雄性二倍體毛白楊再生體系的構(gòu)建和遺傳轉(zhuǎn)化的研究

俞子承，凌 聰，陳贏男，李淑嫻，尹佟明，李小平

(南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037)

毛白楊(Populustomentosa)原產(chǎn)于中國，具有生長快速、輪作周期短、材質(zhì)優(yōu)良、環(huán)境適應(yīng)性強等特點，不僅是常見的速生用材和造林樹種，也廣泛應(yīng)用于庭園和道路綠化，同時還是理論研究和遺傳改良的理想材料[1-2]。自然條件下毛白楊為野生三倍體，通常伴隨雄蕊異常、花藥萎縮、花粉敗育消失等育性現(xiàn)象，制約了雜交育種的開展。此外，三倍體植株擁有額外一組染色體，增加了遺傳背景的復(fù)雜度，給基因功能的解析、測序片段的拼接和基因編輯位點的選擇帶來困擾，阻礙了組學(xué)測序及基因編輯等新技術(shù)的應(yīng)用。因此，為了進(jìn)一步開展毛白楊速生生長、性別發(fā)育相關(guān)等功能基因的研究，選用二倍體優(yōu)良植株進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建顯得尤為重要。南京林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種重點實驗室楊樹課題組早先對我國南方毛白楊自然種質(zhì)資源進(jìn)行了收集，并利用流式細(xì)胞儀對其染色體倍性進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)多株長勢良好的二倍體雄株，給毛白楊基因功能的研究帶來了契機(jī)。

近年來，基因工程技術(shù)因其目的性強、可靠性高、育種周期短等優(yōu)勢，在世代周期長、遺傳背景復(fù)雜的木本植物中廣泛應(yīng)用[3]。毛白楊的遺傳轉(zhuǎn)化主要選用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法，植物材料、菌株類型、質(zhì)粒載體等諸多因素協(xié)同影響整個進(jìn)程[4]?，F(xiàn)有的遺傳轉(zhuǎn)化研究大多選用三倍體植株為試驗材料，其余所用材料也是倍性不明，鮮有二倍體材料的研究報道。此外，基于不同毛白楊植物材料構(gòu)建優(yōu)化的遺傳轉(zhuǎn)化體系各不相同，菌液濃度、侵染時間以及共培養(yǎng)時間等關(guān)鍵試驗條件相差較大。龍萃等[5]對轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化后發(fā)現(xiàn)，侵染液在600 nm波長的吸光值為0.3～0.5時，對應(yīng)的轉(zhuǎn)化率為9.38%；而Du等[6]和Jia等[7]則選用了600 nm波長時吸光值為0.8的侵染液，作為最優(yōu)侵染條件。因此，針對選用的植物材料進(jìn)行試驗條件的篩選顯得十分重要[8-9]。

現(xiàn)階段，缺乏穩(wěn)定的再生體系是毛白楊遺傳轉(zhuǎn)化的主要障礙[9-11]。從外源基因整合受體基因組，到脫分化形成完整獨立再生植株，組織培養(yǎng)再生體系貫穿了整個遺傳轉(zhuǎn)化試驗流程[12]。再生體系的發(fā)展離不開植物激素的分離和使用，外源激素有效促進(jìn)了生長發(fā)育，提高了繁殖效率，縮短了再生周期[13]。楊屬植物組織培養(yǎng)技術(shù)比較成熟，主要選用6-芐氨基嘌呤(6-BA)和萘乙酸(NAA)等作為外源激素，近年來有學(xué)者在再生體系中添加苯基噻二唑基脲(TDZ)，有效提高了植株的繁殖系數(shù)[14-17]。本研究選用優(yōu)良單株雄性二倍體毛白楊為材料，對組織培養(yǎng)的激素組合及農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化的主要試驗條件進(jìn)行篩選，建立并優(yōu)化二倍體毛白楊再生體系和遺傳轉(zhuǎn)化體系，以期為其他木本植物遺傳轉(zhuǎn)化研究提供參考，并為后期分子輔助育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料采集于江蘇省南京市玄武湖公園，選取優(yōu)良基因型雄性二倍體毛白楊幼嫩含芽的莖段與枝條作為外植體。通過再生體系培育擴(kuò)繁，獲得無性系。選擇優(yōu)質(zhì)組培苗移栽并存放于南京林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種系溫室。

