠腦組織切片中的退變神經(jīng)軸索。由此認(rèn)為，nAb-tau很可能與nAb-Aβ［5-6］一樣高頻率、無差別地出現(xiàn)在人類的全生命周期，并具備相似的免疫特性。

既往臨床病理研究業(yè)已證實(shí)，神經(jīng)原纖維纏結(jié)和Aβ斑塊在AD大腦中存在著相似的跨腦區(qū)擴(kuò)散的演變規(guī)律，但前者的臨床意義遠(yuǎn)大于后者［14-15］。本研究和既往研究［7-8］均觀察到nAb-tau廣泛存在于AD及包括正常認(rèn)知的非AD患者的CSF及外周血中，這一現(xiàn)象提示神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)的神經(jīng)骨骼蛋白誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答可能較早地參與了包括AD在內(nèi)諸多中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病的病理過程，但同樣的疑問也同時(shí)出現(xiàn)在nAb-Aβ和nAbtau中，即這兩種自身免疫應(yīng)答反應(yīng)究竟是AD病理的始作俑者，抑或僅僅只是一種次病理現(xiàn)象；這兩種自身抗體的出現(xiàn)對(duì)AD的發(fā)生和發(fā)展是保護(hù)性的，還是破壞性的。有學(xué)者定量對(duì)比研究了帕金森病性癡呆和帕金森病非癡呆兩組患者的血清nAb-tau水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)前者明顯低于后者（P=0.007）［16］。本研究顯示，AD組及OD組血漿nAb-tau檢出率（0%）低于NC組（10%，P=0.329），但隨后的IHC研究也發(fā)現(xiàn)該抗體也存在55%正常認(rèn)知人群中。有學(xué)者采用轉(zhuǎn)人類tau基因小鼠（P301S）進(jìn)行的tau蛋白抗體被動(dòng)免疫研究發(fā)現(xiàn)，腹腔內(nèi)注射單克隆抗tau抗體（HJ8.5）后模型小鼠血漿中的tau蛋白水平明顯升高并伴隨著腦內(nèi)tau病理的改善和可溶性tau水平的升高［17-18］。上述結(jié)果均提示內(nèi)源性和外源性抗tau抗體的出現(xiàn)對(duì)于AD病理的發(fā)生和發(fā)展可能具有潛在的保護(hù)作用，但其對(duì)AD的診斷價(jià)值和預(yù)測(cè)價(jià)值仍需要更多循證醫(yī)學(xué)研究加以證實(shí)。本研究進(jìn)行Western blot分析時(shí)腦脊液和血漿的稀釋倍數(shù)分別為1∶5000和1∶1000，但前者的nAb-tau檢出率仍遠(yuǎn)高于后者（P＜0.001），提示該抗體很可能是從腦內(nèi)溢漏到外周的［7,18］。

本研究中年齡最小的IHC陽性血漿出現(xiàn)在新生兒中，而2 例Western blot 陽性血漿也來自NC 組，類似的現(xiàn)象也見于nAb-Aβ研究［5-6］和其他的nAb-tau研究中［8,19］，上述現(xiàn)象強(qiáng)烈提示：構(gòu)成AD兩大病理特征的關(guān)鍵蛋白Aβ和tau抗原很可能從生命初期就開始暴露在腦內(nèi)的免疫應(yīng)答之中。長期以來，中樞神經(jīng)系統(tǒng)被視為相對(duì)封閉的免疫豁免區(qū)［20］，但越來越多的研究證據(jù)顯示血腦屏障的破壞早期參與了AD的發(fā)生和發(fā)展［21］，且腦內(nèi)的淋巴管系統(tǒng)也并非與外界完全隔絕［22］。上述發(fā)現(xiàn)也為深入理解為什么AD狀態(tài)下如此多的腦內(nèi)生理性蛋白質(zhì)（Aβ、tau、低分子量神經(jīng)絲蛋白等）被免疫系統(tǒng)識(shí)別并誘導(dǎo)產(chǎn)生自身抗體提供了理論依據(jù)［23-24］。

近年來，在探索AD生物學(xué)診斷標(biāo)志物上取得了長足的進(jìn)展，已發(fā)現(xiàn)至少3種具有明確診斷價(jià)值和數(shù)十種具有潛在診斷價(jià)值的生物學(xué)標(biāo)志物［25］，但其特異性和敏感度均存在較大的爭(zhēng)議。另外，（分子）神經(jīng)影像學(xué)的日新月異，以及多模態(tài)MRI、正電子發(fā)射斷層掃描等技術(shù)的發(fā)展為AD的早期診斷和個(gè)體化治療提供了全新的手段［26］。但基于種種原因，現(xiàn)今AD的臨床診斷仍主要依賴最為傳統(tǒng)的排他性診斷原則［27］。本研究試圖通過Western blot和免疫病理兩種方法論證nAb-tau的免疫特性和發(fā)生規(guī)律，也回歸分析了其與MMSE分值之間關(guān)聯(lián)（P＞0.05），但均未發(fā)現(xiàn)其具備AD生物學(xué)診斷標(biāo)志物的基本條件。而隨著絕大多數(shù)Aβ和tau疫苗研究的近乎停滯［2-4,28-29］，越來越多的學(xué)者更傾向于支持AD是一種病因復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制多樣的異質(zhì)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，且病因和病理機(jī)制并不僅僅局限于腦內(nèi)［30-32］。

目前尚無研究深入探討nAb-tau出現(xiàn)的分子機(jī)制，但必須指出的是，在諸多業(yè)已證實(shí)存在的自身抗體中，尚未發(fā)現(xiàn)任何一種對(duì)AD臨床具有參考價(jià)值［5-8,19］。綜上，全面而深入研究腦內(nèi)免疫應(yīng)答機(jī)制以及血腦屏障在AD發(fā)生和發(fā)展中的作用，將有助于進(jìn)一步理解包括nAb-tau等自身抗體的確切成因，并為未來的AD免疫治療研究指明方向。