離子液體輔助研究“雙丹方”中活性成分量的關(guān)系*

唐一梅,扈本荃,張 夢(mèng)

(西安醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院 藥物研究所,陜西 西安 710021)

藥對(duì)作為復(fù)方配伍的最小單位,是解決復(fù)方配伍后復(fù)雜物質(zhì)變化的恰當(dāng)切入點(diǎn)。雙丹方由丹參、丹皮兩味藥組成,兩味藥功效相須為用,但有關(guān)其配伍作用機(jī)制還不清楚。

鄭曉暉課題組[1-2]研究了雙丹方中丹參對(duì)丹皮、丹皮對(duì)丹參藥代動(dòng)力學(xué)的影響。丹參與丹皮配伍后,丹皮中丹皮酚吸收入血加快,作用時(shí)間延長,丹皮酚在心、肝、腦、肺、腎中的濃度較丹皮組(單味藥)明顯升高,結(jié)果驗(yàn)證了君藥丹參不僅對(duì)主證起治療作用,而且具有引經(jīng)作用;丹皮與丹參配伍給藥后,可明顯促進(jìn)丹參素吸收入血,使其體內(nèi)作用時(shí)間延長,生物利用度提高。上述的藥代動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果表明,丹參與丹皮配伍后,兩味藥發(fā)揮了協(xié)同作用。

離子液體(Ionic Liquids,ILs)是由有機(jī)陽離子和無機(jī)/有機(jī)陰離子組成的熔融鹽,在室溫或較低溫度下(一般低于100℃)呈液態(tài)[3]。離子液體與常見鹽水體系和傳統(tǒng)有機(jī)溶劑相比較,其具有熱穩(wěn)定性好[4]、蒸氣壓低[3]、溶解能力強(qiáng)[5-7]、可設(shè)計(jì)性等優(yōu)點(diǎn)[8],在有機(jī)合成[9-11]、電化學(xué)[12-14]、醫(yī)藥科學(xué)[15-19]等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用,離子液體也可用于分離技術(shù)方面[19-22],研究表明,可依據(jù)性質(zhì)需要進(jìn)行離子液體結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì),離子液體可作為輔助溶劑,用于物質(zhì)的分離分析[23-25]。

作者以離子液體作為輔助溶劑,干預(yù)雙單方中活性成分丹參、丹皮酚的提取量,以單味藥提取液作為溶劑提取分析另一味藥活性成分提取量的變化,從分子水平上,闡明君藥與臣藥之間存在相互作用,源于活性成分之間存在的相互作用。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料、試劑與儀器

丹參:產(chǎn)地陜西,牡丹皮藥材:產(chǎn)地河南,經(jīng)西安醫(yī)學(xué)院張彥副教授鑒定,分別粉碎,過篩,孔內(nèi)徑為(250±9.9)μm,待用。

甲基-3-丁基-咪唑溴([BMIM]Br)、1-甲基-3-辛基咪唑溴離子液體([OMIM]Br):自制;六氟磷酸鉀(KPF6):CP,薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司;丹參素標(biāo)準(zhǔn)品:純度≥98%,批號(hào)B20254-2,丹皮酚對(duì)照品:純度≥98%,批號(hào)Y27F7Y17002,上海源葉生物科技有限公司;乙醇、甲酸:分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;甲醇:色譜純,美國Fisher公司。

高效液相色譜儀:G1312B 1260 Infinity二元液相色譜系統(tǒng),G1329B 1260 Infinity自動(dòng)進(jìn)樣器,G1316A 1260 Infinity柱溫箱,G4212B 1260 Infinity DAD檢測(cè)器1260,美國Agilent公司;集熱式恒溫加熱磁力攪拌器:DF-101S,鄭州長城科工貿(mào)有限公司;超聲波清洗器:SB-5200DT,寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 供試品溶液的制備