1.2 試驗方法

1.2.1 雄性二倍體毛白楊確定

采用流式細(xì)胞儀對選取的雄性二倍體毛白楊樣品單細(xì)胞的DNA大小進(jìn)行檢測，通過與標(biāo)準(zhǔn)品番茄樣品的比較，確定選取植株的倍性。

1.2.2 雄性二倍體毛白楊外植體消毒

采集枝條上包含嫩芽的莖段，清除表面灰塵，流水沖洗1～2 h。使用70%(體積分?jǐn)?shù))乙醇與10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))次氯酸鈉溶液分別對毛白楊莖段消毒，消毒時間各設(shè)置3個水平(70%乙醇消毒20、30和40 s；次氯酸鈉消毒5、10和15 min)，共9個處理。消毒期間用無菌水多次沖洗，最后接種于相應(yīng)培養(yǎng)基。每個處理接種50個莖段。7 d后統(tǒng)計染菌率、褐化率以及死亡率。

1.2.3 雄性二倍體毛白楊各階段培養(yǎng)基篩選

基本培養(yǎng)基篩選：分別配置1/4 MS、1/2 MS、MS培養(yǎng)基與WPM培養(yǎng)基，每種培養(yǎng)基中分別接種30個外植體頂芽。分別于10 d與20 d時統(tǒng)計不同培養(yǎng)基中頂芽的生長情況。

生根培養(yǎng)基篩選：在外植體培養(yǎng)中選擇生長階段相近的頂芽，去除多余葉片后插入基本培養(yǎng)基中，同時添加不同濃度的激素NAA與IBA。兩種外源激素各設(shè)置3個水平(0.3、0.5和0.7 mg/L)，共9個處理。每個生長瓶中接種1個頂芽，每個處理10瓶，20 d后觀察生根情況。

繼代培養(yǎng)基篩選：選取生長旺盛的無菌苗葉片進(jìn)行增殖繼代培養(yǎng)。3種外源激素各設(shè)置3個水平(6-BA設(shè)置0.3、0.5和0.7 mg/L；NAA設(shè)置0.3、0.5和0.7 mg/L；TDZ設(shè)置0.005、0.010和0.015 mg/L)，按照3因素3水平正交表設(shè)計試驗。葉片均勻切成1 cm×1 cm大小的葉盤，放置于不同激素處理的培養(yǎng)基中，每個處理各接種30片葉盤，每14 d更換培養(yǎng)基，統(tǒng)計增殖系數(shù)。

芽伸長培養(yǎng)基篩選：選擇繼代培養(yǎng)基中生長狀態(tài)相似的不定芽進(jìn)行試驗。兩種外源激素各設(shè)置3個水平(6-BA為0.1、0.3和0.5 mg/L；NAA為0.1、0.3和0.5 mg/L)，共9個處理。每個處理接種30個不定芽，每20 d更換培養(yǎng)基，清除死亡或褐化的材料，于40 d后統(tǒng)計不定芽生長長度。

1.2.4 二倍體毛白楊轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建

采用葉盤轉(zhuǎn)化法，選擇含有GUS報告基因的植物表達(dá)載體pBI121和根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105進(jìn)行試驗。植物材料為生長45～60 d的二倍體毛白楊無性系組培苗。試驗過程中對影響毛白楊轉(zhuǎn)化效率的因素進(jìn)行篩選。

預(yù)培養(yǎng)時間篩選：將葉盤接種于不含外源激素的愈傷分化培養(yǎng)基中，分別在無光環(huán)境中培養(yǎng)不同時間。預(yù)培養(yǎng)時間設(shè)置為0、12、24和48 h(0 h為對照組)。每個處理接種100個葉盤，觀察不同處理下葉盤的分化情況，統(tǒng)計產(chǎn)生抗性芽的葉盤數(shù)。

侵染液濃度與侵染時間篩選：選擇不同的侵染液濃度和侵染時間進(jìn)行試驗。菌液在600 nm波長的吸光值梯度設(shè)定為0.2、0.4、0.6和0.8；侵染時間為10、20和30 min。每個處理接種50個葉盤，觀察分化情況，統(tǒng)計產(chǎn)生抗性芽的葉盤數(shù)。

共培養(yǎng)時間篩選：葉盤完成侵染后，擦干表面多余菌液，轉(zhuǎn)移至最優(yōu)分化培養(yǎng)基中，于黑暗環(huán)境中共培養(yǎng)不同時間。共培養(yǎng)時間梯度設(shè)定為：8、16、24、32、40、48和56 h。每個處理接種50個葉盤，統(tǒng)計產(chǎn)生抗性芽的葉盤數(shù)。

卡那霉素濃度篩選：將葉盤接種在含有不同卡那霉素的最優(yōu)分化培養(yǎng)基上，添加Hyg 10 mg/L + Cef 200 mg/L +Tim 200 mg/L作為抑菌抗生素，卡那霉素的質(zhì)量濃度梯度設(shè)置為0、10、20、30、40和50 mg/L。每個處理接種30個葉盤，20 d后觀察葉盤生長狀況。

陽性植株的鑒定：分別摘取抗性植株和對照植株的葉片放入配置好的GUS染液進(jìn)行快速檢測，觀察葉片變色情況。提取抗性植株葉片DNA，根據(jù)質(zhì)粒載體pBI121序列設(shè)計引物進(jìn)行PCR驗證，觀察是否存在對應(yīng)條帶。

引物使用Primier 6軟件設(shè)計，交由南京金斯瑞公司合成。上游引物序列為TTTCCTTGATCTGCTGCTTCG,下游引物序列為ATTTCCGCGCAGACGATGACG，目的片段大小為2 058 bp。

1.2.5 二倍體毛白楊瞬時表達(dá)體系構(gòu)建

選用生長4～6周的二倍體毛白楊，取10片葉子切成葉條，避光酶解3～5 h，鏡檢確認(rèn)原生質(zhì)體成功分離后，去除雜質(zhì)，過濾重懸，獲得毛白楊原生質(zhì)體溶液。隨后將含有EGFP(enhanced green fluorescent protein)基因的p2GWF7質(zhì)粒與制備的毛白楊原生質(zhì)體溶液混勻，室溫孵育15 h，檢測熒光蛋白(EGFP)的瞬時表達(dá)情況。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用IBM SPSS Statistics(Version 20)中的單因素ANOVA模型、一般線性模型等工具對組培苗測定數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 雄性毛白楊外植體材料的倍性測定結(jié)果

通過流式細(xì)胞技術(shù)(flow cytometry, FCM)對毛白楊樣品單細(xì)胞的DNA大小進(jìn)行檢測結(jié)果見圖1。二倍體供試番茄與二倍體毛白楊基因組大小分別為900 Mb與480 Mb[18-19]，比值為1.875。標(biāo)準(zhǔn)品番茄與待測毛白楊樣品比值約為1.818，與基因組大小比值相近，表明供試雄性毛白楊樣品為二倍體。

2.2 二倍體毛白楊再生體系構(gòu)建與優(yōu)化

基于前期研究，本試驗選用70%(體積分?jǐn)?shù))乙醇與10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))次氯酸鈉作為消毒劑進(jìn)行外植體消毒。篩選結(jié)果顯示，不同消毒處理的植株死亡率差異很大，隨著消毒時間的延長，毛白楊外植體死亡率上升明顯。綜合9個消毒方案的統(tǒng)計結(jié)果，處理4(70%乙醇30 s，次氯酸鈉5 min)的外植體污染數(shù)最少，褐化率與死亡率相對較低，為最優(yōu)方案(表1)?；九囵B(yǎng)基篩選結(jié)果顯示，1/2 MS培養(yǎng)基中外植體的生長速度最快，WPM培養(yǎng)基與MS培養(yǎng)基生長狀況相似，1/4 MS培養(yǎng)基生長速度最慢(表2)。因此選擇1/2 MS作為基本培養(yǎng)基，進(jìn)行再生體系的構(gòu)建。