1.2.1.1 丹參供試品溶液的制備

稱取丹參3.0 g于100 m L圓底燒瓶中,m(溶劑)∶m(藥材)＝8∶1,回流2次,每次1.5 h,合并濾液(丹參提取液記為DS)揮發(fā)至約2 mL,甲醇定容至10 m L容量瓶中,得丹參供試品溶液,記為DS-1(見表1)。稱取干燥丹參3.0 g于100 m L圓底燒瓶中,m(溶劑)∶m(藥材)＝8∶1,V(離子液體)∶V(水)＝1∶9;采用離子液體浸泡丹參藥材后加水提取、離子液體-水混合浸泡丹參后提取2種方式;2種提取體系分別回流2次,每次1.5 h,合并濾液;離子液體-水混合后提取液,按照n(離子液體)∶n(KPF6)＝1∶1加入KPF6,置于水浴加熱反應(yīng)1 h,抽濾,分液;將上層溶液旋蒸濃縮至約10 m L,濃縮液分別加質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%乙醇2次,合并濾液濃縮至約2 mL,甲醇定容至10 mL容量瓶中,得丹參供試品溶液,記為DS-2、DS-3(見表1)。

表1 不同溶劑體系提取丹參素、丹皮酚

1.2.1.2 丹皮供試品溶液的制備

稱取丹皮1.5 g于100 m L圓底燒瓶中,m(溶劑)∶m(藥材)＝10∶1,回流2次,時(shí)間分別為10、15 min,合并2次濾液(丹皮提取液記為DP),吸取2 m L濾液定容至10 m L容量瓶中,得丹皮供試品溶液,記為DP-1(見表1)。稱取丹皮1.5 g于100 mL圓底燒瓶中,m(溶劑)∶m(藥材)＝10∶1,V(離子液體)∶V(水)＝1∶3;采用離子液體浸泡丹皮后加水提取、離子液體-水混合浸泡丹皮后提取2種方式;2種提取體系分別回流2次,時(shí)間分別為10、15 min,合并濾液;離子液體-水混合后提取液,按照n(離子液體)∶n(KPF6)＝1∶1加入KPF6,置于水浴加熱反應(yīng)1 h,抽濾,分液,吸取2 m L濾液定容至10 m L容量瓶中,得丹皮供試品溶液,記為DP-2、DP-3(見表1)。

1.2.1.3 丹參-丹皮供試品溶液的制備

分別稱取丹參3.0 g(3份)于100 m L圓底燒瓶中,加丹皮提取液,V(DP)∶V(水)＝1∶1,m(溶劑)∶m(藥材)＝8∶1,加熱回流2次,每次1.5 h,合并2次濾液,得丹參-丹皮提取溶液,記為DD,濃縮甲醇定容至10 m L,得丹參-丹皮供試品溶液(未醇沉),記為DS-DP-1、DS-DP-2和DSDP-3(見表1);丹參-丹皮提取溶液旋蒸濃縮至約10 m L,醇沉2次,濾液水浴揮發(fā)至約2 m L,甲醇定容至10 m L容量瓶中,得丹參-丹皮供試品溶液(醇沉),記為DS-DP-4、DS-DP-5和DS-DP-6(見表1)。

1.2.1.4 丹皮-丹參供試品溶液的制備

稱取丹皮1.5 g于100 m L圓底燒瓶中,加入丹參第一次回流提取液,V(DS)∶V(水)＝1∶1,m(溶劑)∶m(藥材)＝10∶1,加熱回流2次,時(shí)間分別為10、15 min,合并2次濾液,得丹皮-丹參提取溶液,記為DP-DS,精密吸取2 m L濾液定容至10 m L容量瓶中,得丹皮-丹參供試品溶液,記為DP-DS-1、DP-DS-2和DP-DS-3(見表1);稱取丹皮1.5 g于100 m L圓底燒瓶中,加入丹參第二次回流提取液,同上步驟,得丹皮-丹參供試品溶液,記為DP-DS-4、DP-DS-5和DP-DS-6(見表1)。