表1 外植體消毒篩選試驗結(jié)果

表2 基本培養(yǎng)基篩選試驗結(jié)果

將生長相近的外植體頂芽轉(zhuǎn)入不同激素組合的基本培養(yǎng)基，統(tǒng)計其生根率作為生根培養(yǎng)基篩選的依據(jù)。在所有的9個組合中，處理2(NAA 0.3 mg/L，IBA 0.5 mg/L)的毛白楊生根情況最好，平均生根率達(dá)到了96.7%(表3)，且植株根系粗壯，并伴生大量側(cè)根，為最優(yōu)激素組合(圖2)。值得注意的是，隨著激素濃度的升高，植株生根率逐漸下降。在處理8與處理9中，NAA質(zhì)量濃度達(dá)到0.7 mg/L時，毛白楊的生根率大幅下降，出現(xiàn)植株死亡的現(xiàn)象。二倍體雄性毛白楊植株再生過程見圖3。

將均勻處理后的葉盤放置于不同激素處理的培養(yǎng)基中，統(tǒng)計產(chǎn)生的不定芽，計算增殖系數(shù)，作為評價各個繼代培養(yǎng)方案的標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果顯示，增殖系數(shù)平均值最高的是處理5(6-BA的0.5 mg/L，NAA的0.5 mg/L，TDZ的0.005 mg/L)，其平均增殖系數(shù)達(dá)到6.63；其次是處理4的4.47，處理8的4.10以及處理9的4.03(表4)。增殖繼代過程中，不適宜的激素組合會促使葉盤出現(xiàn)褐化死亡的現(xiàn)象。對9個處理增殖系數(shù)的多重對比分析指出，處理5與其他處理間存在顯著性差異，因此毛白楊最佳增殖繼代培養(yǎng)基為：1/2 MS + 0.5 mg/L 6-BA + 0.5 mg/L NAA + 0.005 mg/L TDZ。

表4 激素配比對增殖繼代培養(yǎng)的影響

芽伸長培養(yǎng)是建立再生體系的必要步驟。葉盤增殖出的不定芽需要轉(zhuǎn)入對應(yīng)的芽伸長培養(yǎng)基中，待新生芽逐步伸長且莖基粗壯后，再轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基，以保證植株的生根率和成活率。研究表明，TDZ能夠促進(jìn)不定芽基部產(chǎn)生大量愈傷組織，但是高濃度的TDZ又會阻礙不定芽的生長，出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象[20-21]。所以本研究在對芽伸長培養(yǎng)基進(jìn)行篩選時，僅保留6-BA與NAA兩種激素，同時盡可能降低篩選所用的濃度。以培養(yǎng)30 d后不定芽平均生長長度為標(biāo)準(zhǔn)，其中處理8(6-BA 0.5 mg/L，NAA 0.3 mg/L)達(dá)到了26.3 mm，為最優(yōu)組合(表5)。此外，6-BA與NAA均對芽的生長有促進(jìn)作用。芽伸長培養(yǎng)基對NAA的依賴性相對較低，不定芽伸長的速度受NAA影響不大。

2.3 二倍體毛白楊轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建與優(yōu)化

本研究采用葉盤轉(zhuǎn)化法，選擇含有GUS報告基因的植物表達(dá)載體pBI121和根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105進(jìn)行試驗。借助試驗過程，對二倍體毛白楊轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行探索與優(yōu)化。

預(yù)培養(yǎng)在植物遺傳轉(zhuǎn)化過程中起調(diào)節(jié)植物細(xì)胞狀態(tài)的作用，能夠加快葉片傷口處細(xì)胞增殖分化，促使葉片在侵染過程中與外源DNA接觸，進(jìn)而提高轉(zhuǎn)化效率。在預(yù)設(shè)的4組對照試驗中，毛白楊葉片在預(yù)培養(yǎng)12 h的情況下，獲得的含抗性芽葉盤比例最高，達(dá)到9%。當(dāng)預(yù)培養(yǎng)時間達(dá)到24 h時，其分化能力大幅度下降。而預(yù)培養(yǎng)時間達(dá)48 h時，毛白楊葉盤失去形成不定芽的能力，抗性芽獲得率為0。與對照組相比，12 h的預(yù)培養(yǎng)能小幅提高毛白楊的轉(zhuǎn)化效率，但不宜超過12 h(表6)。

表6 預(yù)培養(yǎng)和共培養(yǎng)時間對毛白楊產(chǎn)生抗性芽的影響

在轉(zhuǎn)化過程中，侵染菌液濃度和侵染時間是影響轉(zhuǎn)化成功率的關(guān)鍵因素。侵染能力過強，容易導(dǎo)致菌液對葉盤造成不可逆?zhèn)?，?dǎo)致受侵染植株大量死亡；而侵染不足，又會影響植物轉(zhuǎn)化效率，無法獲得抗性植株。合適的侵染液濃度和侵染時間在既可以保證高轉(zhuǎn)化率、又能減少農(nóng)桿菌對植物體的損害方面顯得尤為重要。試驗結(jié)果顯示，毛白楊對菌液濃度以及侵染時間的變化非常敏感。當(dāng)菌液濃度[以600 nm波長吸光值(OD600)表示，下同]高于0.6時，葉片受侵害嚴(yán)重，無法正常生長；在菌液濃度低于0.2時，農(nóng)桿菌與葉片傷口接觸減少，轉(zhuǎn)化效率低，難以產(chǎn)生抗性芽。同樣，侵染時間對抗性芽的獲得率也有著一定影響。當(dāng)菌液濃度小于0.4時，抗性芽葉盤的獲得率與侵染時間呈現(xiàn)正相關(guān)。當(dāng)菌液濃度達(dá)到0.4時，隨著侵染時間的增長，抗性芽的獲得率先上升后下降。綜上所述，菌液濃度0.4，侵染20 min，為二倍體雄性毛白楊轉(zhuǎn)化效率最高的組合(表7)。

表7 侵染菌液濃度、侵染時間對毛白楊抗性芽的影響

避光條件下的共培養(yǎng)，可以促進(jìn)植物細(xì)胞脫分化產(chǎn)生愈傷組織，同時誘導(dǎo)農(nóng)桿菌攜帶的外源DNA整合到植物染色體上。試驗結(jié)果顯示，共培養(yǎng)時間為8 h時，農(nóng)桿菌中的外源DNA未完成轉(zhuǎn)移與整合，無法獲得抗性芽。共培養(yǎng)時間為16～24 h時，葉盤產(chǎn)生抗性芽，在時間為24 h時，抗性芽比例達(dá)到最高。其后，隨著共培養(yǎng)時間的繼續(xù)增加，葉盤生長受到農(nóng)桿菌抑制，抗性芽比例下降。當(dāng)共培養(yǎng)時間超過40 h，大量葉盤染菌死亡。綜上，篩選出的最佳共培養(yǎng)時間為24 h(表6)。

本研究通過遺傳轉(zhuǎn)化試驗，共獲得86株抗性植株(圖4)，并通過GUS染色和PCR的方法進(jìn)行分子鑒定，獲得14株陽性結(jié)果(圖5)。

卡那霉素(kanamycin, Kan)通過干擾植物細(xì)胞葉綠體及線粒體蛋白質(zhì)的合成，抑制植物細(xì)胞組織的生長發(fā)育，最終使植物細(xì)胞黃化死亡[22]。梯度試驗結(jié)果表明，隨著卡那霉素濃度的上升，毛白楊葉盤的分化能力逐漸降低，生長速度逐漸下降。在卡那霉素質(zhì)量濃度達(dá)到30 mg/L時，葉盤無法產(chǎn)生不定芽；在抗生素質(zhì)量濃度大于40 mg/L，葉盤無法生長，且短時間內(nèi)完全死亡(圖6)。