1.2.2 對(duì)照品溶液的配制

1.2.2.1 丹參素對(duì)照品溶液的配制

精密稱定丹參素對(duì)照品0.005 00 g,甲醇定容于10 m L容量瓶中,得質(zhì)量濃度為500.00μg/m L的丹參素對(duì)照品溶液。

1.2.2.2 丹皮酚對(duì)照品溶液的配制

精密稱取丹皮酚對(duì)照品0.010 12 g,定容于25 m L容量瓶中,得質(zhì)量濃度為404.80μg/m L的丹皮酚對(duì)照品溶液。

1.2.3 色譜條件

1.2.3.1 丹參素色譜條件

色譜柱:Agilent HC-C18(2)(250 mm×4.6 mm,5μm);流動(dòng)相:V(水)∶V(甲醇)＝80∶20;流速0.8 m L/min;柱溫:30℃;檢測(cè)波長:280 nm;進(jìn)樣量:10μL。

1.2.3.2 丹皮酚色譜條件

色譜柱:Agilent HC-C18(2)(250 mm×4.6 mm,5μm);流動(dòng)相:V(水)∶V(甲醇)＝40∶60;流速:0.8 m L/min;柱溫:30℃;檢測(cè)波長:274 nm;進(jìn)樣量:10μL。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取1.2.2.1的丹參素對(duì)照品溶液4.00、2.00、1.00、0.80、0.40 m L分 別 置 于5 m L容 量 瓶中,甲醇稀釋定容,得系列質(zhì)量濃度的丹參素標(biāo)準(zhǔn)溶液;分別精密吸取10μL進(jìn)樣,記錄質(zhì)量濃度和峰面積A。以峰面積A為縱坐標(biāo),ρ(丹參素)為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸計(jì)算,得線性回歸方程為A＝4.092 8ρ＋14.686(r＝1)。結(jié)果表明,ρ(丹參素)＝80~500μg/m L具有良好的線性關(guān)系。

精密吸取1.2.2.2的丹皮酚對(duì)照品溶液0.25、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50 m L置10 m L容 量 瓶中,甲醇稀釋定容,得系列質(zhì)量濃度的丹皮酚標(biāo)準(zhǔn)溶液;分別精密吸取10μL,依次進(jìn)樣,記錄峰面積A。以峰面積A為縱坐標(biāo),ρ(丹皮酚)為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸計(jì)算,得線性回歸方程為A＝35.794ρ＋241.31(r＝0.998 0)。結(jié)果表明,ρ(丹皮酚)＝20.44~408.8μg/m L具有良好的線性關(guān)系。

1.2.5 含量測(cè)定

根據(jù)?中國藥典?2015版附錄?藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則?要求,采用外標(biāo)法測(cè)定供試品中待測(cè)成分的含量,方法學(xué)考察符合測(cè)定要求,測(cè)定結(jié)果見圖1~圖3,以峰面積計(jì)算丹參素和丹皮酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù),見表2。

圖1 水溶液、離子液體-水溶液體系中丹參、丹皮單味藥供試品溶液色譜圖

圖2 丹參-丹皮供試品溶液色譜圖

圖3 丹皮-丹參供試品溶液色譜圖

表2 丹參素、丹皮酚含量檢測(cè)結(jié)果(n＝5) w/%

續(xù)表

2 結(jié)果與討論

2.1 [BMIM]Br離子液體對(duì)丹參素提取量的影響

由圖1、表2可知,[BMIM]Br-水提取法與傳統(tǒng)水提法比較,[BMIM]Br浸泡30 min水提取法與[BMIM]Br-水提取法比較w(丹參素)明顯增高,前者w(丹參素)均明顯高于后者。由于在[BMIM]＋中,咪唑環(huán)上活潑氫與丹參素結(jié)構(gòu)中羰基能夠產(chǎn)生強(qiáng)的氫鍵相互作用[26],同時(shí),Br－也能與丹參素分子結(jié)構(gòu)中的羥基形成氫鍵,因此,[BMIM]Br均利于水溶性成分丹參素從丹參藥材中轉(zhuǎn)移至離子液體-水體系中,導(dǎo)致丹參素的提取率提高[27]。