2.4 二倍體毛白楊瞬時表達(dá)體系

借鑒現(xiàn)有的原生質(zhì)體分離方法[23]，選擇生長時間在4～6周的毛白楊，切成葉條后酶解3～5 h，溶解細(xì)胞壁，直至酶解液呈現(xiàn)綠色，原生質(zhì)體完全釋放。鏡檢圖片顯示，制備的原生質(zhì)體呈現(xiàn)游離狀態(tài)，數(shù)量平均達(dá)到了1×106個/mL，且獲得的原生質(zhì)體大小一致，狀態(tài)良好，可以進(jìn)行后續(xù)瞬時表達(dá)試驗。

本研究將分離出的毛白楊原生質(zhì)體與p2GWF7質(zhì)?；靹颍谑覝叵路跤?5 h后檢測報告基因的瞬時表達(dá)情況。在Zeiss LSM 710激光共聚焦顯微鏡下，視野中出現(xiàn)同時包含EGFP綠色熒光信號以及紅色葉綠體自發(fā)熒光的毛白楊原生質(zhì)體。表明攜帶EGFP報告基因的質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入毛白楊的原生質(zhì)體，并在原生質(zhì)體中穩(wěn)定表達(dá)(圖7)

3 討 論

參考大多數(shù)木本植物的消毒策略，本試驗選用對植株傷害較小的酒精和次氯酸鈉作為毛白楊外植體消毒劑，用以替代傳統(tǒng)消毒劑氯化汞。外植體的消毒效果主要受到消毒劑和消毒時間的影響[24]。本研究不同消毒條件試驗組的外植體染菌率差距明顯，最低為44%，最高達(dá)92%。研究發(fā)現(xiàn)，酒精消毒時間不宜超過30 min，否則外植體死亡率明顯上升；次氯酸鈉最佳消毒時間為10 min，此時植株染菌率和致死率均相對較低。毛白楊嫩芽對消毒劑的敏感性較強，消毒劑極易造成外植體受損，導(dǎo)致死亡。此外，消毒過程中外植體植株出現(xiàn)較為嚴(yán)重的褐化，而褐化主要是由傷口破損處滲出的酚類物質(zhì)與培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)聚合產(chǎn)生[25]。后續(xù)試驗中，在培養(yǎng)基中添加適量硝酸銀和活性炭，褐化情況得到明顯緩解。值得注意的是，外植體材料自身攜帶的內(nèi)生真菌難以通過表面消毒的方式去除，導(dǎo)致部分批次外植體植株出現(xiàn)染菌情況。本試驗通過使用含有抗生素的無菌水浸泡沖洗和控制外植體采集時間的方法，有效降低了內(nèi)生真菌的影響[26]。

基于前期的篩選工作，本試驗選擇IBA、NAA、6-BA、TDZ 4種外源激素進(jìn)行二倍體毛白楊再生體系的構(gòu)建。在生根階段，外源激素的濃度對毛白楊植株生根率影響很大，最適激素條件下，生根率高達(dá)96.7%；隨著激素濃度的上升，植株生根率驟降。值得關(guān)注的是，IBA和NAA兩種激素對于二倍體毛白楊的生根均非常重要，僅保留1種激素進(jìn)行的對照試驗中，植株生根緩慢甚至無法生根。在不定芽增殖階段，適宜的激素配比使毛白楊增殖系數(shù)達(dá)到6.63，與李慧等[27]獲得的增殖系數(shù)相近(6.28)，略低于魯好君[16]的研究結(jié)果(7.98)。在芽伸長階段，植株對6-BA激素的濃度變化較為敏感，對NAA依賴性相對不高。借助構(gòu)建優(yōu)化的再生體系，毛白楊外植體頂芽僅需要70 d即可快速生長成為完整健壯的植株，大大縮短了無性系培育擴(kuò)繁的時間。在后續(xù)遺傳轉(zhuǎn)化階段，本研究構(gòu)建優(yōu)化的再生體系同樣表現(xiàn)出較高的增殖效率。

與其他毛白楊材料的研究結(jié)果不同，本研究發(fā)現(xiàn)預(yù)培養(yǎng)并不能顯著提高雄性二倍體毛白楊的轉(zhuǎn)化效率，預(yù)培養(yǎng)超過12 h，葉盤的分化能力明顯降低，與李春利[15]的篩選結(jié)果相似。在轉(zhuǎn)化階段，侵染菌液濃度和侵染的時間是影響轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵因素[8]?，F(xiàn)有研究中，毛白楊轉(zhuǎn)化體系的侵染條件和獲得的轉(zhuǎn)化效率差異較大。在本研究中，菌液濃度(OD600條件)下為0.4，侵染20 min時雄性二倍體毛白楊轉(zhuǎn)化效率最高，含有抗性芽葉盤的獲取比例為11%。通過在侵染過程中控制農(nóng)桿菌和葉盤的接觸，能夠有效減少農(nóng)桿菌爆發(fā)，同時降低頻繁洗菌對葉盤的傷害。毛白楊抗性篩選階段通常使用30～50 mg/L的工作濃度進(jìn)行一次或者梯度抗性篩選[6-7,15,28-29]?；诳股靥荻群Y選試驗的結(jié)果，本研究選擇30 mg/L的抗生素進(jìn)行一次抗性篩選，未成功轉(zhuǎn)化的葉盤迅速白化死亡。分子鑒定結(jié)果表明，獲得的86株抗性植株中有14株分子檢測為陽性，占比16.3%。假陽性比例偏高的現(xiàn)象在植物轉(zhuǎn)基因試驗中普遍存在。由于嵌合體芽的存在，一些植株沒有受到抗生素的影響，得以正常生長，是形成假陽性植株的因素之一。此外，較短的共培養(yǎng)時間和偏低的抗生素篩選濃度也會造成假陽性植株比例的偏高[16]。雄性二倍體毛白楊遺傳轉(zhuǎn)化較為困難，本試驗中酌情下調(diào)了抗生素的工作濃度，以期減少植株承受的篩選壓力。獲得的所有抗性植株都會通過分子檢測的方法進(jìn)行篩選驗證，排除假陽性的干擾，保證結(jié)果的可靠性。后續(xù)可通過提高抗生素工作濃度或選用其他高效抗生素進(jìn)行篩選，以達(dá)到更高的區(qū)分效率。

現(xiàn)階段毛白楊研究大多選擇擬南芥、煙草等異源原生質(zhì)體作為材料進(jìn)行瞬時表達(dá)，鮮有轉(zhuǎn)化至葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體的報道。本研究基于現(xiàn)有的楊屬植物原生質(zhì)體分離方法，制備了雄性二倍體毛白楊原生質(zhì)體，數(shù)量平均達(dá)到了1×106個/mL，略低于Tan等[30]以毛果楊為材料制備的葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體數(shù)量。研究驗證了在雄性二倍體毛白楊原生質(zhì)體同源轉(zhuǎn)化的可行性，并成功表達(dá)了報告蛋白，為后續(xù)基因功能的鑒定與研究提供了重要實驗平臺。

與現(xiàn)有的三倍體毛白楊體系相比，本研究在保證再生效率的前提下，有效縮短了無性系培育的時間，并在此基礎(chǔ)上成功進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化和原生質(zhì)體瞬時表達(dá)。相較于三倍體植株，二倍體植物材料只有兩套染色單體，在測序數(shù)據(jù)組裝和基因編輯靶點選擇等方面更具優(yōu)勢，有著廣闊的應(yīng)用前景和科研價值。楊樹是木本植物基礎(chǔ)研究和遺傳改良的模式植物，雄性二倍體毛白楊再生體系和遺傳轉(zhuǎn)化平臺的構(gòu)建，補充了毛白楊基礎(chǔ)理論研究資料，為分子輔助品種選育奠定了基礎(chǔ)，也為其他木本植物遺傳轉(zhuǎn)化研究提供了參考。