2.2 [OMIM]Br離子液體對(duì)丹皮酚提取量的影響

課題組前期已完成丹皮酚活性提取條件的優(yōu)化,結(jié)果表明,離子液體[OMIM]Br能夠提高丹皮酚的提取率[28]。由圖1、表2可知,[OMIM]Br-水回流提取法與[OMIM]Br浸泡30 min-水回流提取法和傳統(tǒng)水回流提法比較,丹皮酚提取量明顯降低。[OMIM]Br與丹皮酚之間具有強(qiáng)的相互作用力,提取時(shí)間較短,使得丹皮酚不能完全釋放。

2.3 丹皮提取液對(duì)丹參素提取量的影響

由圖2、表2可知,伴隨著丹皮提取液中w(丹皮酚)的降低,丹參水溶性成分w(丹參素)均明顯降低。原因可能在于丹參素和丹皮酚分子之間存在弱的相互作用。

2.4 丹參提取液對(duì)丹皮酚提取量的影響

由圖3、表2可知,隨著提取液中w(丹參素)的增加,丹皮主要活性成分丹皮酚提取量明顯增加。

由圖2、圖3及表2可知,雙單方中丹參活性成分丹參素與丹皮活性成分丹參素提取量之間具有正相關(guān)性。原因可能在于丹參素和丹皮酚分子之間存在弱的相互作用,促進(jìn)了丹皮中丹皮酚的釋放,丹皮酚促進(jìn)了丹參中丹參素的釋放。從中醫(yī)理論的角度講,雙丹方中體現(xiàn)中藥“相須”關(guān)系,丹參為君藥,丹皮為臣藥,可起協(xié)同作用,能加強(qiáng)藥效[1-2],這種協(xié)同作用可能源于活性分子之間弱的相互作用力。

2.5 不同提取體系對(duì)丹參素與丹皮酚的影響

醇沉過程對(duì)丹參素、丹皮酚提取均產(chǎn)生不利影響。丹參-丹皮體系與丹皮-丹參體系,醇沉前丹參素和丹皮酚的提取量均高于醇沉后的提取量。

丹參-丹皮體系與丹皮-丹參體系相比,丹皮酚提取量明顯降低。丹皮酚提取量降低可能源于3個(gè)方面。丹皮酚加熱易于揮發(fā),丹皮提取液加入到丹參-丹皮提取體系中,延長了丹皮酚的揮發(fā)時(shí)間,導(dǎo)致丹皮酚測(cè)定量降低;水提醇沉過程會(huì)包覆小分子,導(dǎo)致丹皮酚測(cè)定量降低;丹皮酚的水溶性差也可能使丹皮酚在醇沉過程中損失大,導(dǎo)致丹皮酚提取量降低。

隨著雙丹方中丹皮酚提取量的增高,丹參水溶性成分丹參素的提取量明顯增高;隨著丹參素提取量的增高,丹皮酚的提取量明顯增高。結(jié)果表明,丹參中丹參素提取量與丹皮中丹皮酚提取量之間存在正向相關(guān)性。由于溶劑與溶質(zhì)之間存在一定相互作用時(shí),溶質(zhì)在溶劑中的溶解度會(huì)相對(duì)較高,因此,藥材中活性成分提取量低,與物質(zhì)體系中化合物之間的相互作用有關(guān),表明丹參素和丹皮酚分子之間可能存在弱的相互作用,即藥對(duì)配伍之后,兩者在分子水平上的物質(zhì)基礎(chǔ)變化密切相關(guān),兩者存在相互影響。

3 結(jié) 論

離子液體能夠溶解纖維素,破除細(xì)胞壁,提高傳質(zhì)能力,因此,能夠輔助提高中藥材活性成分的提取率。在雙丹方藥對(duì)中,活性成分丹參素的提取量與丹皮酚的提取量成正相關(guān)性,從化合物相互作用的角度證明了君藥和臣藥物質(zhì)之間存在協(xié)同作用,源于物質(zhì)基礎(chǔ)體系中活性成分之間可能存在相互作用,進(jìn)一步印證了雙丹方藥代動(dòng)力學(xué)結(jié)果。